專利名稱：一種簡便快速測定人類i型胸苷激酶基因蛋白的乳癌預警芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種簡便快速測定I型胸苷激酶基因蛋白(hTKl)的乳癌預警芯片，采用基因 工程方法和分子免疫學技術(shù)等交叉科學技術(shù)研制，主要用于女性乳癌發(fā)生或發(fā)展的風險性預 警，同時,也可用于女性健康保護性提示和早期乳癌臨床診斷性的一種保健新法。
技術(shù)背景關(guān)于乳腺癌及其診斷技術(shù)背景乳腺癌是人類常見和多發(fā)的惡性腫瘤,是一種上皮來源的 惡性腫瘤,也是一種全身性的復雜疾病。早期最常見的臨床體征和表現(xiàn)主要包括乳房和腋窩的 無痛性腫塊、乳房形狀或大小改變、乳頭內(nèi)陷、乳頭溢液、乳房皮膚"酒窩樣"凹陷或表皮呈"桔皮樣"改變、乳頭周圍濕疹樣滲出等臨床體征，約有10%的患者可有不同程度的隱痛， 其發(fā)病年齡以40 60歲女性居多。它的發(fā)生發(fā)展是體內(nèi)多種因素共調(diào)控的結(jié)果，特別是與激 素變化和過于緊張的生活帶來的精神心理因素及婦女既往乳腺疾病史等是易患乳癌作用最強 的危險因素。而雌激素暴露時間延長,如少女月經(jīng)初潮提前，中年婦女絕經(jīng)延后，育齡婦女生育 哺乳時間的推遲或減少則增加乳癌發(fā)生風險。另外，西方的生活方式和絕經(jīng)后婦女長時間應(yīng) 用激素替代方法,飲食中脂肪及高蛋白質(zhì)攝入增加等均可引起雌激素水平提高，從而增加患乳 癌的危險性，且環(huán)境因素對乳癌發(fā)病的影響甚至超過遺傳因素的影響。乳腺疾病的發(fā)病率逐年上升，在美國，乳腺癌發(fā)病率占100人/10萬人,我國為20人/10萬 人,沿海地區(qū)高達30-40人/10萬人?；仡櫲橄侔┑脑\斷歷史，手觸式自査乳腺癌為其最初手 段，但這種方法陽性率低，目前臨床檢查已很少采信；70年代出現(xiàn)的X攝影檢查乳腺癌的方 法除同樣存在著陽性率低的問題外，副作用大是其致命缺陷；液晶式和熱像儀是利用人體熱量 原理診斷乳腺癌，因受室溫的影響，且不易保存，效果不能令醫(yī)生滿意；80年代初推出的冷光 源透照儀由于不能顯示和記錄圖像等缺點，而不便于早期確診斷乳腺癌;.80年代末90年代初 出現(xiàn)的紅外乳腺診斷儀是用紅外光透照乳腺組織，以觀察被血紅蛋白吸收的多少而在圖象中顯示出腫塊的不同灰度，血管影變化的原理檢測乳腺良惡性腫瘤，但因檢查只有在有腫瘤存在 的情形之下才能顯示，而一旦顯示乳癌已到晚期失去了早期治療的時機；90年代以后臨床上 陸續(xù)出現(xiàn)各種檢查乳癌的方法，如改進的X線鉬靶攝影、彩色B超、熱圖診斷、計算機體層 掃描、核磁共振、透照檢查、脫落細胞學診斷、腫瘤標志物檢査等對乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)確實 起到重大作用，但也存在不同方面和不同程度的不足。通過對乳癌診斷技術(shù)背景的描述,可從中發(fā)現(xiàn)乳癌現(xiàn)有早期診斷技術(shù)及儀器的相對不足， 歸納起來主要表現(xiàn)為①手觸式乳腺自我檢查影響因素很多，方法漏洞很大，自我評價很難，乳 癌早期診斷的陽性率很低即使是有經(jīng)驗的醫(yī)生,直徑〈lcm乳腺腫塊也很難被發(fā)現(xiàn)，易出現(xiàn)漏 診或誤診，無法實現(xiàn)真正意義上的乳癌早期診斷;②乳腺X線攝影法除存在陽性率較低外,其 放射污染和損傷等副作用是其嚴重缺陷,且早期診斷的準確率較低改進的X線鉬靶攝影診斷 的敏感性仍不夠高,尤其對一些致密型乳腺顯影欠佳;全視野數(shù)字化乳腺攝影機的復查率及活 檢率仍較低；干板攝影成像每次檢查仍使乳腺受線量過大，且影響圖像質(zhì)量易造成復檢;③液 晶式和熱像儀是利用人體熱量原理進行乳腺癌診斷,易受周圍環(huán)境及室溫影響，臨床誤差較大: 冷光源透照儀因不能顯示和記錄圖像等缺點，不便于乳癌早期確診斷； 超聲技術(shù)對<1. Ocm乳 腺腫塊診斷特異性差，無法做到全乳腺顯像，診斷準確性受操作者影響較大；且B超不能顯示 微小鈣化灶，對直徑〈0. 5cm病灶確診率僅44%,即使是改進后的多陣元超聲換能器技術(shù)、數(shù)字 超聲掃描轉(zhuǎn)換技術(shù)、超聲多普勒檢測技術(shù)、數(shù)字聲束成形技術(shù)等也很難實現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn);⑤纖維 乳管內(nèi)視鏡技術(shù)在形成癌病灶后才被發(fā)現(xiàn)，很難早期診斷；乳頭溢液涂片細胞學檢査陽性率較 低；計算機輔助三維立體定位和導絲引導切除活檢技術(shù)因該設(shè)備昂貴，技術(shù)要求甚高,很難普 及應(yīng)用；細針穿刺抽吸細胞學檢查因穿刺不準易漏診而延誤病情，有時仍需追加組織學活檢證 實其結(jié)論，且很難區(qū)分浸潤性癌與原位癌，對某些細胞形態(tài)異常但尚未達到癌標準病灶，無法 作出明確診斷;⑥CT設(shè)備昂貴,且掃描費用較高,X線量較大,不便作為常規(guī)檢査方法;乳腺核 磁共振檢查空間分辨率低,腫物細節(jié)不如X線攝影清晰,不能顯示微小鈣化，只有增強掃描有 助于提高診斷和鑒別診斷的準確性，加上價格昂貴，僅能作為輔助檢查方法。PET-CT價格昂貴 得驚人,且操作繁瑣,機制復雜，結(jié)果判斷必須有經(jīng)驗的?？漆t(yī)生,檢測只能在超大型綜合醫(yī)院才能進行, 一般醫(yī)院和衛(wèi)生機構(gòu)根本無法應(yīng)用；⑦現(xiàn)有些腫瘤標志物或腫瘤相關(guān)物質(zhì)及基因蛋 白等在作為乳癌篩查時也存在不同程度的問題和疑點，如癌胚抗原(CEA)并非乳癌早期診斷的 特異性標志物:乳癌相關(guān)抗原225的陽性率，III期乳癌僅為8-22%，早期診斷價值不大;CA15-3 對乳腺癌的陽性率I期僅為0-25%, II期也只有8-42%,且20-30%轉(zhuǎn)移性乳腺癌并不升高，故不 能單獨作為監(jiān)測乳癌的指標:CA27-29在某些良性腫瘤或生理情況下(如孕前3個月)也升高， 因此檢測很難確診，早期診斷也很難實現(xiàn)。NCC-ST-439陽性除見于乳腺癌外,胰腺癌、肝癌、 膽管癌、大腸癌、肺癌、宮頸癌等也可能呈陽性,且胰腺炎、慢性肝炎、閉經(jīng)前也可升高,其 在乳腺癌的陽性率為I、 n期僅為25-30%, III、 IV期也只有40-42%,且復發(fā)病例為55%,特異性 較低;組織多肽特異性抗原(TPA)多出現(xiàn)在癌轉(zhuǎn)移之后,在乳腺癌早期診斷方面有一定局限性。 乳癌p53基因突變表達的陽性率僅為20-60%,特別是目前對于p53的預后價值還存在爭議;尿 激酶型纖溶酶原激活物(uPA)主要是判斷乳腺癌預后的指標，而對乳腺癌早期診斷價值有限； 組織蛋白酶D是乳腺癌轉(zhuǎn)移的標志之一，其升高多提示乳腺癌患者預后差,亦為復發(fā)的先兆， 也是乳腺癌預后因素,而在乳腺癌的早期診斷方面，其價值仍然有限。端粒酶在其它惡性腫瘤 均有陽性表達,沒有明顯特異性?？傊壳鞍l(fā)現(xiàn)的乳腺癌相關(guān)腫瘤標志物中的任何一種單獨 應(yīng)用敏感性均較低，I、 11期陽性率均<30%，早期患者易漏檢。⑧直接DNA序列測定,變性梯度 凝膠電泳法,異源雙鏈分析，熒光標記的錯配分析以及蛋白截斷分析，實時熒光PCR技術(shù)等，單 鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，多重異源雙鏈分析及測序和熒光雙鏈探針法等大多被專利保護，且因有些 方法技術(shù)難度大，設(shè)備要求高,操作步驟煩瑣，特異性差，費用昂貴，容易污染造成假陽性的特 點，一般醫(yī)院實驗室很難應(yīng)用，也不適用于大規(guī)模的篩查。⑨在癌癥預警儀器研制方面，雖有 腕式癌癥預警儀、掌上型癌細胞檢測儀、乳房腫瘤檢測儀、雙波長組織血氧檢測技術(shù)(簡稱 TBO)—乳腺腫瘤檢測儀、電腦紅外乳腺檢測儀等，但陽性檢出率、早期診斷率、特異性、購 買價格等均不盡人意。⑩TSGF腫瘤相關(guān)物質(zhì)聯(lián)合檢測試劑盒(原名惡性腫瘤特異性生長因子 快速檢測試劑盒)能聯(lián)合檢測幾種相關(guān)的腫瘤標志物以提高腫瘤檢測靈敏度，但各種標志物 測定的步驟、方法不同，測定儀器復雜，操作繁瑣、品種繁多、費時費事，費用昂貴。關(guān)于hTKl及其檢測技術(shù)背景人胸腺嘧啶脫氧核苷激酶I型，中文簡稱胸苷激酶I型(Human thymidine kinase, hTKl)是與細胞增殖、分化和細胞周期密切相關(guān)的激酶，被認為 是合成DNA的關(guān)鍵酶，其主要有兩種同工酶，hTKl和hTK2。hTKl主要存在于細胞質(zhì)中，而hTK2 則主要存在于亞細胞結(jié)構(gòu)的線粒體中。而其中與細胞增殖關(guān)系最為密切相關(guān)的是hTKl。正是 由于hTKl與細胞分裂密切相關(guān),在細胞分裂Gl期含量較低，到S期后逐漸升高,至G2期達到 最高，因此，編碼hTKl的m脂A及其所表達的蛋白質(zhì)也就成為細胞增生的標志物。hTKl作為一種激酶是胸苷參與DNA合成的關(guān)鍵酶，它能可逆性催化胸腺嘧啶脫氧核苷與 磷酸脫氧核苷之間的轉(zhuǎn)化，它能真實而客觀地反映著細胞的增殖狀況。已有文獻表明，TK1 的活性在腫瘤細胞大于總量的95%，而TK2低于5%，在正常健康人的血清中檢測很低或不可 以檢測，因此采用檢測血清TK活性將評估腫瘤增殖的惡性程度。hTKl在細胞異常增生時含 量或活性增高，特別是在細胞增生旺盛的早期惡性腫瘤患者的體液或血液中更是顯著增高， 且hTKl水平的高低與惡性腫瘤的切除和復發(fā)呈降低和升高的趨勢。有學者增采用12種人癌 組織進行免疫組化分析,發(fā)現(xiàn)TK1均呈現(xiàn)陽性結(jié)果，這初步證明了癌癥患者與TK1活力或含量 增高有關(guān)，且進一步試驗也證明，隨著腫瘤細胞增殖速度明顯提高，TK1活力增強,DNA合成速 度加快,從而促進了腫瘤細胞的進一步增殖,形成一個病情不斷加重的惡性循環(huán)。因此，國外 有學者依據(jù)正常人的TK1水平是極微量低或幾乎不可能檢測、而惡性腫瘤患者異常增高的實 驗多次提出，采用血清TK1活性檢測方法和TK1抗體免疫檢測方法適合用于人群普查，用于 早期腫瘤預檢測。大量臨床試驗證實，hTKl不僅可以作為惡性腫瘤的一種標志物，而且還可 以通過檢測hTKl的水平，判斷惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展規(guī)律、或療效、轉(zhuǎn)歸及預后的判斷。美 國有一專利就專門介紹過TK1的抗癌活性。不僅如此，國內(nèi)外一些權(quán)威雜志和著名專家學者 及本發(fā)明專利的申報者們在最近五年的專題科學研究中還驚喜地發(fā)現(xiàn)，在常見的一些惡性腫 瘤中，hTKl含量或活性的變化與乳腺癌和肝癌密切相關(guān)，即hTKl在乳腺癌和肝癌中的表達最 多，表現(xiàn)也更為明顯，而且研究還發(fā)現(xiàn)，當乳腺癌或肝癌細胞數(shù)量有限的早期，其癌變組織、甚 至是血液之中同樣存在有hTKl基因蛋白的表達和含量的改變。正常人細胞中hTKl的含量極低,只是在細胞過度異常增生的情況下才會出現(xiàn)高的水平。有學者的研究結(jié)果表明，乳腺癌患者血清中hTKl水平明顯高于乳腺良性腫瘤患者,且明顯高于健康對照人群，而乳腺良性腫瘤患者血清中的hTKl水平與體檢健康者無明顯差別(P>0.05)。