專利名稱：一種酶催化電導(dǎo)免疫傳感器及其檢測食源性病原體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分析領(lǐng)域，具體涉及一種基于微間隙陣列電極的免疫傳 感器，以及利用該免疫傳感器檢測食品中食源性病原體的方法。
技術(shù)背景食源性病原體是指以食物為載體、導(dǎo)致人類發(fā)生疾病的一大類細(xì)菌與病 毒。近年來，全球食品安全事件頻頻發(fā)生，如美國的"李斯特氏桿菌事件"、曰本的"大腸桿菌0157流行事件"等，對人類健康帶來很大危害，引起各國政府的全力關(guān)注。傳統(tǒng)的檢測方法(如分離培養(yǎng)、生化鑒定等)無法對難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的致病菌進(jìn)行檢測，而且特異性不高、靈敏度低、操作煩瑣耗時，不能實現(xiàn)有效的監(jiān)測、預(yù)防作用。因此，發(fā)展新的快速檢測與鑒定食源性病原體的方法是及時有效地控制和預(yù)防致病菌、病毒傳播的前提。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)食源性病原體檢測技術(shù)靈敏度低、特異性不 高及操作繁瑣耗時等不足，提出了一種酶催化電導(dǎo)免疫傳感器及其檢測食源 性致病菌的方法，具有靈敏度高、特異性好、快速、低成本的特點。本發(fā)明的技術(shù)方案之一是，用于檢測食源性病原體的所述酶催化電導(dǎo)免疫傳感器采用以下步驟制得1、 取常規(guī)光刻印刷法制作的微間隙陣列金電極做基片，它為叉指式雙電 極，正負(fù)電極均為兩個梳形金電極，彼此交叉組成微間隙陣列金電極。梳形齒Di寬為l拜一100iim，間隙D2為I,一IOO,(參見圖1);2、 將所述微間隙陣列金電極進(jìn)行硅烷化處理，過程是a.將所述微間隙陣列金電極用無水乙醇清洗三次，每次0.8min— 1. 2min，b. 將該微間隙陣列金電極浸入1 M的NaOH溶液中28min—32min;然后 超純水清洗該微間隙陣列金電極三次，每次0.8min—1.2min，吹干；c. 將所述微間隙陣列金電極浸入含氨丙基三甲氧基硅垸5% (體積百分 數(shù))的乙醇溶液中，室溫下靜置23小時一25小時；再用超純水清洗三次后 吹干，即得硅烷化的微間隙陣列金電極；以上過程可在微間隙陣列金電極間的基片上形成一氨基硅垸自組裝單層。 3、免疫傳感器的制備步驟.-a. 將所述硅垸化的微間隙陣列金電極浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的戊二醛水溶 液中，室溫下靜置l小時；b. 取出，用超純水清洗三次；在所述電極上滴加30pL食源性病原體的 單克隆抗體溶液，室溫下靜置反應(yīng)1小時；所述單克隆抗體溶液的抗體濃度 為10(Vg/mL，該溶液系將所述單克隆抗體溶于0. OIM、 pH7.4磷酸緩沖溶液 而得；這樣使得抗體通過戊二醛交聯(lián)劑固定在微間隙陣列金電極的基片上；c. 用超純水清洗三次，吹干，得到酶催化電導(dǎo)免疫傳感器；保存于4°C 備用。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是，采用所述酶催化電導(dǎo)免疫傳感器檢測食源性 致病菌的方法采用以下步驟實現(xiàn)1. 將分析物樣品或標(biāo)樣溶液、待測病原體的單抗溶液各20 pL混合后滴 加在所述酶催化電導(dǎo)免疫傳感器上，室溫下靜置反應(yīng)0. 4小時一O. 6小時； 所述分析物樣品或標(biāo)樣溶液系將所述分析物樣品或標(biāo)樣溶于0.01M、 pH 7.4 磷酸緩沖溶液而得，所述待測致病菌的單抗溶液系將所述待測致病菌的單抗 體溶于0. OIM、 pH 7. 4磷酸緩沖溶液而得；由此通過樣品中的分析物將兩種單抗連接起來，在傳感器表面形成單抗 —分析物-單抗的夾心免疫復(fù)合物；2. 在所述傳感器表面滴加2(VL堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體溶液(即堿 性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體溶液，亦即酶標(biāo)二抗)，于室溫下靜置反應(yīng)0.45小時一0.55小時；所述第二抗體溶液是將溶堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體溶于0. 