專利名稱：糖尿病遺傳檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)個(gè)體糖尿病遺傳易感性的試劑盒， 通過(guò)同時(shí)檢測(cè)與糖尿病密切相關(guān)的脂聯(lián)素基因(ADIP0Q)、白介素6基因(IL-6)、脂蛋A脂酶基因(LPL)、 維生素D受體基因(VDR)上的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型來(lái)評(píng)估個(gè)體糖尿病遺傳易感性。
背景技術(shù)：
糖尿病是由于胰島素分泌不足或相對(duì)不足以及發(fā)生胰島素抵抗，引起糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì) 等一系列代謝紊亂的疾病。臨床以高血糖為主要標(biāo)志，通常表現(xiàn)為"三多一少"，即多食、多尿、多飲、 體重減輕。病情嚴(yán)重時(shí)可發(fā)生急性代謝紊亂如酮癥酸中毒等。
糖尿病雖不直接致命，但久病可引起多個(gè)系統(tǒng)損害。常見并發(fā)癥有肺結(jié)核、化膿性皮膚病、高脂血癥、 動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、腎病、白內(nèi)障、眼底視網(wǎng)膜病變及神經(jīng)病變，許多并發(fā)癥不僅會(huì)嚴(yán)重影響生活質(zhì) 量，還有較高的致死率。目前我國(guó)糖尿病爆發(fā)性流行的形勢(shì)十分嚴(yán)峻，由于大眾生活水平的提高，很多人 不注意保持良好生活習(xí)慣，飲食無(wú)度，使得近年來(lái)糖尿病發(fā)病率迅速攀升。據(jù)人S'日?qǐng)?bào)報(bào)道，我國(guó)糖尿病 發(fā)病率約5%，患者人數(shù)居世界第二位。
ADIPOQ基因主要在脂肪組織中表達(dá)，編碼一種在結(jié)構(gòu)上與膠原X和VI以及補(bǔ)體Clq類似的蛋白質(zhì)， 進(jìn)入血液循環(huán)。當(dāng)攜帶風(fēng)險(xiǎn)基因型時(shí)，ADIPOQ基因表達(dá)量可能會(huì)降低，引起血漿脂聯(lián)素濃度偏低，脂肪 酸氧化減少，影響機(jī)體的胰島素敏感性。同時(shí)，骨骼肌胰島素受體酪氨酸磷酸化作用減弱，易導(dǎo)致全身胰 島素敏感性下降，產(chǎn)生胰島素抵抗，使糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)增加。
IL-6基因編碼的白介素6是細(xì)胞因子家族中的成員，作為一種前炎性細(xì)胞因子，它可由多種細(xì)胞產(chǎn)豐， 基礎(chǔ)狀態(tài)下血漿中IL-6水平主要來(lái)自脂肪組織分泌，作為一種自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌激素刺激肝細(xì)胞生
成多種急性時(shí)相的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，參與體內(nèi)的脂肪、葡萄糖等能量代謝，誘導(dǎo)胰島素抵抗，破壞e
胰島細(xì)胞，在糖尿病發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。因此，當(dāng)IL-6過(guò)量表達(dá)時(shí)，會(huì)引起胰島素抵抗，從而誘發(fā) 糖尿病。當(dāng)攜帶風(fēng)險(xiǎn)基因型時(shí)，白細(xì)胞介素6表達(dá)增加，影響脂肪代謝，干擾胰島素信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，降低 胰島素敏感性，引起胰島素抵抗，導(dǎo)致糖尿病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。
,LPL基因主要在心臟、肌肉和脂肪組織中表達(dá)，其編碼的脂蛋白脂酶能夠催化極低密度脂蛋白或者低 密度脂蛋白的水解，參與脂質(zhì)代謝的通路。該基因的變異在嚴(yán)重的情況下可以導(dǎo)致I型高脂蛋白血癥，而 較輕程度下則引起體內(nèi)脂蛋白代謝紊亂，從而干擾胰島素的作用，引發(fā)糖尿病。當(dāng)'攜帶風(fēng)險(xiǎn)基因型時(shí)，脂 蛋白脂酶活性偏低，血脂整體升高，乳糜微粒和極低密度脂蛋白水平升高，低密度脂蛋白和高密度脂蛋白 水平降低，易引起體內(nèi)脂蛋白代謝紊亂，從而誘發(fā)糖尿病。
VDR編碼維生素D3的核激素受體，不僅分布在腸、骨、腎，還分布于甲狀旁腺、胰島細(xì)胞、造血干 細(xì)胞、活化的淋巴細(xì)胞等。該蛋白與維生素.D結(jié)合，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，主要通過(guò)一系列代謝反應(yīng)通路， 包括免疫反應(yīng)和腫瘤激活通路，具有調(diào)控維生素D生理活性的作用。該基因的突變會(huì)導(dǎo)致維生素D活性
的下降，減弱細(xì)胞免疫應(yīng)答能力，削弱胰島e細(xì)胞的再生和修復(fù)能力，使胰島素分泌下降，誘發(fā)糖尿病， 當(dāng)出現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)基因型時(shí)，維生素D的活性作用降低，對(duì)胰島e細(xì)胞的保護(hù)作用降低，胰島素分泌量下降，易
引發(fā)糖尿病。

發(fā)明內(nèi)容
基于脂聯(lián)素基因(ADIP0Q)、白介素6基因(IL-6)、脂蛋白脂酶基因(LPL)、維生素D受體基因(VDR) 上的4個(gè)SNP位點(diǎn)多態(tài)性可用來(lái)評(píng)估個(gè)體糖尿病遺傳易感性的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測(cè)個(gè)體糖尿病遺 傳易感性的試劑盒。
該試劑盒包括
檢測(cè)ADIPOQ基因上Glyl5Gly SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)； 檢測(cè)IL-6基因上G-572C SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)； 檢測(cè)LPL基因上PvuII SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)；檢測(cè)VDR基因上Fokl SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)； 熒光定量PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應(yīng)緩沖液、去離子水等)。 本試劑盒中所述的引物對(duì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成設(shè)計(jì)的，并可用常螺,的合成技術(shù)進(jìn)行合成。 本試劑盒中所述的特異性熒光探針對(duì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成設(shè)計(jì)的，'特異性熒光探針對(duì)可用 常規(guī)的探針合成技術(shù)進(jìn)行合成。