還有學者從1692個乳腺癌病人組織中提取細胞的細胞質(zhì)組分,TK1的活性檢測顯示，高TK1活性與腫瘤增殖度密切相關(guān)，且高TK1活性預示內(nèi)分泌藥物治療患者預后差和生存時間短；而胞增殖低的乳頭狀突甲狀腺瘤組織細胞中TK1活性與正常組織比較,僅升高2-4倍。本發(fā)明者曾采用免疫傳感器方法研究過目前常見八種惡性腫瘤血清中hTKl的活性和含量，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者hTKl水平較其他惡性腫瘤明顯增高。還有研究表明，乳腺癌血清TK1的半衰期為30天左右。關(guān)于乳腺癌患者血清中hTKl的來源，有學者分析，這很可能是腫瘤細胞分泌或腫瘤細胞異常增殖導致溶解釋放胸苷激酶的聚合體。而對于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，手術(shù)后血清中hTKl水平呈明顯下降的趨勢。乳腺癌全切除手術(shù)后未轉(zhuǎn)移的患者血清中hTKl水平在手術(shù)后一個月下降到50%,手術(shù)后3個月(90天)將下降至正常人的水平。因此，血清中hTKl水平不僅可以作為乳腺癌診斷的一個敏感性指標,而且也有利于乳腺癌的療效觀察。為此,將hTKl作為女性早期乳腺癌診斷的預警指標具有一定的理論和實驗依據(jù)，在臨床普查和早期診斷方面也具有積極的意義。在過去的臨床和科研工作中，用于檢測或監(jiān)測hTKl含量或活性的方法主要有放射免疫法(RIA)、酶聯(lián)免疫法、化學發(fā)光法、免疫組化法、western blotting法、點免疫印跡化學發(fā)光法、ELISA法、免疫增強化學發(fā)光法、壓電石英晶片免疫傳感器法等。雖然，目前這些實驗室的檢測方法均能較為準確的測定出癌變組織或體液及血液(血清或血漿)中hTKl的含量或活性,但過去主要采用的放射免疫法(RlA)檢測血清hTKl的酶活性，即可以通過放射性同位素標記的3H胸苷的方法檢測血清中總量TK活性來表示血清TK1 (簡稱STK1)的活性，但這方法的靈敏度不高,不適應(yīng)于臨床血清中TK1的檢測；以后又發(fā)展了胸苷類似物-'251-5-碘-2-脫氧尿苷作為底物，建立一種靈敏度較高的血清TK1(STK)放射性同位素檢測方法,應(yīng)用于人血清學腫瘤細胞增殖標記物檢測。其方法簡述如下:加入20微升血清樣品到清潔微量管中，同時分別加入含有20微升含有40、 10、 5和2.5 U/L的TK-REA標準到一清潔微量管。每管補加500微升由試劑供應(yīng)商提供的放射性同位素1251_5-碘-2-脫氧尿苷底物,于37度反應(yīng)4小時反應(yīng)完成以后，為了使反應(yīng)產(chǎn)物與過度底物分離，還要加入固相分離片劑吸附產(chǎn)物，震搖反應(yīng)15分鐘，再用試劑供應(yīng)商提供的洗滌溶液4次，這含有反應(yīng)產(chǎn)物片劑沉淀送入Y -閃爍儀計數(shù)TK的活性。按照標準比較，，酶活性大于正常健康人標準閾(2.4U/L)為TK1活性異常值，由此可見,采用'251標記脫氧尿嘧啶不僅半衰期短(僅在4周時間)，且具有放射性污染，久而久之容易造成對檢測者健康損傷和環(huán)境污染，而且胸苷類似物-1251-5-碘-2-脫氧尿苷并非是TK1活性分析的專一性底物，并且在血清TK的活性測定中，對pH和溫度非常敏感，常產(chǎn)生不準確結(jié)果，且需要使用貴重的檢測儀器(Y閃爍儀)，這種檢測需要特別的設(shè)備和熟練技術(shù)人員操作，因此,該檢測技術(shù)在臨床應(yīng)用上有很大的局P艮性，也很難在臨床上廣泛推廣使用。后來,又有學者采用酶法和夾心ELISA方法作血清學TK1鑒定，沒有發(fā)現(xiàn)健康人血清TK1和癌癥患者血清TK1之間有顯著性差異，認為是夾心ELISA方法不靈敏所致。以后國外有報道，應(yīng)用WesternBlotting檢測血清中hTKl的含量或活性，且能進行定量分析，在對腫瘤細胞的評估方面遠遠優(yōu)于胸腺嘧啶摻入法，因為胸苷激酶1測定直接代表該腫瘤中的胸苷激酶1量而不受體外檢測條件的干擾，也免除了影響外源性胸腺嘧啶摻入DNA內(nèi)的影響，但在臨床應(yīng)用并不適用；點免疫印跡發(fā)光法雖然利用了發(fā)光技術(shù)的高靈敏性,并通過X線片曝光，避免了使用發(fā)光檢測儀,且可長期保存實驗結(jié)果，但需通過設(shè)立標準品對照，并根據(jù)斑點的深淺進行定量分析，但因這些方法操作繁瑣，也難以在臨床上普及應(yīng)用。而增強發(fā)光-免疫點印跡法主要參考印跡法原理，其具體方法是取空腹受檢者血樣，靜置l小時以上,然后，置于離心機中，以4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心8-IO分鐘，分離血清。將3微升的血清樣品精確點樣到硝酸纖維素膜上，同時，用不同濃度人重組TK1 (rhTKl 40. 5、 13. 5、4. 5和1. 5 pM)做標準品點樣。風干30分鐘,用TBS pH7. 5(20mmol/L Tris, 0. 15 mol/L NaCl)震搖洗滌3次(10分鐘/2次，5分鐘/1次)。加入用TBS緩沖液配置的10%脫脂奶粉，室溫封鎖2/4小時，除去封鎖試劑，加入用TBS配置的最佳稀釋濃度的TK1抗體，免疫反應(yīng)2小時或于冰箱過夜。反應(yīng)完成后，用TBST(TBST加入0. 1%吐溫20)迅速漂洗2次，震搖洗滌3次(10分鐘/2次,5分鐘/1次)。再加生物素化第二抗體(按最佳濃度稀釋)，室溫下震搖反應(yīng)40分鐘。反應(yīng)完成以后，同上方法洗滌以后，加入親和素-辣根過氧化物酶。同上方法洗滌以后，用ECL發(fā)光試劑精確反應(yīng)1分鐘,甩干后，該膜密封于薄膜袋，放入CCD檢測儀器,這發(fā)光信號的強弱將通過CCD成像系統(tǒng)分析儀捕獲信號和掃描定量分析,或?qū)⒛し湃氲灼瑠A內(nèi)與X光膠片夾緊，在暗室內(nèi)感光2 5分鐘后,立即顯影、定影,用蛋白印跡圖譜分析儀,分析印染在底片上的信號。并按照rhTKl的標準曲線計算這供試者的TK1值的pM濃度。按照標準比較，當TK1的濃度大于正常健康人標準閾值(2.0pM )為異常值。采用這標準曲線，雖方便計算治療中癌癥患者的TK1的水平變化，與對應(yīng)于患者的腫瘤細胞的增殖速度的關(guān)系，且采用抗體免疫結(jié)合的檢測方法可達到足夠低的檢測量，特別是可檢測不同個體健康人TK1的水平的差異，最低檢測量可達到0. 3 pM以下,但我們不難看出，該方法操作是多么復雜和繁瑣，不僅需時長,需要有特異好和靈敏度高的抗TK1抗體作為探測血清或者組織中微量的TK1分子的探針，而且需要大量貴重的儀器設(shè)備和經(jīng)驗豐富的專業(yè)操作人員，不僅無法在基層醫(yī)療單位普及應(yīng)用，在大型綜合性醫(yī)院也很難臨床應(yīng)用。即使是本發(fā)明專利申請者不久前研究成功的壓電石英晶片免疫傳感器法具有較上述方法更多的優(yōu)勢，但也存在著檢測時間較長(40-60分鐘)、檢測難度較大、特別是每次只能測定一個樣品，無法同時批量測定樣品等，這在臨床上應(yīng)用幾乎非常困難。特別是上述所有檢測TK1的方法，基本上都需要較為昂貴和特殊的儀器設(shè)備及配套試劑，加上操作過程繁瑣，檢測時間較長，技術(shù)要求高,需要一定儀器等，無法在基層醫(yī)療單位或家庭普及應(yīng)用。但是,如果有特異性強、親和力好和靈敏度高的兩種TK1抗體，免疫夾心法仍是很有前途的方法,這也是本發(fā)明采用揚長避短的依據(jù)之一。綜上所述，上述任何一種乳腺癌的單一診斷方法和檢測技術(shù)所得到的診斷或檢測結(jié)果均難免出現(xiàn)片面性結(jié)果(假陰性或假陽性)，甚至可能出現(xiàn)與臨床不相符的差錯結(jié)果，即使采用臨床和實驗數(shù)種方法聯(lián)合應(yīng)用，相互補充和印證，使所得診斷或檢測結(jié)果較為正確可靠并有參考價值,但一旦這種診斷結(jié)果為陽性，已基本上已出現(xiàn)乳腺癌的占位性病灶，實際上也非實質(zhì)上的早期診斷，而給以后的治療或愈后帶來挑戰(zhàn)。現(xiàn)代腫瘤學研究表明，乳腺癌從初起中一個癌細胞的分裂增殖，到發(fā)展成臨床能檢出的直徑約1 cm的小腫塊，約需30次倍增，其生長期至少己逾3年,給癌癥轉(zhuǎn)移提供了足夠的時間，所以，即使在臨床上確認的I期乳腺癌，當其腫瘤直徑〉1 cm時，就有可能發(fā)生全身的亞臨床轉(zhuǎn)移；而II期病例中包括了有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的，即使腋淋巴結(jié)陰性者，原發(fā)腫瘤直徑己超過2cm的亞臨床轉(zhuǎn)移可高達25%-30%。所以，從組織病理學角度看，I, II期病人中己有相當部分并不是早期。即使是采用目前一些最為現(xiàn)代先進的診斷方法和檢測技術(shù)，可以給臨床乳腺癌的早期診 斷提供一定依據(jù)，但因這些診斷方法和檢測技術(shù)需要特殊條件，需要在一些大型綜合性醫(yī)院才 能進行,而且，這些診斷方法和檢測技術(shù)，大多檢測試劑專業(yè),測定方法復雜，檢測儀器繁多， 操作步驟繁瑣，實驗室要求特殊，且費時費事費力，測定費用昂貴，使很多人、特別是一些高 危人群很難經(jīng)常和及時去醫(yī)院進行檢查或普查，因而，錯過了許多對乳腺癌早期診斷，早期發(fā) 現(xiàn)的大好時機，以至于造成終身的遺憾和痛苦。由此可見，發(fā)明一種更加科學、先進、創(chuàng)新、實用、且具有靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定 性好、準確度高、使用快捷、操作簡便、來源方便、價廉物美、容易普及、易于隨時檢查、 推廣應(yīng)用的乳腺癌檢查、自查或普査方法，對于真正意義上的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治 療乳癌、或者爭取獲得最佳的治療時機、尋找最佳的治療方案、達到最佳的治療效果，以減 少患者痛苦、延長患者生命、提高患者生存質(zhì)量等具有特別重要的臨床價值和實際意義。特別是通過建立這種簡便、快速、易學易會、易于自査或普查或定期經(jīng)常性的乳腺癌檢 查手段，致力于建立一個完善的乳腺癌篩查體系，致力于建立更加規(guī)范篩查乳癌、著眼早期 診斷的科學意識，進而，不斷提高全民規(guī)范化的主動檢查或自查意識，并充分認識到通過經(jīng) 常性的篩查，早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷乳癌是何等重要；同時，還應(yīng)該具有根據(jù)自身風險接受相 應(yīng)篩查并發(fā)現(xiàn)可疑征象及時就醫(yī)的意識。也只有這樣，才能真正有效地減少由于輕視或不懂 專業(yè)和不規(guī)范而造成的高危人群的失診、漏診、誤診。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對背景技術(shù)中存在的缺點和問題加以改進、創(chuàng)新，提供一種簡便快速 測定人類I型胸苷激酶基因蛋白的乳癌預警芯片。本發(fā)明的技術(shù)方案是所述的乳癌預警芯片是由一端包被真核表達制備的一抗hTKl單克隆抗體(代號為2A6-McAb)和另一端則包被兔抗鼠IgG多克隆抗體的條狀纖維層析固相載體NC膜、濾樣紙、吸水玻璃纖維紙、及標記有膠體金和二抗hTKl單克隆抗體(代號為犯8-McAb)結(jié)合物的聚酯膜片等依此粘貼于白色PVC塑料片所組成。