01M、pH 7. 4磷酸緩沖溶液而得；溶液中抗體濃度為1(^g/mL; 此過程中，酶標(biāo)二抗通過與免疫復(fù)合物中的單抗發(fā)生反應(yīng)而被捕獲到傳感器表面上；3.將所述傳感器置于銀沉積溶液中，室溫下靜置反應(yīng)8min—12min;再 由該傳感器獲取與分析物濃度成負(fù)相關(guān)的電導(dǎo)或電阻信號；所述銀沉積溶液 系將lmM抗壞血酸磷酸酯、2mMAgN03溶于0. 1M甘氨酸-NaOH緩沖溶液而得， 溶液pH9.0。所述分析物與待測物為沙門氏菌或大腸桿菌0157:H7等食源性病原體。該步驟中，傳感器表面上堿性磷酸酶催化其底物抗壞血酸磷酸酯水解產(chǎn) 生還原劑抗壞血酸，后者將溶液中銀離子還原成銀金屬并沉積在微間隙陣列 金電極上，使微間隙陣列金電極正負(fù)電極部分導(dǎo)通，從而增大微間隙陣列金 電極的電導(dǎo)(或降低電阻)，獲得與分析物濃度相關(guān)的電導(dǎo)(或電阻)信號。上述步驟的技術(shù)原理是，采用分析物和固定化的單抗以及游離的另一單 抗發(fā)生夾心免疫分析步驟，形成單抗-分析物-單抗免疫復(fù)合物；再利用第二 抗體的酶標(biāo)記催化沉積溶液中底物分解產(chǎn)生導(dǎo)電材料沉積在微間隙陣列金 電極間，改變微間隙陣列金電極正負(fù)電極的電導(dǎo)(或電阻)；通過電導(dǎo)或電 阻檢測測定食源性病原體的濃度。由以上可知，本發(fā)明為一種酶催化電導(dǎo)免疫傳感器及其檢測食源性病原 體的方法，可望為快速檢測與鑒定食源性病原體提供快速、實用、低成本、 高靈敏、高特異的免疫檢測技術(shù)，及時有效地控制和預(yù)防致病菌、病毒的傳 播，其優(yōu)點有1. 微間隙陣列電極制備簡單，可大批量、低成本生產(chǎn)；2. 檢測步驟簡單，檢測時間在lh內(nèi)，檢測所需的儀器可用萬用電表或 自行研制的電阻量測裝置，便攜且價格低廉；3. 本免疫傳感器靈敏度高，可實現(xiàn)10cfu/mL病原體的檢測，且背景干擾很小。


圖l是微間隙陣列電極圖樣(黑色區(qū)域為金膜，白色區(qū)域為裸露的基片)。 掩膜圖樣與此相反(黑色區(qū)域為透明區(qū)，白色區(qū)域為不透明區(qū))。它為叉指 式雙電極，正負(fù)電極均為兩個梳形金電極，彼此通過微米級絕緣間隙交叉組成陣列式金電極。正負(fù)電極的梳形齒數(shù)5至20個，寬為l|am—100p。電極間隙為1,一100拜。
具體實施方式
實施例1:基于微間隙陣列電極的免疫傳感器檢測沙門氏菌。1. 免疫傳感器的制備取常規(guī)光刻印刷法制作的微間隙陣列金電極做基片，它為叉指式雙電 極，正負(fù)電極均為兩個梳形金電極，彼此交叉組成微間隙陣列金電極。梳形齒寬為liim—lOO(im，間隙為1^Lm—100(im;將微間隙陣列金電極用無水乙醇(100%)清洗三次(每次lmin)后， 將電極浸入lM的NaOH溶液中30min;再用超純水清洗電極三次(每次lmin)， 吹干；然后，將電極浸入含氨丙基三甲氧基硅烷5% (體積百分?jǐn)?shù))的乙醇溶 液中，室溫下靜置24小時；用超純水清洗三次后吹干，獲得硅烷化的微間 隙陣列金電極；將硅烷化的微間隙陣列金電極浸入戊二醛水溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%)，室溫 下靜置l小時；用超純水清洗三次后，在電極上滴加30^L抗沙門氏菌的單 克隆抗體溶液(溶液中單抗?jié)舛葹?0(Vg/mL，該溶液系將所述單克隆抗體溶 于0.01M、 pH7.4磷酸緩沖溶液而得)，室溫下靜置反應(yīng)l小時。用超純水 清洗三次后吹干備用。2. 沙門氏菌的檢測將含有沙門氏菌的樣品溶液或標(biāo)樣溶液、單抗溶液各2(VL (所述樣品溶 液或標(biāo)樣溶液、單抗溶液系將相應(yīng)的樣品或標(biāo)樣、單抗溶于0.01M、 pH 7.4磷酸緩沖溶液而得)混合后滴加在免疫傳感器上，室溫下靜置反應(yīng)0. 5小時。然后在傳感器表面滴加2(VL堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗(堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗 鼠IgG抗體)溶液(酶標(biāo)抗體濃度為10pg/mL，系將所述酶標(biāo)二抗溶于0. OIM、 pH 7. 