本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括
10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液4^1，
25mM dNTP混合液0.4^1,
25mM MgC12溶液2. 4^1，
5units/jil Taq DNA聚合酶0. 01^1，
20幽特異性引物對(duì)每條引物各0.225nl,
IOMM特異性熒光探針對(duì)每條探針各0.25^,
去離子水21.3^1。 本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-2(TC 。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī) 條件，或按照廠商所建議的條件。
實(shí)施例l.檢測(cè)試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取
用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。 步驟2:熒光定量PCR反應(yīng)
使用檢測(cè)試劑盒中的熒光定量PCR套裝，分別進(jìn)行4次獨(dú)立的熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)的體系為 總體積1(^1,包含濃度為20ng/jxl的DNA模板2^1、 lpl 10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、0. lpl 25mM dNTP. 混合液、0.6nl 25mM MgCl2溶液、0.025^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、20-的有義引物和反義引物 各0.225^1、 KHiM的帶VIC熒光探針和帶FAM熒光探針各0.25^1，去離子水5.325^1。
在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為5(TC、 2分鐘，95'C、 IO分鐘，進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的95'C、 30秒， 60'C、 l分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。
步驟4:基因型分析
根據(jù)試劑盒使用說(shuō)明書標(biāo)示的基因分型圖示對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析。
熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)辨識(shí)熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量，根 據(jù)不同序列探針VIC和FAM熒光信號(hào)的強(qiáng)弱即可確定所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)的基因型。
實(shí)施例2.應(yīng)用檢測(cè)試劑盒進(jìn)行個(gè)體糖尿病遺傳易感性檢測(cè)的服務(wù) 步驟l: DNA提取
由醫(yī)院檢驗(yàn)科醫(yī)師指導(dǎo)被檢者使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用硅膠吸附法進(jìn)行口腔上皮 細(xì)胞的DNA抽提。
步驟2:基因分型檢測(cè)
使用本發(fā)明提供的試劑盒，對(duì)被檢測(cè)者基因組DNA的ADIPOQ基因上Glyl5GlySNP位點(diǎn)、IL-6基因上 G-572C SNP位點(diǎn)、LPL基因上PvuII SNP位點(diǎn)和VDR基因上Fokl SNP位點(diǎn)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，確定 這4個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型。步驟3:個(gè)體糖尿病遺傳易感性的分析
通過(guò)對(duì)被檢測(cè)者SNP基因型的分析，出具個(gè)體糖尿病遺傳易感性的分析報(bào)告單。報(bào)告中詳細(xì)說(shuō)明了被 檢測(cè)者糖尿病遺傳風(fēng)險(xiǎn)的高低，并由醫(yī)師向被檢者詳細(xì)說(shuō)明和解讀個(gè)體糖尿病遺傳易感性分析報(bào)告單。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)個(gè)體糖尿病遺傳易感性的試劑盒，其特征在于包括同時(shí)檢測(cè)脂聯(lián)素基因(ADIPOQ)上Gly15Gly SNP位點(diǎn)、白介素6基因(IL-6)上G-572C SNP位點(diǎn)、脂蛋白脂酶基因(LPL)上PvuII SNP位點(diǎn)、維生素D受體基因(VDR)上FokI SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括10 X熒光定量PCR反應(yīng) 緩沖液糾，25mMdNTP混合液0.糾，25mMMgC12溶液2. 4W， 5unitsAa Taq DMA聚合酶0.01W， 20141 特異性引物對(duì)每條引物各0.225W， IOMM特異性熒光探針對(duì)每條探針各0.25W，去離子水21.3W。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)糖尿病遺傳風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)脂聯(lián)素基因(ADIPOQ)、白介素6基因(IL-6)、脂蛋白脂酶基因(LPL)、維生素D受體基因(VDR)上的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、熒光定量PCR常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過(guò)同時(shí)檢測(cè)與糖尿病遺傳風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)的基因上的多態(tài)性位點(diǎn)基因型來(lái)評(píng)估個(gè)體糖尿病遺傳風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101608222SQ20081003926
公開日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2008年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月20日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請(qǐng)人:上海主健生物工程有限公司