本發(fā)明的簡便快速測定人類I型胸苷激酶基因蛋白的乳癌預警芯片的制備方法包括以下步驟一、 制備含有抗hTKl單克隆抗體2Ae和兔抗鼠IgG多克隆抗體的硝酸纖維微孔濾膜片1) 將抗hTKl單克隆抗體2Ae和兔抗鼠IgG多克隆抗體分別用10-20mmol/L, PH7. 2-7. 4 的磷酸鹽(PBS)緩沖液稀釋成0. 8-1. 6g/L;2) 用包被機將它們分別包被于硝酸纖維微孔濾膜上；3) 將包被有hTKl單克隆抗體2A6和兔抗鼠IgG多克隆抗體的硝酸纖維微孔濾膜上置于 10-20mmol/L, pH7. 2-7. 4的磷酸鹽(PBS)緩沖液(1-2% BSA)中，37。C恒溫浸泡60min;4) 再用10-20mmol/L, pH7. 2-7. 4的磷酸鹽(PBS)緩沖液洗滌，置于室溫或真空干燥后備用；二、 進行hTKl基因蛋白乳癌預警芯片的組裝以正條中點的加樣孔3為起點標志,左邊和右邊分別用熱龍膠依次將濾樣紙、吸水玻璃纖 維紙、聚酯膜片(膠體金-hTKl單克隆抗體3Es結(jié)合物)、包被有抗hTKl單克隆抗體2Ae和兔抗 鼠IgG多克隆抗體的硝酸纖維微孔濾膜和吸水濾紙粘貼于白色的PVC塑料片上，并在此膜片上 覆蓋一層有效的保護膜；完成貼膜后即可進行真空干燥；最后,將全部貼好的條板在專用切割 機上切成一定規(guī)格的條狀膜片，裝入塑料盒中，加入干燥劑密封保存，即成乳癌基因蛋白預警 芯片4。本發(fā)明的基本原理是一種將基因工程技術(shù)、膠體金標記顯色技術(shù)、特異性免疫檢測技 術(shù)和紙層析分析技術(shù)等多種方法有機結(jié)合在一起的固相標記及雙抗體夾心免疫層析檢測技 術(shù)。本發(fā)明制備的基因蛋白芯片應(yīng)用的免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤或顯色的標志物 應(yīng)用于檢測新的乳癌標志物人胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(hTKl)抗原的一種新型的免疫標記技 術(shù)。其基本原理是膠體金由氯金酸(HAuCl4)在還原劑檸檬酸三鈉(枸櫞酸三鈉)作用下，聚 合成為特定而均勻大小的金顆粒，因其靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)即膠體金狀態(tài)。膠體 金在弱堿環(huán)境下帶負電荷,可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團形成牢固的結(jié)合,而這種結(jié)合是靜電 結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。人胸腺嘧啶脫氧核苷激酶單克隆抗體(hTKl McAb)其化 學本質(zhì)也是蛋白質(zhì)(免疫球蛋白IgG)，因此，它完全具備與膠體金靜電結(jié)合并不影響該抗體活性的生物特性。而且,膠體金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結(jié)合處,在顯微鏡下可見 黑褐色顆粒，當這些膠體金標記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時，肉眼則可見紅色或粉紅色斑 點。運用膠體金本身具有顯色反應(yīng)的這種特點，即可通過目測標記物膠體金的顯色反應(yīng),清晰、 直觀而準確地判斷出檢測標本中是否含有乳癌標志物人胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(hTKl)抗原的實驗結(jié)果。因而,本發(fā)明可作為早期乳腺癌的定性或半定量的簡便快速免疫檢測方法。本發(fā)明的技術(shù)原理是以條狀纖維層析材料-5um孔徑、液體移動速度為45-50秒遷移 lcm的硝酸纖維微孔濾膜(NC)和玻璃纖維作為固相載體，將其中一個特異性單克隆抗體(一抗 代號為2A6)-人胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(hTKl)單克隆抗體(McAb)固定在硝酸纖維微孔濾膜(NC) 的適當位置；而另一個特異性單克隆抗體(二抗代號為3E8)-人胸腺嘧啶脫氧核苷激酶單克隆 抗體(hTKl McAb)則標記在均勻的納米級膠體金顆粒上(粒徑20-25nm)并固定在特定的聚酯膜 上。在實際進行檢測時，由于紙層析過程中的自然毛細作用，使被檢測標本-血液或血清或血漿 沿著此條狀纖維層析材料-硝酸纖維微孔濾膜(NC)、聚酯膜和玻璃纖維向前進行性自然移動； 此時，如果檢測標本-血液或血清或血漿中含有相對應(yīng)的待測物-hTKl抗原，則此hTKl抗原在 移動到一定的位置,便與此條狀纖維層析材料-硝酸纖維微孔濾膜(NC)和、聚酯膜上針對此待 測物hTKl抗原的相應(yīng)單克隆抗體-hTKl McAb即發(fā)生高特異性、高親和性的免疫結(jié)合反應(yīng)。 由于此特異性免疫層析過程中的抗原抗體結(jié)合的免疫復合物被不斷地富集或截留在此條狀纖 維層析材料的某一區(qū)域、并自然形成了一條有色檢測帶(即陽性結(jié)果)。但是,如果檢測標本-血液或血清或血漿中未含有相對應(yīng)的待測物-hTKl抗原，則此檢測標本-血液或血清或血漿移 動到任何位置，都不會與此條狀纖維層析材料-硝酸纖維微孔濾膜(NC)和、聚酯膜上針對此待 測物hTKl抗原的相應(yīng)單克隆抗體-hTKl McAb發(fā)生高特異性、高親和性的免疫結(jié)合反應(yīng)。也 正是由于檢測標本在層析過程中無此特異性的抗原抗體免疫復合物形成， 一些游離的標記物 則越過此條狀纖維層析材料的檢測帶，與結(jié)合標記物自動分離，不出現(xiàn)任何顏色反應(yīng)，即在硝 酸纖維微孔濾膜的某一區(qū)域,不會形成一條有色檢測帶(即陰性結(jié)果)。 本發(fā)明的主要技術(shù)構(gòu)思本發(fā)明技術(shù)構(gòu)思分為三個部分:第一部分:高特異性和高親和力的hTKl單克隆抗體制備。主要完成:①采用基因工程技術(shù)及分子生物學和分子免疫學技術(shù)，將與乳癌密切相關(guān)的基因-1 型人胸腺嘧啶脫氧核苷激酶，亦簡稱為I型胸苷激酶(human thymidine kinase I，簡稱hTKl) 基因進行克隆;②利用真核分泌型載體重組該hTKl基因；③采用基因天然免疫的方法制備高 特異性和高親和力的hTKl單克隆抗體。第二部分:膠體金的制備及標記。主要完成:①膠體金 的制備:首先采用檸檬酸三鈉還原法進行膠體金的制備；②膠體金-抗hTKl單克隆抗體結(jié)合物 的制備:采用小牛血清白蛋白(BSA)法將另一個特異性單克隆抗體(代號為3E8)-人胸腺嘧啶脫 氧核苷激酶單克隆抗體(hTKl McAb)標記在均勻的納米級膠體金顆粒上(粒徑20-25nm);③制 備含有膠體金-hTKl單克隆抗體3E8結(jié)合物的聚酯膜片。第三部分I型胸苷激酶(hTKl)基因 蛋白乳癌預警芯片制備。主要完成:①制備含有抗hTKl單克隆抗體2&和兔抗鼠IgG多克隆抗 體的硝酸纖維微孔濾膜片;②進行乳癌基因蛋白預警芯片的組裝。 本發(fā)明技術(shù)方案的主要思路第一部分hTKl單克隆抗體制備首先用Trizol試劑(一種從動物細胞和組織、細菌、真菌 等提取總RNA的試劑盒)從500萬個Hela細胞(海拉細胞是一種人宮頸癌傳代細胞)提取經(jīng)氨甲喋 呤處理48小時的細胞總核糖核酸(RNA),純化后用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解沉淀所得液體 30W。該液體經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄PCR(在體外由酶促反應(yīng)合成特異DNA片段的一種方法)可擴增出hTKl cDNA (cDNA是指以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成的互補DNA);在TA克隆(即利用Taq 聚合酶同時具有的末端連接酶的功能,在每條PCR擴增產(chǎn)物的3'端自動添加一個3' -A突出端) 后即可進行DNA序列分析，以鑒定經(jīng)過PCR擴增后所形成的hTKl基因序列是否正確；然后，通過亞 克隆接入pSecTag2/Hygro B載體(真核分泌型載體)的HindIII (酶切位點)和Xhol (酶切位點)位點 之間(pSecTag/TKl),插入片段表達的蛋白質(zhì)可以從真核細胞中分泌到胞外。直接用pSecTag/TKl 重組質(zhì)粒脫氧核糖核酸(DNA)免疫小鼠；再用骨髓瘤細胞和脾細胞融合制備雜交瘤；從制備出的多 株雜交瘤細胞株中進行篩選、配對，最后篩選出兩株親和力較高、且能產(chǎn)生抗TK1單克隆抗體的雜 交瘤細胞株(命名為DZ1和DZ2):將所選出的這兩株親和力較髙、且能產(chǎn)生抗hTKl單克隆抗體的 雜交瘤細胞株DZ1和DZ2,分別按照數(shù)量為5X105個雜交瘤細胞分別直接注入兩組小鼠腹腔內(nèi)制備 含有hTKl特異性單克隆抗體的腹水；待這些受試小鼠腹腔內(nèi)的腹水達到一定程度后，即可分別用注射針頭抽出這兩株雜交瘤細胞所產(chǎn)生的親和力高和特異性強的兩種抗TK1單克隆抗體的小鼠腹 水；將收集的這些小鼠腹水用冷凍高速離心機以大于10000rpm/min以上的速度離心5-10分鐘， 棄除沉淀,其上清采用正辛酸一硫酸胺法分別進行提取，并用蛋白G柱親和層析純化,可得到經(jīng)過 純化的兩種TK1的單克隆抗體(DZ1、 DZ2雜交瘤所分泌的單克隆抗體分別是hTKl單克隆抗體2A6 和hTKl單克隆抗體3E8);純化后的這兩種hTKl單克隆抗體分別用蛋白定量試劑(BCA)定量抗體， 最后，經(jīng)過十二烷基磺酸鈉(SDS)-PAGE(聚丙烯酰胺)凝膠電泳法檢測其抗體純度；同時，進行抗體 的IgG類型，亞類鑒定，以及抗體的結(jié)合位點和親和力測定等;之后，置于低溫冰箱中保存，即可備 為后續(xù)應(yīng)用。第二部分首先將用純蒸餾水配制一定濃度的氯金酸應(yīng)用液100ml,用電爐加熱至沸騰后， 迅速加入一定濃度的檸檬酸三鈉(枸櫞酸三鈉)應(yīng)用液2ml，繼續(xù)加熱煮沸10min后，經(jīng)過還原 反應(yīng)后，使其逐步冷卻后，即可形成接近紅色的膠體金應(yīng)用液。然后，利用自動分光光度計對此 膠體金應(yīng)用液在可見光范圍(400-600ntti)內(nèi)進行自動掃描，分析所制備的膠體金顆粒是否均 勻。在波長為520-521 nm處時，該膠體金應(yīng)用液可有最大吸收峰，且主峰寬度較窄，這證實所 制備的膠體金顆粒完全均勻，粒度在20-25 nm。在確定完成氯金酸還原成顆粒大小合適且大 小分布均勻的膠體金應(yīng)用液后，即可采用此膠體金應(yīng)用液進行人胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(hTKl) 單克隆抗體(McAb)的標記，即膠體金-hTKl單克隆抗體結(jié)合物的制備。在進行膠體金-hTKl單 克隆抗體結(jié)合物的制備時，應(yīng)先將hTKl單克隆抗體3Es濃度調(diào)節(jié)到合適的水平(800-1600 ii g/mL);然后，取劑量為100 mL的膠體金溶液,并用濃度為0. Imol/mL的碳酸鉀(K2C03)將膠體金 應(yīng)用液調(diào)至略高于hTKl單克隆抗體等電點的PH 8. 