4磷酸緩沖溶液而得)，于室溫下靜置反應(yīng)0. 5小時；將傳感器置于銀 沉積溶液(該銀沉積溶液系將lmM抗壞血酸磷酸酯、2mMAgN03溶于0. 1M甘 氨酸-NaOH緩沖溶液而得，溶液pH9.0)中，室溫下靜置反應(yīng)lOmin;然后， 將免疫傳感器正負(fù)極分別與電化學(xué)工作站(CHI 760C)的工作電極與對電極 (參比電極與對電極復(fù)合)連接，采用線性掃描伏安法在0 50mV電位范圍 檢測，記錄傳感器電流隨電位變化的響應(yīng)曲線，并計算其斜率(即電導(dǎo)值)。 根據(jù)不同濃度沙門氏菌標(biāo)樣的電導(dǎo)值，獲得與濃度相關(guān)的工作曲線。使用所研制的免疫傳感器如上法對20個可能含有沙門氏菌的雞蛋樣品 進(jìn)行測定，根據(jù)樣品的電導(dǎo)響應(yīng)值與工作曲線，求得對應(yīng)的沙門氏菌濃度。 與ELISA方法對照，所研制的免疫傳感器的結(jié)果與ELISA的測定結(jié)果的符合 率為100%。實施例2:基于微間隙陣列電極的免疫傳感器檢測大腸桿菌0157:H7。 1.免疫傳感器的制備取常規(guī)光刻印刷法制作的微間隙陣列金電極做基片，它為叉指式雙電 極，正負(fù)電極均為兩個梳形金電極，彼此交叉組成微間隙陣列金電極。梳形 齒寬為liim—lOOiam，間隙為lpm—100iam;將微間隙陣列金電極用無水乙醇(100%)清洗三次(每次lmin)后， 將電極浸入1 M的NaOH溶液中30min。再用超純水清洗電極三次(每次lmin)， 吹干。然后，將電極浸入含氨丙基三甲氧基硅垸5% (體積百分?jǐn)?shù))的乙醇溶 液中，室溫下靜置24小時；用超純水清洗三次后吹干，獲得硅垸化的微間 隙陣列金電極；將硅烷化的微間隙陣列金電極浸入戊二醛水溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%)，室溫 下靜置1小時;用超純水清洗三次后，在電極上滴加3(VL抗大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體溶液(溶液中抗體濃度為100昭/mL，該溶液系將所述單克隆抗 體溶于0.01M、 pH7.4磷酸緩沖溶液而得)，室溫下靜置反應(yīng)l小時；用超 純水清洗三次后吹干備用。2.大腸桿菌0157:H7的檢測-將大腸桿菌0157:H7的標(biāo)樣溶液或樣品溶液、另一單抗溶液各20pL (所 述標(biāo)樣溶液或樣品溶液、另一單抗溶液系將相應(yīng)的標(biāo)樣或樣品、另一單抗溶 于0.01M、 pH7.4磷酸緩沖溶液而得)混合后滴加在免疫傳感器上，室溫下 靜置反應(yīng)0. 5小時；然后在傳感器表面滴加20pL堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗(堿 性磷酸酶標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體)溶液(溶液中酶標(biāo)抗體濃度為lCVg/mL，該 溶液系將所述酶標(biāo)二抗溶于O.OIM、 pH 7.4磷酸緩沖溶液而得)，于室溫下 靜置反應(yīng)0.5小時；將傳感器置于銀沉積溶液(lmM抗壞血酸磷酸酯，2mM AgN03的0. 1M甘氨酸-NaOH緩沖溶液，pH9. 0)中，室溫下靜置反應(yīng)10min;按照實施案例l的方法測定傳感器的電導(dǎo)，得到工作曲線，傳感器的電導(dǎo)在 10cfu/mL 10000cfu/mL范圍內(nèi)與大腸桿菌0157:H7濃度呈線性相關(guān)。使用所研制的免疫傳感器如上法對20個可能含有大腸桿菌0157:H7的 樣品進(jìn)行測定，根據(jù)樣品的電導(dǎo)響應(yīng)值與工作曲線，求得對應(yīng)的大腸桿菌 0157:H7濃度。與ELISA方法對照，所研制的免疫傳感器的結(jié)果與ELISA的 測定結(jié)果的符合率為100。％。微間隙陣列金電極的制備采用傳統(tǒng)(常規(guī))的光刻印刷方法:在清潔的 4X6mm的基片(石英、普通陶瓷或玻璃材料)上用甩膠機上涂上一層光刻膠 (正膠)，轉(zhuǎn)速3000r/min， 80。C烘15min。在光刻機中將掩膜版與基片對 準(zhǔn)，紫外曝光將掩膜版上的圖形轉(zhuǎn)移到基片上。