2-9. O;此時,在不斷快速攪拌中，緩慢加入 lmL己調(diào)節(jié)到濃度為800-1600n g/mL的hTKl單克隆抗體3E8，則其標記蛋白量為每毫升膠體 金應(yīng)用液中含8-16 u g hTKl單克隆抗體3E8。在繼續(xù)攪拌15min后，加入100-200mg的小牛血 清(BSA);再經(jīng)過10-20min攪拌后，置于冷凍離心機中低速離心(1000-1500rPm/min ) 10-20min。小心地棄除沉淀；取其上清液再進行高速離心(10000-15000rpm/min) 20-30min 后，再小心吸去上清液,保留沉淀,此艮卩為膠體金一抗hTKl單克隆抗體3Es結(jié)合物。緊接著，即 可制備含有膠體金-hTKl單克隆抗體3Es結(jié)合物的聚酯膜片。首先，可采用合適濃度的16Tris-HCl緩沖液(1-2%BSA, pH8. 2)將上述已沉淀好的膠體金-hTKl單克隆抗體犯8結(jié)合物進行 稀釋至，并將其均勻分布在一定面積的聚酯膜片上，固定并進行真空干燥，即可得到含有膠體 金-hTKl單克隆抗體3Es結(jié)合物的干燥聚酯膜片。第三部分I型胸苷激酶基因蛋白乳癌預警芯片制備。主要完成:①制備含有抗hTKl單 克隆抗體2Ae和兔抗鼠IgG多克隆抗體的硝酸纖維微孔濾膜片;②進行hTKl基因蛋白乳癌預警 芯片的組裝。首先，制備含有抗hTKl單克隆抗體2Ae和兔抗鼠IgG多克隆抗體的硝酸纖維微孔 濾膜片(NC)，即將抗hTKl單克隆抗體2A6和兔抗鼠IgG多克隆抗體分別用 10-20誦ol/L， pH7. 2-7. 4的磷酸鹽(PBS)緩沖液稀釋成0. 8-1. 6g/L,在做好記號后，用包被機 將它們分別包被于硝酸纖維微孔濾膜的適當位置上;緊接著將包被有hTKl單克隆抗體2&和 兔抗鼠IgG多克隆抗體的硝酸纖維微孔濾膜上置于10-20國ol/L, pH7. 2-7. 4的磷酸鹽(PBS) 緩沖液(l-2。/。BSA)中，37。C恒溫浸泡60min;最后，再用10-20mmol/L, pH7. 2-7. 4的磷酸鹽(PBS) 緩沖液洗滌1-2次；隨后取出，盡可能吸干水分，置于室溫或真空干燥備用。在完成包被含有 hTKl單克隆抗體2Ae和兔抗鼠IgG多克隆抗體的硝酸纖維微孔濾膜后，即可進行hTKl基因蛋 白乳癌預警芯片組裝:正式進行芯片組裝前,必須先進行膜片的預處理,然后,再進行粘貼復膜: 以正條中點的加樣孔3為起點標志，左邊和右邊分別用熱龍膠依次將濾樣紙、吸水玻璃纖維 紙、聚酯膜片(膠體金-hTKl單克隆抗體3Es結(jié)合物)、包被有抗hTKl單克隆抗體2Ae和兔抗鼠 IgG多克隆抗體的硝酸纖維微孔濾膜和吸水濾紙粘貼于白色的PVC塑料片上，并在此膜片上覆 蓋一層有效的保護膜。其中，濾樣紙(全血分離膜)和吸水玻璃纖維紙均經(jīng)緩沖液處理并貼在 加樣孔3下面,并依次與聚酯膜片(膠體金-hTKl單克隆抗體3Es結(jié)合物)連接，而聚酯膜片(膠 體金-hTKl單克隆抗體3Es結(jié)合物)則與包被有抗hTKl單克隆抗體2^和兔抗鼠IgG多克隆抗 體的硝酸纖維微孔濾膜連接;硝酸纖維微孔濾膜尾部與吸水濾紙相連。完成貼膜后即可進行真 空干燥；最后，將全部貼好的條板在專用切割機上切成一定規(guī)格的條狀膜片，裝入塑料盒中， 加入干燥劑密封保存，即成乳癌基因蛋白預警芯片。本發(fā)明的技術(shù)操作方法用此乳癌基因蛋白預警芯片，可直接插入血液或血清或血漿中，片刻后，直接放置在水平的臺面3-5min,即可快速而準確檢測出乳癌基因蛋白hTKl,從而實現(xiàn)對早期乳癌的預警診斷； 或者將此乳癌基因蛋白預警芯片水平裝配在一個特定的模型(一個與此乳癌基因蛋白預警芯 片完全配套的反應(yīng)槽及檢測卡)內(nèi)，并用含肝素抗凝劑的微量吸管或滴管吸取20-50nl末梢 血液或靜脈血清或血漿樣品直接滴加到此乳癌基因蛋白預警芯片的樣品加入端(如血液標本 過于濃稠，則可用PBS緩沖液同時稀釋)，可見全血樣品中的血清通過層析(或毛細管)作用向 前移行。在向前移行的過程中，如血液中存在hTKl,則此抗原先與固定在玻璃纖維上的膠體金 標記物-hTKl單克隆抗體3E8的Fab端特異性結(jié)合，并攜帶著顯色標記物-膠體金繼續(xù)向前移行， 不斷與硝酸纖維微孔濾膜上所含有抗hTKl單克隆抗體2As和兔抗鼠IgG多克隆抗體發(fā)生抗原 抗體結(jié)合反應(yīng)而聚集,產(chǎn)生肉眼可見的兩條紅色條帶，即為陽性結(jié)果。此檢測僅需3-20 min, 當測定hTKl強陽性標本時3-5min可出結(jié)果；測定hTKl弱陽性標本時可5-10min出結(jié)果；測定 hTKl陰性標本時則須15-20 min出結(jié)果。另外，如需進行更準確的判斷，可將hTKl標準抗原 按照不同劑量分別加至健康抗凝靜脈全血或血清或血漿樣品中，使之形成一個對照測定的濃 度梯度0. 5 " g/L， 1 u g/L， 2 y g/L, 3 u g/L, 4 n g/L, 5 n g/L, 6 n g/L，然后分別滴加到此乳癌基 因蛋白預警芯片上，同樣方法測試并進行結(jié)果判斷。若出現(xiàn)小于0. 5ng/mL則為陰性結(jié)果；若 出現(xiàn)接近或等于1-2ng/mL標準品測試線，則可判為弱陽性；若出現(xiàn)接近或等于3-4ng/mL標準 品測試線，則可判為陽性；若出現(xiàn)接近或等于或深于5-6ng/mL標準品測試線，則可判為強陽 性；若質(zhì)控線l和測試線均不出現(xiàn)，則表明此乳癌基因蛋白預警芯片測試無效。本發(fā)明的主要技術(shù)特點本發(fā)明的這種乳癌預警方法和分析技術(shù)具有微量、快速、靈敏、 準確、簡便、穩(wěn)定、特異性強、無須特殊設(shè)備或儀器,且可單份測定、檢測成本低等特點和優(yōu) 勢,適合于科研和預防單位及各級醫(yī)院進行醫(yī)療、保健、體檢等使用，亦可用于個人、家庭成 員及親屬進行乳腺癌的預防性普查，以便早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷。本發(fā)明的主蘿技術(shù)創(chuàng)新點①釆用真核分泌型表達hTKl及其天然免疫制備hTKl單克隆 抗體的方法,并將此用真核表達的hTKl及其天然免疫制備的兩個不同親和力、不同結(jié)合位點 的hTKl單克隆抗體、并按照雙抗體夾心法制備成乳癌基因蛋白預警芯片為本發(fā)明首創(chuàng);②在 制備乳癌預警芯片的過程中，應(yīng)用天然免疫制備hTKl單克隆抗體的濃度或劑量及反應(yīng)條件(特別是PH值8.8)為本發(fā)明首創(chuàng);③在制備乳癌預警芯片的過程中，同時應(yīng)用兩個高特異性和高親和力天然免疫制備的hTKl單克隆抗體、并采用雙抗體夾心法即可以測定全血(末稍血)或靜脈血清或血漿中hTKl為本發(fā)明首創(chuàng):④用此天然免疫制備的hTKl單克隆抗體制備乳癌預警芯片既可用于末稍血，又可檢測靜脈血(包括血清或血漿)hTKl，特別是設(shè)計增加了全血細胞與血漿分離膜片為從根本上解決微量末稍全血hTKl測定奠定了基礎(chǔ);⑤采用一滴全血或血清或血漿僅l次或一步即可同時測定兩次乳癌基因蛋白hTKl的結(jié)果更為準確可靠為本發(fā)明首創(chuàng);⑥為防止全血凝固或濃稠及血清不易擴散,在進行測定時設(shè)計配套使用的肝素抗凝吸管或滴管,或者根據(jù)血液粘稠度進行稀釋血樣后再測定為本發(fā)明首創(chuàng);⑦此乳癌基因蛋白預警芯片外觀設(shè)計形式和改為微縮芯片及加樣孔3設(shè)計在膜片中心可使操作更加方便和簡捷及實用；⑧一個新型的與此乳癌基因蛋白預警芯片完全配套的反應(yīng)槽和檢測卡中增加了一個放大目鏡可使顯色結(jié)果放大而提高觀察的準確性;⑨在hTKl基因蛋白乳癌預警芯片初始端聚酯膜(上有膠體金與hTKl單克隆抗體3Es結(jié)合物)的正下方所安裝的玻璃纖維膜片和濾樣紙是經(jīng)過緩沖液特別處理過的，可使檢測標本或液體不受PH值變化的影響并保持檢測結(jié)果更加穩(wěn)定為本發(fā)明特色;⑩羊抗鼠IgG多克隆抗體,hTKl單克隆抗體2夂及hTKl單克隆抗體3^等最佳包被濃度的確定，及最后檢測結(jié)果小于0. 5ng/ml為陰性，接近1-2ng/ml為弱陽性，接近3-4ng/ml為陽性結(jié)果，接近5-6ng/ml為強陽性結(jié)果等為本發(fā)明首創(chuàng)。本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢和特點主要表現(xiàn)為這種乳癌基因蛋白預警芯片及其分析方法，從hTKl的基因克隆、真核表達和單克隆抗體制備及其芯片組裝等，源頭技術(shù)和原料為發(fā)明人自己制備，可迅速產(chǎn)業(yè)化；而且，基因工程技術(shù)使這種乳癌基因蛋白預警芯片徹底解決"核芯-hTKl單克隆抗體"問題，這在今后應(yīng)用起來不僅來源方便、價格便宜、且易學易懂、易于普及和推廣應(yīng)用。特別是本發(fā)明形成的技術(shù)方法和產(chǎn)品，具有微量、快速、靈敏、準確、簡便、禾急定性好、重復性高、特異性強、無須特殊設(shè)備或儀器、檢測成本低、可單份或多份標本分別測定、且攜帶方便、易于現(xiàn)場或野外普查或體檢等特點和優(yōu)勢，可適合于科研和預防單位及各級醫(yī)院進行醫(yī)療、保健、體檢等使用，亦可廣泛用于個人、家庭成員及親屬進行乳腺癌的預防性自查或普查，以便早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷。具體地說，本發(fā)明專利的技術(shù)優(yōu)勢和特點主要表現(xiàn)為① 微量采用本發(fā)明進行乳癌密切相關(guān)標志物TK1基因蛋白檢測，通常所需檢測樣品-末稍血或血清或血漿1滴(大約20-50 " 1)即可)，即使檢測樣品(血清或血漿)只有5-10 y 1仍 可完成檢測。而其它一些可用于hTKl含量檢測的免疫化學發(fā)光法、ELISA法、微天平質(zhì)量檢 測法等需要血標本至少2毫升左右，標本用量超過20倍以上。② 快速本發(fā)明具有移動速度快、反應(yīng)時間短、檢測迅速等特點，從滴加檢測樣品、毛 血作用移動、到顯色反應(yīng)完成、最后判斷出結(jié)果在3-20分鐘之內(nèi)全部完成。有些非常典型的 病例(即hTKl含量較高)的樣品檢測，其結(jié)果判斷甚至只需要3-5分鐘即可全部；而其它一些 可用于hTKl含量檢測的方法，包括免疫化學發(fā)光法、ELISA法、微天平質(zhì)量檢測法等雖可檢 測hTKl,但需要特殊儀器設(shè)備、且操作復雜、流程繁瑣、時間較長(至少需要1-2小時以上)、 有些甚至時間更長。③ 靈敏因本發(fā)明采用抗原抗體特異性結(jié)合原理設(shè)計,可檢測出ng級水平的乳癌密切相 關(guān)標志物TK1。如本發(fā)明技術(shù)是采用雙抗體夾心法，其靈敏度甚至可高達lng/ml，即可在每毫 升全血或血清或血槳樣品中，可檢測出lng與乳癌密切相關(guān)標志物TKl，可見其靈敏度之高、 不失為一種高靈敏度的乳癌早期發(fā)現(xiàn)和預警診斷的方法之一。④ 準確采用本發(fā)明采用一滴全血或血清或血漿標本可同時平行測定兩次，因此準確性 更高，判斷更準確。按照此方法曾對30份典型的乳癌患者血清標本進行測定，其中28份血清 均出現(xiàn)檢測結(jié)果為陽性的預警結(jié)果，一次性檢出率大于93%。同時，用本發(fā)明的方法與經(jīng)典的 酶免疫法或最新的微天平質(zhì)量法比較，其相對吻合合率、敏感性、特異性等均在90%以上。