顯影去掉曝光部分的光刻膠， 氮氣流吹干后，采用真空濺射在基片上依次噴涂30nm厚的Ti層和120nm厚 的Au層。然后用有機溶劑氯仿除去基片上的感光膠后，即可得到微間隙陣 列金電極。其中單個金帶寬度及相鄰兩根金帶之間的寬度可根據(jù)需要，在l 100 um之間調(diào)整。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測食源性病原體的酶催化電導(dǎo)免疫傳感器，其特征是，它采用以下步驟制得(1)取常規(guī)光刻印刷法制作的微間隙陣列金電極做基片，它為叉指式雙電極，正負(fù)電極均為兩個梳形金電極，彼此交叉組成微間隙陣列金電極。梳形齒寬為1μm-100μm，間隙為1μm-100μm；；(2)將所述微間隙陣列金電極進(jìn)行硅烷化處理，過程是a.將所述微間隙陣列金電極用無水乙醇清洗三次，每次0.8min-1.2min，b.將該微間隙陣列金電極浸入1M的NaOH溶液中28min-32min；然后超純水清洗該微間隙陣列金電極三次，每次0.8min-1.2min，吹干；c.將所述微間隙陣列金電極浸入含氨丙基三甲氧基硅烷5％(體積百分?jǐn)?shù))的乙醇溶液中，室溫下靜置23小時-25小時；再用超純水清洗三次后吹干，即得硅烷化的微間隙陣列金電極；(3)免疫傳感器的制備步驟a.將所述硅烷化的微間隙陣列金電極浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的戊二醛水溶液中，室溫下靜置1小時；b.取出，用超純水清洗三次；在所述電極上滴加30μL食源性致病菌的單克隆抗體溶液，室溫下靜置反應(yīng)1小時；所述單抗?jié)舛葹?00μg/mL，該單抗溶液是將單抗溶于0.01M、pH 7.4磷酸緩沖溶液而得；c.用超純水清洗三次，吹干，得到酶催化電導(dǎo)免疫傳感器。
2、 一種采用權(quán)利要求1所述酶催化電導(dǎo)免疫傳感器檢測食源性致病菌 的方法，其特征是，該方法采用以下步驟實現(xiàn)(1)將分析物樣品或標(biāo)樣溶液、待測物的單抗溶液各20pL混合后滴加 在所述酶催化電導(dǎo)免疫傳感器上，室溫下靜置反應(yīng)0.4小時一0.6小時；所用為0.01M、 pH 7.4磷酸緩沖溶液；(2) 在所述傳感器表面滴加2(VL堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體溶 液，抗體濃度為10昭/mL，于室溫下靜置反應(yīng)0.45小時一0.55小時；所述 抗體溶液是將溶堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體溶于0. OIM、 pH 7. 4磷酸 緩沖溶液而得；(3) 將所述傳感器置于銀沉積溶液中，室溫下靜置反應(yīng)8min—12min; 再由該傳感器獲取與分析物濃度相關(guān)的電導(dǎo)或電阻信號；所述銀沉積溶液系 將lmM抗壞血酸磷酸酯、2mM AgN03溶于0. 1M甘氨酸-NaOH緩沖溶液而得， 溶液pH9.0。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述酶催化電導(dǎo)免疫傳感器檢測食源性病原體的方 法，其特征是，所述分析物與待測物為沙門氏菌或大腸桿菌0157:H7等食源 性病原體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測食源性病原體的微間隙電極陣列免疫傳感器，包括微間隙陣列電極、硅烷化處理的電極基片、具有良好導(dǎo)電性的酶沉積物及基于電導(dǎo)檢測的酶聯(lián)免疫傳感器及檢測方法。本發(fā)明利用微間隙電極陣列免疫傳感器，對沙門氏菌和大腸桿菌O157:H7進(jìn)行檢測，該方法靈敏度高，特異性高，操作簡單，儀器便攜且價格低廉，可望為檢測與鑒定食源性致病菌提供快速、實用、低成本、高靈敏、高通量的免疫檢測技術(shù)，及時有效地控制和預(yù)防食源性疾病的傳播。
文檔編號G01N27/327GK101275950SQ20081003132
公開日2008年10月1日 申請日期2008年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月16日
發(fā)明者俞汝勤, 霞 楚, 沈國勵, 蔣健暉, 勇 黃 申請人:湖南大學(xué)