這 說明本方法不失為一種相對準確和可靠的乳癌早期預警方法。 簡便本發(fā)明操作十分簡便，可不受條件限制隨時進行,且無需任何檢測儀器和設(shè)備， 檢測者只要按照說明書，將一滴全血或血清或血漿標本加至本發(fā)明事先制備好的乳癌基因蛋 白預警芯片上，于室溫水平放在一個臺面，然后等待3-5分鐘，最后肉眼觀察結(jié)果即可。由 于膠體金本身具有清晰的顯色反應(yīng)，較ELISA省略了添加反應(yīng)顯示劑和終止液等步驟，從而使操作步驟得以大大簡化，既適合于外出體檢、普查或病人床邊現(xiàn)場應(yīng)用，且特別適用于家庭及個人使用或緊急情況下復查或輔助診斷用。 安全本發(fā)明均采用的是無毒無害、無輻射、無易燃、易爆、易腐蝕、易刺激、無致 癌、致畸、致基因突變的原材料，整個反應(yīng)也未添加任何放射性同位素、刺激性物質(zhì)及鄰苯 二胺等有害物質(zhì)，故在實際應(yīng)用時，既不會損傷測試者或被測試者的健康，也不會污染環(huán)境。 因此,本發(fā)明具有諸如放射性同位素或酶標及其它有害化學方法等檢測法所無法比擬的安全 性及清潔環(huán)保等特點。⑦ 穩(wěn)定本發(fā)明采用抗原抗體特異性結(jié)合原理設(shè)計，反應(yīng)極少受其它影響因素干擾,特別 是極少受環(huán)境溫度、濕度、光照、氧含量等外界因素影響不大，加上膠體金標記hTKl單克隆抗體是一個簡單的物理反應(yīng)過程，且抗體結(jié)合相對牢固，基本不會引起hTKl單克隆抗體生物活性的改變，所以檢測方法十分穩(wěn)定。⑧ 重復性好用本發(fā)明方法同一批制備的12條乳癌基因蛋白預警芯片測定同一標準對照樣品，或者用本發(fā)明技術(shù)制備的3個不同批號的乳癌基因蛋白預警芯片測定同一標準對照樣 品各12次，其質(zhì)控線1和檢測線2的顯色時間、顏色深淺和最終結(jié)果判斷基木相同，說明其批 內(nèi)和批間重復性均較好。同時，采用本發(fā)明方法同一批制備的12條乳癌基因蛋白預警芯片同 時測定同一份典型的乳癌患者血清標本，每次均出現(xiàn)檢測結(jié)果為陽性的預警結(jié)果；而且，采用 本發(fā)明方法同一批制備的乳癌基因蛋白預警芯片，每天1次、連續(xù)12天對同一份典型的乳癌 患者血清標本進行測定，結(jié)果也表明每次均出現(xiàn)檢測均為陽性的預警結(jié)果，這表明，采用本發(fā) 明方法制備的乳癌基因蛋白預警芯片的重復性較好。⑨ 特異性強本發(fā)明采用TK1單克隆和多克隆抗體特異性檢測乳癌患者血清或血槳中的 TK1抗原，由于該抗原和抗體結(jié)合的高度特異性和親和性，使本發(fā)明技術(shù)具有特異性強的特點。 采用本發(fā)明檢測不同濃度稀釋的標準TK1抗原均出現(xiàn)結(jié)合反應(yīng)；而與其它類型的癌抗原均無 特異性結(jié)合反應(yīng)出現(xiàn)。⑩ 檢測成本低本發(fā)明使用的TK1單克隆抗體和多克隆抗體均采用分子生物學技術(shù)天然 免疫動物制備而得，批量生產(chǎn)的實際成本很低；而且,本發(fā)明所采用的固相載體是國內(nèi)外通用 的硝酸纖維微孔濾膜，膠體金也是氯金酸通過擰檬酸鈉還原制得，不僅質(zhì)量穩(wěn)定，而且價格也都十分便宜；加上實際檢測所需試劑和樣本用量均很少，且可隨時進行單份標本檢測，這都使 得檢測成本和應(yīng)用價格大幅下降。除此之外，用本發(fā)明方法制備的乳癌基因蛋白預警芯片的質(zhì)量也較為穩(wěn)定，如隨機抽取 12條乳癌基因蛋白預警芯片，分別加入同一份標準對照樣品，從開始加樣開始計時，到質(zhì)控 線1出現(xiàn)明顯顏色記錄時間，其標本移動速度和顯色反應(yīng)時間等均基本一致，說明用本發(fā)明 方法制備的乳癌基因蛋白預警芯片的滲透速度和均一性較好。


圖1是本發(fā)明外觀結(jié)構(gòu)圖具體實施方式
(1) 主要原材料①抗hTKl單克隆抗體3Es:其純度為96. 7%,親和力系數(shù)為1. 8X109，此原 料為發(fā)明人自制;②抗hTKl單克隆抗體3Fv.其純度為96. 1%,親和力系數(shù)為1. 2X109，此原料為 發(fā)明人自制;③hTKl標準品此原料為發(fā)明人自制，使用時，分別稀釋成10iig/L、 5iig/L、 6ug/L、 3ug/L、 8ug/L、 4ug/L、 2ug/L、 1 u g/L、 0. 5ug/L，并進行標定后，凍干后備 用；④氯金酸(AuCl3. HC1. 4H20):美國Sigma公司產(chǎn)品；⑤羊抗鼠IgG多克隆抗體鼎國生 物制品公司；⑥小牛血清Pierce公司產(chǎn)品；⑦玻璃纖維美國Sigma公司產(chǎn)品；⑧硝酸纖 維微孔濾膜(NC膜)美國基因公司產(chǎn)品，孔徑為5"m，液體移動速度約50s移動lcm;⑨常 用化學試劑碳酸鉀(10:03)溶液、磷酸氫二鉀(K2HP04)和磷酸二氫鉀(KH2P0》緩沖液、tris-HCl緩沖液、國產(chǎn)分析純(AR)，化學試劑公司購買后按照常規(guī)方法配制；雙蒸水實驗室自制。 ⑩聚氯乙烯(PVC)材料上海升惠塑料制品有限公司產(chǎn)品。而聚酯膜、濾紙、塑料板、色卡等均為杭州艾康公司產(chǎn)品。(2) 主要儀器和設(shè)備①高速冷凍離心機；②真空干燥機；③自動分光光度計；④液體快 速混合器；⑤可調(diào)式電爐；⑥恒溫箱；⑦專用掃描筆；⑧金標機；⑨自動點膜機和切板機； ⑩冷凍干燥機。(3) 具體實施方法①hTKl基因進行克隆及序列分析1) 逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增TKl cDNA:用可從動物細胞和組織、細菌、真菌等提取總提取總核糖核酸 (RNA)的Trizol試劑試劑盒從500萬個Hela細胞中提取RNA,經(jīng)氮甲喋呤處理48小時，并經(jīng)純化 后再用一種高效垸化劑-焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解沉淀得30ri。由于DEPC可破壞核糖核酸 酶(RNase)活性，因此可去除RNase的污染。在進行逆轉(zhuǎn)錄時，加入5倍緩沖液4W、引物Oligo-dT(O. 5Pg/lW) 1W、 10mMol/L濃度的脫氧核苷三磷酸(dNTP) :2W、 RNA:10ri、去離子水水2nl，充分混勻，并 置于7(TC恒溫水浴10分鐘；然后，再置于冰上2分鐘；加入1W逆轉(zhuǎn)錄酶(50U， Roche)，混勻， 再置于42'C水浴90分鐘，其逆轉(zhuǎn)錄體積共20W。 根據(jù)人TK1基因序列設(shè)計一對引物 引物1. 5-AGCTAAGCTTAGCTGCATTAACCTGCCCAC-3 引物2.5-TACTCTCGAGGTTGGCAGGGCTGCATTGCAGAATC-3 引物1引入HindIII酶切序列；引物2引入XhoI酶切序列 再進行PCR擴增，即加入10倍緩沖液5W， dNTP(2. 5mMol/L) :4W， 引物1:1W，引物2:lri,cDNA:5W,Taq酶lW，去離子水33ri; PCR擴增液體積共?；靹颍?PCR儀上擴增94'C60秒，55°C60秒，72°C120秒，共進行30個循環(huán)，最后補加72°C5分鐘。然后， 取PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠上電泳，切下700bp位置的DNA條帶，用凝膠回收試劑盒回收DNA 片段用于TA克隆。2) TA克隆和DNA序列分析純化的PCR產(chǎn)物與pMD-18T載體重化大腸桿菌組，轉(zhuǎn)JM109，涂布 于含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上,37'C培養(yǎng)過夜,次日挑取10個白色的單菌落擴大培養(yǎng)，用質(zhì) 粒提取試劑盒純化質(zhì)粒,雙酶切(HindIII和Xhol)鑒定插入片段，在所選的10個克隆中均有插入 片段，片段大小約為700bp。 TK1重組TA克隆(TA9)用T7和SP6引物雙向測序，結(jié)果與GenBank 的TKl序列比較證明本次克隆的cDNA是人TKl基因，全長702個堿基。②TK基因亞克隆入真核分泌型表達載體采用真核分泌型表達載體pSecTag2/Hygro B (簡稱pSecTag2)，其可以將重組基因表達的蛋 白分泌到細胞外，由于TK1沒有信號肽，所以選擇分泌型載體是一最佳的方法。用HindIII和Xhol分別酶切TK1/TA克隆質(zhì)粒和pSecTag2質(zhì)粒，用凝膠電泳和膠回收試劑分 別純化TK1和pSecTag2的DNA片段,然后進行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體積共15ri，即10倍的連接 緩沖液1.5ri， TK1 DNA片段8. 0W,PSecTag2 DNA:4. 5W,T4 DNA連接酶1.0W?；靹?，置4'C冰 箱過夜；加入300^1感受態(tài)的大腸桿菌JM109,置冰浴中1小時，42'C水浴90秒，再于冰水浴中5 分鐘;加LB培養(yǎng)基lml,混勻，置37C培養(yǎng)1小時，離心收集沉淀，將沉淀的菌體涂于含氨芐青霉素 (50Pg/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基上，于37'C過夜培養(yǎng)。挑取10個菌落擴大培養(yǎng)，用試劑盒小提質(zhì)粒 DNA，再用內(nèi)切酶和電泳鑒定重組質(zhì)粒，所挑選的IO個質(zhì)粒均含有TKI基因，電泳顯示可以切下 大約700bp的DNA片段，同時在TKl片段中有一個Sfl酶切位點。TKl重組質(zhì)粒命名為pSecTag/TKl。③ PSecTag/TKl DNA的大量制備PSecTag/TKl重組菌于37"C活化培養(yǎng)過夜，然后接種于50ml的LB培養(yǎng)基中(含氨芐青霉素 50化/tnl), 37'C振蕩培養(yǎng)5小時，再轉(zhuǎn)入500mL培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)5小時，離心回收菌體；按試劑盒 程序提取質(zhì)粒DNA;在最后洗脫時選用無菌蒸餾水。純化的質(zhì)粒DNA用紫外分光光度計檢測純度和 定量.500ml培養(yǎng)的菌體可以提取400Pg質(zhì)粒DNA，冰箱中凍存?zhèn)溆?。?基因免疫制備TK1單克隆抗體l)TKl基因免疫Balb/c小鼠免疫過程取4周齡Balb/c純系 雌性小鼠3只(其中一只不免疫作為對照)，每只鼠兩側(cè)股四頭肌分別注入50Hg pSecTag/TKl DNA(每側(cè)50W);對照鼠注入等量的生理鹽水；每15天免疫一次，總共免疫5次，第二次免 疫后IO天開始檢測血清中抗體；于末次免疫后一周進行細胞融合。2)TK1基因免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合A:詞養(yǎng)細胞制備Balb/C小鼠拉頸處 死，取其胸腺，置于10ml培養(yǎng)液中，在鋼網(wǎng)上研磨分散細胞，棄大塊組織，將細胞調(diào)成 5. 0X107ml, 96孔培養(yǎng)板每孔100ul。 B:骨髓瘤細胞準備小鼠骨髓瘤細胞為NS1細胞株，融合 前細胞生長良好，細胞濃度為5X10Vml。 C細胞融合2X10'個骨髓瘤細胞與2X1()8個細胞混勻， 離心，棄上清，輕微振蕩混勻，于37。C水浴中，在90秒內(nèi)滴加lml 50%的PEG,然后滴加20ml無 血清培養(yǎng)基，離心，棄上清，再洗一次，加入15%血清的培養(yǎng)基20ml (含HAT),混勻，每孔加入 lOOri (原有的飼養(yǎng)細胞)，同時設(shè)有單獨脾細胞和單獨骨髓瘤對照孔(12 L/每個)。4天后換液；吸出lOCmi,加入含15%血清HAT培養(yǎng)基；第三次換液時為HT培養(yǎng)基；每日觀 察細胞生長狀態(tài)，IO天左右出現(xiàn)克隆。3)雜交瘤培養(yǎng)上清TK1抗體的檢測用直接ELISA檢測雜交瘤培養(yǎng)上清中的抗體,用TK1 抗原包被ELISA板，加入培養(yǎng)上清，沖洗后加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG,孵浴和沖洗后， 加顯色底物0PD，然后測492nm的光密度，以高于陰性對照光密度2倍以上為陽性克隆。結(jié)果 在融合后兩周的培養(yǎng)上清中有28孔顯示TK1抗體陽性。選擇效價高的三個孔進行克隆化。4) 克隆化和擴大培養(yǎng)多克隆培養(yǎng)孔內(nèi)的細胞采用有限稀釋法進行克隆化，用含有HAT 的培養(yǎng)基制備小鼠胸腺細胞作為詞養(yǎng)細胞，多克隆孔內(nèi)的細胞進行稀釋至每孔含有100， 10 和0個細胞(100W)，培養(yǎng)觀察，對只有一個克隆雜交瘤的培養(yǎng)上清進行檢測。選擇陽性克 隆轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)板中進行擴大培養(yǎng)，每孔lml，培養(yǎng)5天后，加入4ml培養(yǎng)液，混勻，分入 4個培養(yǎng)孔中，繼續(xù)培養(yǎng)5天，然后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中進行擴大培養(yǎng)，選擇抗體陽性，且效價穩(wěn) 定的克隆進行進一步擴大和凍存。結(jié)果得到兩株結(jié)合位點不同、且穩(wěn)定分泌TK1抗體的雜交 瘤，命名為DZ1和DZ2。5) TK1單克隆抗體大量制備和純化:Balb/C小鼠腹腔注入0. 5ml液體石蠟， 一周后每只 小鼠腹腔注入5X105個雜交瘤細胞，然后當有明顯腹水形成時，針頭穿刺放腹水。收集的腹水 12000rpm離心5分鐘，棄沉淀，上清用蛋白G柱親和層析純化。將純化后的TK1單克隆抗體 用蛋白定量試劑(BCA)定量抗體,分裝保存。6) TK1單克隆抗體的鑒定單克隆抗體特異性的鑒定:A:直接ELISA:TK1包被固相，加TK1 腹水，再抗體和酶標抗體。B:雙抗體夾心ELISA:用腹水包被固相(1:200);加入不同濃度的TK1, 然后加堿性磷酸酶標記抗TK1的IgY，用堿性磷酸酶底物顯色，測570nm的光密度。C:免疫組 化:制備HeLa細胞涂片，分成兩組一組為HeLa細胞另一組為氨基喋呤誘導48小時的HeLa 細胞，EDTA消化培養(yǎng)的細胞，使其分散,用PBS洗一次,稀釋成5X107ml，每個細胞涂點為30W; 室溫干燥，丙酮固定5分鐘，然后用1%的雙氧水處理30分鐘；再用3%的BSA封閉30分鐘。然 后加抗體(1:400稀釋，培養(yǎng)上清用原液)，孵浴和沖洗，加酶標抗體，沖洗后加DAB底物顯色，光鏡下觀察結(jié)果，同時用商品試劑盒對照進行。結(jié)果顯示DZ1、 DZ2雜交瘤分泌的抗體是TK1特異的單克隆抗體2Ae和TK1特異的單克隆抗體3Es。最后，經(jīng)過十二垸基磺酸鈉(SDS) -PAGE(聚 丙烯酰胺)凝膠電泳法檢測其抗體純度；同時,進行抗體的IgG類型、亞類鑒定、以及抗體的 結(jié)合位點和親和力測定等。之后，置于低溫冰箱中保存，即可備為后續(xù)應(yīng)用。 ⑤顯色標記物-膠體金的制備l)氯金酸應(yīng)用液和檸檬酸三鈉應(yīng)用液的配制準確稱取優(yōu)質(zhì)氯金酸10mg，立即置于100ml 潔凈燒杯中；再加入100ml雙重蒸餾水，然后，再開啟液體快速混合器，不斷進行攪拌，使之完 全溶解，而得到濃度為0. 25XlCT、ol/L(0. 01%)的氯金酸溶液100ml;同時，再準確稱取檸檬酸 三鈉1. 0g,置于另一個潔凈100ml燒杯中，再加入100ml雙重蒸餾水；同樣，用液體快速混合器 不斷攪拌溶解，使之完全溶解，得到濃度為34X10—3mol/L(l%)的檸檬酸三鈉溶液lOOml。2) 膠體金應(yīng)用液的配制將上述已經(jīng)配制好的濃度為0. 25X10—3mol/L(0. 01%)的氯金酸溶 液100ml置于墊有隔熱石棉網(wǎng)可調(diào)式電爐上逐步加熱至沸騰后，迅速加入已配制好的濃度為 34Xl(Tmol/L(P/。)的擰檬酸三鈉(枸櫞酸三鈉)溶液2ml，繼續(xù)煮沸加熱10-15min后，仔細觀察， 直至膠體金應(yīng)用液的顏色變?yōu)榫萍t色或紫紅色后，關(guān)閉可調(diào)式電爐，使其逐步冷卻后，即可形 成所需要的膠體金溶液，冷卻后，置于4'C冰箱保存?zhèn)溆谩?) 膠體金顆粒大小和均勻度鑒定將上述膠體金溶液用自動分光光度計在可見光范圍 (400-600nm)內(nèi)進行掃描，發(fā)現(xiàn)其在波長為520-521 nm處時，該膠體金溶液有最大吸收峰，且主 峰寬度較窄，證實所制備的膠體金粒度在20-25nm，符合后續(xù)使用的要求?！蚰z體金-hTKl單克隆抗體3E8結(jié)合物千燥聚酯膜片制備:在確定完成氯金酸還原成顆粒 大小分布均勻的膠體金后，即可進行膠體金標記hTKl單克隆抗體3Es的制備。1) 弱堿性膠體金濾液和hTKl單克隆抗體3Es應(yīng)用液的制備:取劑量為100 mL的膠體金溶 液，置于250mL的潔凈燒杯之中；然后，用事先已配制好的濃度為0. lmol/mL的碳酸鉀(K2C03) 溶液將此膠體金溶液的酸堿度逐步調(diào)至PH8.8，然后，再用孔徑為0.45ym的濾膜負壓過濾， 即可得到弱堿性膠體金濾液過濾液。緊接著，取前述已純化好的hTKl單克隆抗體3&并用雙 重蒸餾水配制成每毫升中含有hTKl單克隆抗體3E8 1500 ii g的溶液。2) 膠體金-hTKl單克隆抗體3Es結(jié)合物的制備取上述弱堿性膠體金濾液過濾液100mL，在不斷快速攪拌中，緩慢加入lmL己調(diào)節(jié)到濃度為1500ti g/mL的hTKl單克隆抗體3E8，則其 標記蛋白量為每毫升膠體金中加15" g hTKl單克隆抗體3E8。在繼續(xù)攪拌15-20min后，加入 用pH8. 2,濃度為20酬ol/L tris-HC1緩沖液配制的20%小牛血清白蛋白(BSA) lmL(200mg);再 經(jīng)過10-15min攪拌后，置于冷凍離心機中進行低溫(0-4。C)低速離心(1500rpm/niin) 10min。小 心棄除沉淀；取上清液再進行低溫(0-4°C)高速離心(12000rpm/min) 20_30min后，再小心吸去 上清液,保留沉淀，此即為膠體金一抗hTKl單克隆抗體3Es結(jié)合物。3)膠體金-抗hTKl單克隆抗體3Es結(jié)合物的聚酯膜片制備首先，配制濃度為0. Olmol/L Tris-HC1緩沖液(P/。BSA，pH8. 2);然后，用此緩沖液將上述已沉淀好的膠體金-hTKl單克隆抗 體犯8結(jié)合物稀釋至10mL;最后，將此稀釋好的膠體金-hTKl單克隆抗體3E8結(jié)合物按照0.8ml/ 條(O. 4cmX20cm/條)的劑量用金標機將其均勻分布在聚酯膜吸膜片上、并做好標記，然后進行 真空冷凍干燥，或者置于已消毒過的37'C恒溫干燥箱中過夜干燥，即可得到含有膠體金-抗 hTKl單克隆抗體3E8結(jié)合物的干燥聚酯膜膜片，密封后備用。⑦hTKl基因蛋白乳癌預警芯片制備1)制備含有hTKl單克隆抗體2Ab和羊抗鼠IgG多克隆抗體的硝酸纖維微孔濾膜片分別將 hTKl單克隆抗體2Ae和羊抗鼠IgG多克隆抗體分別用1Ommol/L， pH 7. 4的磷酸鹽(PBS)緩沖液 稀釋成1500mg/L(1.5mg/ni1)。其中，前者為檢測線2,后者為質(zhì)量控制線(質(zhì)控線1)。將這兩 種抗體分別裝入兩支潔凈的專用掃描筆中，檢測線2(含hTKl單克隆抗體2As)和質(zhì)控線l(含 羊抗鼠IgG多克隆抗體)的帶線均寬2mm，但兩者之間相距8誦。將程序設(shè)計好后輸入自動點 膜機，噴涂量為1. Ou L。然后，開啟自動點膜機開關(guān)，即進入工作狀態(tài)，此時,在位于硝酸纖維 微孔濾膜(NC膨中部左1/2的位置上自動點膜機分別將這兩種抗體分別包被于硝酸纖維微孔 濾膜(NC膨上,分別做好標記，即檢測線2(含hTKl單克隆抗體2A6)和質(zhì)控線1 (含羊抗鼠IgG 多克隆抗體)；同樣，在位于硝酸纖維微孔濾膜(NC膜)中部右1/2的位置上自動點膜機分別將 這兩種抗體分別包被于硝酸纖維微孔濾膜(NC膜)上，分別做好標記，即檢測線2(含hTKl單克 隆抗體2A6)和質(zhì)控線l(含羊抗鼠IgG多克隆抗體)。同時，在這條NC膜(長IOO鵬、寬4mm)的 正中間的中點(50 mm和2 mm)設(shè)計一圓形加樣孔3并做好記號。其中，使這兩條hTKl單克隆抗體2A6分別位于該加樣孔3左右兩邊各25 mm的位置；而羊抗鼠IgG多克隆抗體則分別位于 該加樣孔3左右兩邊各33 mm的位置。緊接著，將包被有hTKl單克隆抗體2&和羊抗鼠IgG 多克隆抗體的硝酸纖維微孔濾膜上置于10咖ol/L, pH7. 4的磷酸鹽(PBS)緩沖液(含有1% BSA) 中，37。C恒溫浸泡60min;最后，再用1O隱ol/L, pH7. 4的磷酸鹽(PBS)緩沖液洗滌1-2次；隨后 取出，盡可能吸干水分，置于室溫或37'C恒溫箱中干燥或真空干燥，即得含有hTKl單克隆抗體 2Ae和羊抗鼠IgG多克隆抗體的硝酸纖維微孔濾膜片，密封,備用。2) hTKl基因蛋白乳癌預警芯片組裝在完成包被含有hTKl單克隆抗體2A6和兔抗鼠IgG 多克隆抗體的硝酸纖維微孔濾膜后，即可進行乳癌預警芯片的組裝。首先,進行膜片組裝前的 預處理:取寬度為80mm的白色聚氯乙烯(PVC)板，使用前，用純凈水反復潔凈處理后，再用雙蒸 水浸泡或沖洗，并置于室溫自然干燥。緊接著,進行粘貼復膜以正條中點的加樣孔3為起點 標志，左邊和右邊分別用熱龍膠依次將濾樣紙、吸水玻璃纖維紙、聚酯膜片(膠體金-hTKl單 克隆抗體3E8結(jié)合物)、包被有抗hTKl單克隆抗體2Ae和兔抗鼠IgG多克隆抗體的硝酸纖維微 孔濾膜和吸水濾紙粘貼于白色的PVC塑料片上，并在此膜片上覆蓋一層有效的保護膜。其中， 濾樣紙(全血分離膜)和吸水玻璃纖維紙均經(jīng)緩沖液處理并貼在加樣孔3下面，并依次與聚酯 膜片(膠體金-hTKl單克隆抗體3Es結(jié)合物)連接，而聚酯膜片(膠體金-hTKl單克隆抗體3Es結(jié) 合物)則與包被有抗hTKl單克隆抗體2A6和兔抗鼠IgG多克隆抗體的硝酸纖維微孔濾膜連接； 硝酸纖維微孔濾膜尾部與吸水濾紙相連。在完成貼膜后即可進行真空干燥；最后,將全部貼好 的條板在專用切割機上切成一規(guī)格為寬4mm、長100mm的條狀膜片,裝入塑料盒中，加入干燥 劑密封保存，即成乳癌基因蛋白預警芯片。⑧hTKl基因蛋白乳癌預警芯片的測試方法l)打開包裝，迅速取此乳癌預警芯片一條,并將其平整而規(guī)范地裝入特制配套的卡板中 的相關(guān)位置，立即蓋上卡板蓋,直接放置在水平的臺面(*注:測試使用的特制配套卡板將另申 報實用新型專利)。2)用事先準備好的消毒酒精棉球搽拭受檢者的手指或耳垂,待酒精干后，立即用已消毒過的采血三棱針刺破,輕輕擠壓,使血流出；然后，用含有肝素抗凝劑的微量吸管吸入50 u L全血直接加入至卡板中點標有加樣孔3的圓形孔處。如發(fā)現(xiàn)末稍血較為粘稠，可用含有肝素抗凝劑 的微量吸管吸入25 u L全血和25 y L 10畫ol/L， pH7. 4的磷酸鹽(PBS)緩沖液，混合后，直接加 入至卡板中點標有加樣孔3的圓形孔處。3) 此時，該抗凝血中的血漿或血液稀釋液中的血漿由于毛細作用，分別向左右兩側(cè)自然移 動。如血漿中含有hTKl基因蛋白(抗原)，則該抗原先通過左右兩側(cè)的玻璃纖維的層析作用自 然向各自方向前行、并與左右兩側(cè)聚酯膜片上膠體金標記的hTKl單克隆抗體犯s特異性結(jié)合 形成抗原抗體復合物。4) 同時，因毛細作用的繼續(xù),左右兩側(cè)帶有膠體金標記的抗原抗體復合物繼續(xù)向各自前方 移行至兩側(cè)NC膜，并立即與包被在兩側(cè)NC膜上的hTKl單克隆抗體2A6發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)， 形成雙抗體夾心的抗原抗體復合物。此時，血漿中未被完全結(jié)合的hTKl抗原繼續(xù)通過左右兩 側(cè)聚酯膜片與膠體金標記的hTKl單克隆抗體3E8特異性結(jié)合形成抗原抗體復合物后繼續(xù)向兩 側(cè)前行,并與包被在兩側(cè)NC膜上的羊抗鼠IgG多克隆抗體結(jié)合。全部試驗過程大約3-2(kin。5)由于膠體金的不斷被富集，此時在左右兩側(cè)NC膜應(yīng)各呈現(xiàn)出兩條目測可見的紅色或 紫紅色條帶(整個卡板上應(yīng)為四條)。6)結(jié)果判斷陰性左右兩側(cè)的NC膜片上靠近加樣點的檢測帶均不顯色，而左右兩側(cè)的NC 膜片上的質(zhì)控帶則顯色，即左右兩側(cè)遠離加樣點的位置各出現(xiàn)l條紅線(整個卡板上應(yīng)為兩條)， 表示檢測標本中不含hTKl基因蛋白；陽性左右兩側(cè)的NC膜片上的檢測帶和質(zhì)控帶均顯色，即 左右兩側(cè)個出現(xiàn)2條紅線(整個卡板上應(yīng)為四條)，則表示檢測標本中含有hTKl基因蛋白；無效 若左右兩側(cè)的NC膜片上的測試帶和質(zhì)控帶均不顯色，即整個卡板上均無紅線出現(xiàn)，則表明測試 無效，表示此乳癌預警芯片己經(jīng)失效。本發(fā)明實施的注意事項第一，用于制備此乳癌基因蛋白預警芯片的核心成分-hTKl單克隆抗體必須先進行特異 性的鑒定，包括采用直接ELISA法、雙抗體夾心ELISA法、免疫組化法等，以確切證實所選 用的雜交瘤細胞所分泌的抗體是TK1特異性的單克隆抗體。第二，在確切證實所選用的雜交瘤細胞所分泌的抗體是hTKl單克隆抗體以后，還需要同時對此hTKl單克隆抗體進行親和力測定，以確切證實所選用的兩個特異性hTKl單克隆抗體 的親和力系數(shù)均必須大于1X106以上，而且最好是在1X109以上。第三，所選用的這兩個特異性hTKl單克隆抗體(代號為2&和3E8)在經(jīng)過親和力系數(shù)測 定，并確定其具有高度的親和力后，還必須先將含hTKl單克隆抗體的小鼠腹水經(jīng)過抗體純化 過程，以免因為此抗體純度不夠而影響或者干擾檢測的靈敏度和準確性。第四，膠體金作為hTKl單克隆抗體的重要標記物，也是本發(fā)明成功制備乳癌基因蛋白預 警芯片的重要因素。因此，成功制備出高質(zhì)量膠體金，是完成合格的膠體金-hTKl單克隆抗 體結(jié)合物制備過程的重要環(huán)節(jié)，務(wù)必高度重視，認真操作。在進行膠體金制備時,除了氯金酸 還原時需要添加合適濃度的檸檬酸三鈉(枸櫞酸三鈉)溶液外，還需要控制好整個反應(yīng)的PH 值、時間和溫度。為了確保膠體金的質(zhì)量，必要時，須用自動分光光度計對此膠體金在可見光 范圍(400-600nm)內(nèi)進行掃描,分析所制備的膠體金顆粒是否均勻。需要強調(diào)的是,如果使用競 爭法,膠體金的顆粒以20-25nm為宜；而采用雙抗體夾心法則采用的膠體金的顆粒以25-30nm 為宜。第五，在制備高質(zhì)量膠體金時,所用的玻璃器皿必須按照規(guī)范化的操作徹底清洗；有條件 時最好采用經(jīng)過硅化處理的玻璃器皿；或者采用前次配制過合格膠體金的玻璃器皿，但在再 次使用前，必須用雙蒸水反復沖洗后才能再使用，以免影響hTKl單克隆抗體與膠體金顆粒結(jié) 合和活化后膠體金顆粒的穩(wěn)定性。第六,膠體金顆粒的大小及其均勻性很重要，不能獲得20-40nm的膠體金顆粒將會影響其 與hTKl單克隆抗體結(jié)合力和穩(wěn)定性。因此，要求制備膠體金時所有試劑均必須保持其純度， 即所有試劑都必須使用分析純或優(yōu)級純，包括配制中使用的檸檬酸三鈉(枸櫞酸三鈉)、氯金 酸、碳酸鉀0 :03)及配制緩沖液的試劑等。特別是所用的氯金酸質(zhì)量一定要符合要求，即純 度高，雜質(zhì)少，最好是進口的優(yōu)級純。同時，所使用的小牛血清白蛋白(BSA)必須新鮮、干凈 無任何變質(zhì)及污染。配制上述試劑所用的純凈水必須去離子后才能用于配制，且在臨用前將 配好的試劑經(jīng)過超濾或微孔濾膜(0. 22 u m)過濾，以完全除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì)。有條件的話，純凈水最好是使用雙重蒸餾水或三重蒸餾水。而且，在實際配制時還必須嚴格按照實驗室制劑配制的相關(guān)規(guī)則。如配制膠體金溶液的pH以中性(pH7.2)較好，通常采用雙重蒸餾水或三重蒸餾水配制。第七，實際使用時，通常氯金酸的應(yīng)用濃度為0. 01%的水溶液，但氯金酸水溶液濃度在 1.0%時可在4'C條件下保持數(shù)月穩(wěn)定不變。為避免由于氯金酸易于潮解造成的損失，在實際 配制時,可將開封后的氯金酸一次性溶解后配制成1. 0%的水溶液置于4'C冰箱中保存。第八，在確定完成氯金酸還原成顆粒大小分布均勻的膠體金后，即可進行膠體金標記人胸 腺嘧啶脫氧核苷激酶(hTKl)單克隆抗體(McAb)，即膠體金-hTKl McAb結(jié)合物的制備。標記物 膠體金對于被標記的hTKl單克隆抗體的吸附效果主要取決于pH值，在接近hTKl單克隆抗體 的等電點或稍偏堿的條件下，膠體金和hTKl單克隆抗體較易形成牢固的結(jié)合物。如果實際制 備時膠體金的pH值低于hTKl單克隆抗體的等電點時,則會很快發(fā)生聚集而失去結(jié)合能力。經(jīng) 等電點聚焦免疫電泳檢測，hTKl等電點為8. 3-8. 5,因此，我們確定用碳酸鉀溶液調(diào)整pH值為 8.6-9.0(實際采用的pH值為8.8)。除此以外，膠體金顆粒的大小、離子強度、均勻程度、以 及hTKl單克隆抗體使用濃度和分子量等也都可能影響膠體金與其結(jié)合的能力。在此PH范圍 內(nèi)，PH偏高,膠體金帶負電荷增加，hTKl單克隆抗體帶正電荷增加，有利于膠體金與hTKl單 克隆抗體結(jié)合物最大限度形成且結(jié)合牢固而穩(wěn)定，但PH偏高,則可能引起膠體金與hTKl單克 隆抗體結(jié)合物的得率降低；而TO偏低，雖然有利于膠體金與hTKl單克隆抗體結(jié)合物的得率提 高，但ra過低，則膠體金聚集的可能性增大,不穩(wěn)定性加大。因此,最后確定的PH值也應(yīng)嚴格 通過實驗結(jié)果確定。第九，在進行膠體金-hTKl單克隆抗體3E8結(jié)合物制備時，須先將hTKl單克隆抗體濃度調(diào) 節(jié)到合適的水平。在向膠體金溶液中加入hTKl單克隆抗體3E8前，須先用碳酸鉀溶液將膠體金 溶液的PH值調(diào)整到8. 6-9. 0,并加入小牛血清白蛋白，這樣標記的效果會更好。因為，小牛血 清可填補膠體金與hTKl單克隆抗體的缺陷,起到良好的封閉效果和固定作用；而在制備含有 抗hTKl單克隆抗體2Ae和兔抗鼠IgG多克隆抗體的硝酸纖維微孔濾膜片(NC)時，則須用 pH7.2-7.4的磷酸鹽(PBS)緩沖液稀釋，同樣含有小牛血清白蛋白，然后用包被機將它們分別包 被于硝酸纖維微孔濾膜片上，并在37。C恒溫浸泡60min,這樣，它們的相互結(jié)合才更加牢固。第十，抗hTKl單克隆抗體2Ae和兔抗鼠IgG多克隆抗體的濃度通常在0. 8-1. 6g/L之間， 其中以1.0g/L較常用。低于L0g/L，可能影響抗原抗體結(jié)合，造成抗原抗體結(jié)合率降低；而高 于1.0g/L可能造成不必要的浪費，或者因為并非是抗原抗體結(jié)合的最佳濃度，反而影響或干 擾抗原抗體的結(jié)合。特別是不同的抗原和抗體，其濃度沒有一致的標準，有些甚至可以用 0. 5g/L.總之,最佳濃度的確定仍必須根據(jù)實驗情況最后決定。第十一，組裝芯片時以加樣孔3為起點，其順序依次為濾樣紙(全血分離膜)、吸水玻 璃纖維紙、聚酯膜(膠體金-抗hTKl單克隆抗體3Es結(jié)合物)、硝酸纖維微孔濾膜(包被有抗hTKl 單克隆抗體2A6和兔抗鼠IgG多克隆抗體)和吸水濾紙，并直接粘貼于白色的PVC塑料片上,且 在此膜片上覆蓋一層保護膜，真空干燥后，剪切，加干燥劑密封，置于陰涼、閉光、干燥、通風 處保存。特別應(yīng)該注意的是，鋪在加樣孔3下面的濾樣紙(全血分離膜)和吸水玻璃纖維紙與 NC膜一樣需要經(jīng)過緩沖液處理，以防止檢測樣品的PH變化過大而影響結(jié)果的重復和準確性。第十二，如檢測標本(全血或血清或血漿)在此乳癌基因蛋白預警芯片層析過快，hTKl尚 未來得及與NC膜上hTKl抗體發(fā)生完全的特異性結(jié)合反應(yīng)，就越過了檢測線2,導致顯色反 應(yīng)不明顯，而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。而且，檢測標本在此乳癌基因蛋白預警芯片層析過快，還會 導致用于對照的質(zhì)控線1很快顯色，而弱陽性標本可能還沒有顯色，檢測者誤認為結(jié)果判斷 時間已到，而而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此，檢測標本移動速度過快并非好事，應(yīng)引起高度重視， 并加以控制。第十三，檢測標本(全血或血清或血漿)過少、或者說通過乳癌基因蛋白預警芯片的檢測 標本不足,導致檢測標本無法達到檢測線2和用于對照的質(zhì)控線1，即無法使檢測標本中的待 測成分(hTKl)無法與NC膜上hTKl單克隆抗體或IgG多克隆抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，以至于造成 無法判讀結(jié)果、或者誤以為預警芯片失效。因此，在實際檢測時，應(yīng)確保有足夠的檢測標本。第十四，檢測標本(全血或血清或血漿)過多，或者檢測標本(全血或血清或血槳)造成外 溢，使得乳癌基因蛋白預警芯片無法有效地阻擋血細胞，從而導致血細胞和血清或血漿一起 向檢測線2移動，造成檢測線2模糊，干擾和影響了結(jié)果判斷，使實驗失敗。第十五，防止冬季使用時的溫度過低現(xiàn)象，因為溫度過低，不僅可使檢測標本(全血或血清或血漿)在此乳癌基因蛋白預警芯片層析減慢，而且還可使抗原抗體特異性結(jié)合的反應(yīng)速度 降低，有時， 一些弱陽性標本的顏色反應(yīng)甚至在30min還不能完全顯示出來。因此，在溫度 較低時，應(yīng)盡可能延長反應(yīng)時間和結(jié)果判斷時間，以免出現(xiàn)假陽性結(jié)果，導致出現(xiàn)誤診或漏診。第十六，使用此乳癌基因蛋白預警芯片，應(yīng)盡可能在潔凈的實驗室內(nèi)進行，并防止灰塵 落在預警芯片上。如此乳癌基因蛋白預警芯片上有灰塵落入，則會影響檢測標本在此乳癌基 因蛋白預警芯片上的移動或擴散速度，致使結(jié)果不能正常觀察或出現(xiàn)結(jié)果判斷失誤。第十七，使用此乳癌基因蛋白預警芯片，應(yīng)盡可能將它放在水平的臺面。臺面不平或歪 斜，也可能影響檢測標本(全血或血清或血漿)在此乳癌基因蛋白預警芯片上的移動或擴散速 度，致使結(jié)果不能正常觀察或出現(xiàn)結(jié)果判斷失誤。第十八，乳癌基因蛋白預警芯片平時應(yīng)置于陰涼、干燥、通風處，且包裝中務(wù)必要放置 干燥劑、并注意隨時更換，以防止預警芯片潮濕。因為，乳癌基因蛋白預警芯片不僅容易被 污染和生長細菌，而且還會導致其完全失效。第十九，實際檢測中有時需要根據(jù)檢測標本(全血或血清或血漿)的情況對標本進行稀釋。 因此，在加入檢測標本后要仔細觀察其移動或擴散的速度。若發(fā)現(xiàn)檢測標本擴散速度很慢或 停止，應(yīng)盡快加入稀釋液，以免加得太晚無法推動。另外，稀釋液也不能加液太多，否則會 將血細胞隨之移動或擴散到檢測線2，造成判斷結(jié)果困難。第十九，乳癌基因蛋白預警芯片可用于室外檢測，但過強陽光容易刺眼而漏診；室外風 力較大也有可能影響標本移動速度而影響結(jié)果的正確判斷。因此，檢測者應(yīng)特別認真和細致 判斷結(jié)果以免造成誤判。本發(fā)明所述的實施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行的描述，并非對本發(fā)明構(gòu)思和 范圍進行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計思想的前題下，本領(lǐng)域中的學者和工程技術(shù)人員對本發(fā) 明的技術(shù)方案作出的各種變型和改進，均應(yīng)落入本發(fā)明的保護范圍，本發(fā)明請求保護的技術(shù) 內(nèi)容，已經(jīng)全部記載在權(quán)利要求書中。
權(quán)利要求
1、一種簡便快速測定人類I型胸苷激酶基因蛋白的乳癌預警芯片，其特征在于所述的乳癌預警芯片4是由一端包被真核表達制備的一抗hTK1單克隆抗體(代號為2A6-McAb)和另一端則包被兔抗鼠IgG多克隆抗體的條狀纖維層析固相載體NC膜、濾樣紙、吸水玻璃纖維紙、及標記有膠體金和二抗hTK1單克隆抗體(代號為3E8-McAb)結(jié)合物的聚酯膜片等依此粘貼于白色PVC塑料片所組成。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種簡便快速測定人類I型胸苷激酶基因蛋白的乳癌預警芯 片的制備方法，其特征在于包括以下步驟一、 制備含有一抗hTKl單克隆抗體2A6-McAb和兔抗鼠IgG多克隆抗體的硝酸纖維微孔 濾膜片1 )將 一 抗hTKl單克隆抗體2A6-McAb和兔抗鼠IgG多克隆抗體分別用 10-20mmol/L, PH7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋成0. 8-1. 6g/L;2) 用抗體包被機將它們分別包被于硝酸纖維微孔濾膜上；3) 將包被有一抗hTKl單克隆抗體McAb和兔抗鼠IgG多克隆抗體的硝酸纖維微孔濾 膜上置于10-20誦ol/L， pH7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液(1-2% BSA)中，于37。C恒溫浸泡60min;4) 再用10-20mmol/L,pH7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，最后置于室溫或真空干燥 后備用。二、 進行hTKl基因蛋白乳癌預警芯片的組裝以膜片正中點的加樣孔3為起點標志,左邊和右邊分別用熱龍膠依次將濾樣紙、吸水玻 璃纖維紙、聚酯膜片(膠體金-二抗hTKl單克隆抗體犯8-McAb結(jié)合物)、包被有一抗hTKl單 克隆抗體2AS-McAb和兔抗鼠IgG多克隆抗體的硝酸纖維微孔濾膜和吸水濾紙粘貼于白色的 PVC塑料片上,并在此膜片上覆蓋一層有效的保護膜；完成貼膜后即可進行真空干燥；最后， 將全部貼好的條板在專用切割機上切成一定規(guī)格的條狀膜片，裝入塑料盒中，加入干燥劑密封 保存，即成乳癌基因蛋白預警芯片4。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種簡便快速測定人類I型胸苷激酶基因蛋白的乳癌預警芯片，其特征在于該納米級的膠體金源于氯金酸(HAuCl》還原劑檸檬酸三鈉(枸櫞酸三鈉)的 作用，其靜電作用使其聚合成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)、且是特定大小、均勻一致的納米金顆 粒；而且，由于其在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與蛋白質(zhì)分子正電荷基團通過靜電牢固結(jié)合，并 不會影響基因蛋白抗原和單克隆抗體蛋白質(zhì)的生物特性。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種簡便快速測定人類I型胸苷激酶基因蛋白的乳癌預警芯 片，其特征在于該乳癌預警芯片4中條狀纖維層析固相載體NC膜上所包被的一抗hTKl單克隆抗體(代號為2ArMcAb)來源于真核所表達制備的人類I型胸苷激酶(hTKl);且聚酯膜 片上標記的膠體金和二抗hTKl單克隆抗體(代號為3E8-McAb)結(jié)合物中的二抗hTKl單克隆 抗體(代號為3E8-McAb)同樣來源于真核所表達制備的人類I型胸苷激酶(hTKl)，但其來源 于不同于一抗hTKl單克隆抗體(代號為2Ae-McAb)的另一陽性克隆株。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種簡便快速測定人類I型胸苷激酶基因蛋白的乳癌預警芯 片，其特征在于這兩種hTKl單克隆抗體雖然同屬于人類I型胸苷激酶(hTKl)單克隆抗體， 對于其相對應(yīng)的抗原均具有同樣的專一性及特異性免疫反應(yīng)，但兩者卻具有不同的結(jié)合位點、親和力及親和常數(shù)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種簡便快速測定人類I型胸苷激酶基因蛋白的乳癌預警芯 片，其特征在于這兩種hTKl單克隆抗體均能與人類I型胸苷激酶(hTKl)基因蛋白抗原發(fā) 生專一性及特異性免疫反應(yīng)，即可形成一抗hTKl單克隆抗體(代號為2A6-McAb)2和二抗hTKl 單克隆抗體(代號為3E8-McAb)同時與與人類I型胸苷激酶(hTKl)基因蛋白抗原結(jié)合的雙 抗夾心免疫復合物結(jié)構(gòu)(Abl-Ag-Ab2)或者說2A6-McAb—hTKl Ag--3E8-McAb雙抗夾心免疫復 合物結(jié)構(gòu)。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種簡便快速測定人類I型胸苷激酶基因蛋白的乳癌預警芯片，其特征在于通過檢測標本自然層析過程中的毛細作用和雙抗夾心抗原的免疫反應(yīng)原理，使被檢測標本中所含相對應(yīng)的乳癌基因蛋白--hTKl抗原同時與一抗hTKl單克隆抗體(代號為2A6-McAb)和二抗hTKl單克隆抗體(代號為3Es-McAb)發(fā)生高度特異性、高度親和性的免疫結(jié)合反應(yīng)，其雙抗夾心免疫復合物結(jié)構(gòu)(Ab1-Ag-Ab2)或2A6-McAb—hTKl Ag—3E8-McAb不斷富集或截留，并通過所標記膠體金的顏色逐漸形成一條清晰可見的有色檢測帶(g卩陽性結(jié)果)。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種簡便快速測定人類I型胸苷激酶基因蛋白的乳癌預警芯 片，其特征在于被檢測標本中所含有的乳癌基因蛋白-hTKl抗原能被其相對應(yīng)的一抗hTKl 單克隆抗體(代號為2A6-McAb)和二抗hTKl單克隆抗體(代號為3ES-McAb)所識別、并迅速 發(fā)生高特異性、高親和性免疫結(jié)合反應(yīng)，證實該被檢測標本中已有乳癌基因蛋白-hTKl表達。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種簡便快速測定人類I型胸苷激酶基因蛋白的乳癌預警芯 片，其特征在于該乳癌基因蛋白-hTKl抗原作為一種激酶是胸苷參與DNA合成的關(guān)鍵酶,它 能可逆性催化胸腺嘧啶脫氧核苷與磷酸脫氧核苷之間的轉(zhuǎn)化，真實而客觀地反映著乳腺細胞 的增殖和癌變狀況。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種簡便快速測定人類I型胸苷激酶基因蛋白的乳癌預警芯 片，其特征在于hTKl在乳腺細胞異常增殖或癌變時不僅加快表達，而且大量表達使其含量 或活性也明顯增高，特別是在乳腺細胞增殖異常旺盛的乳癌患者的體液或血液中更是顯著增 高,且hTKl水平的高低與惡性腫瘤的切除和復發(fā)呈降低和升高的趨勢。
11、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的一種簡便快速測定人類I型胸苷激酶基因蛋白的乳癌預警 芯片，其特征在于乳癌基因蛋白-hTKl在乳癌細胞表達量明顯增多，hTKl的活性在乳癌細胞 大于總量的95%,而在乳腺良性腫瘤和正常健康人的體液或血液中檢測極低或基本檢測不出。
12、 根據(jù)權(quán)利要求11所述的一種簡便快速測定人類I型胸苷激酶基因蛋白的乳癌預警 芯片，其特征在于 一旦被檢測標本中證實有大量乳癌基因蛋白-hTKl表達，則提示該被檢 測者有乳癌發(fā)生的高度風險或者乳腺已患有乳癌病灶。
13、 根據(jù)權(quán)利要求12所述的一種簡便快速測定人類I型胸苷激酶基因蛋白的乳癌預警 芯片，其特征在于將基因工程技術(shù)、膠體金標記顯色技術(shù)、特異性免疫檢測技術(shù)和紙層析 分析技術(shù)等多種方法有機結(jié)合在一起的固相標記及雙抗體夾心免疫層析檢測技術(shù)。
14、根據(jù)權(quán)利要求13所述的一種簡便快速測定人類I型胸苷激酶基因蛋白的乳癌預警芯 片，其特征在于如檢測標本中未含有相對應(yīng)的乳癌基因蛋白-hTKl抗原，則此檢測標本移動 到包被有一抗hTKl單克隆抗體(代號為2AfMcAb)位置，均不會發(fā)生高特異性、高親和性的免 疫結(jié)合反應(yīng)，即在靠近加樣點左右兩條檢測線的位置上不會形成有色檢測帶(即陰性結(jié)果)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種簡便快速測定I型胸苷激酶基因蛋白(hTK1)的乳癌預警芯片。本發(fā)明的特點在于所述的乳癌預警芯片4是由一端包被真核表達制備的一抗hTK1單克隆抗體(代號為2A6-McAb)和另一端則包被兔抗鼠IgG多克隆抗體的條狀纖維層析固相載體NC膜、濾樣紙、吸水玻璃纖維紙、及標記有膠體金和二抗hTK1單克隆抗體(代號為3E8-McAb)結(jié)合物的聚酯膜片等依此粘貼于白色PVC塑料片所組成。本發(fā)明具有微量、快速、靈敏、準確、簡便、穩(wěn)定性好、重復性高、特異性強、無須特殊設(shè)備或儀器、檢測成本低、可單份或多份標本分別測定、且攜帶方便、易于現(xiàn)場或野外普查或體檢等特點和優(yōu)勢。
文檔編號G01N33/577GK101275954SQ20081003128
公開日2008年10月1日 申請日期2008年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月9日
發(fā)明者宇 丁, 丁克祥, 莉 劉, 劉衛(wèi)國, 費定宇 申請人:丁克祥