專利名稱：：呋喃西林代謝物(sem)快速檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測(cè)分析動(dòng)物源性食品中獸藥殘留的技術(shù)，特別是檢測(cè)呋喃西林的酶聯(lián)免疫試劑及方法。
背景技術(shù)：
：硝基呋喃類藥物因有非常好的抗菌作用和藥動(dòng)力學(xué)的特性，曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用，作為禽類、水產(chǎn)和豬促生長的添加劑。但在長時(shí)間的實(shí)驗(yàn)研究過程中發(fā)現(xiàn)，硝基呋喃類藥物和代謝物(SEM)均可以使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生癌變和基因突變，正因?yàn)槿绱瞬艑?dǎo)致此類藥物禁止在治療和飼料中使用，呋喃西林在1995年被禁用。由于硝基呋喃類藥物在體內(nèi)很快就能被代謝，而在組織中結(jié)合的代謝產(chǎn)物則能存留較長的一段時(shí)間，所以在分析此類藥物的殘留時(shí)經(jīng)常要分析其代謝后的產(chǎn)物，管理部門就以檢測(cè)代謝產(chǎn)物為手段達(dá)到檢測(cè)硝基呋喃類殘留的目的。用來檢測(cè)呋喃西林代謝物的最常用方法是LC-UV，LC-MS和LC-MS/MS，但是這幾種方法檢測(cè)相對(duì)繁瑣，對(duì)儀器要求較高，不適合大量樣本的快速檢測(cè)。酶聯(lián)免疫方法結(jié)合了色譜技術(shù)，采用SEM衍生物的特異性抗體，具有很高的準(zhǔn)確度和靈敏度，并且操作簡便、檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)樣本量大。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、費(fèi)用低廉、適用于大量樣本篩查的檢測(cè)呋喃西林代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒及方法。本發(fā)明的檢測(cè)原理當(dāng)包被原為呋喃西林代謝物衍生物偶聯(lián)抗原時(shí)是將呋喃西林代謝物衍生物半抗原與牛丙種球蛋白偶聯(lián)物(SEM-BGG)吸附于固相載體上，加入樣本或呋喃西林代謝物衍生物標(biāo)準(zhǔn)品，然后加呋喃西林代謝物特異性抗體，待測(cè)樣品中殘留的呋喃西林代謝物(經(jīng)前處理衍生化以后)和酶標(biāo)板上包被的呋喃西林代謝物衍生物抗原競(jìng)爭(zhēng)呋喃西林代謝物衍生物特異性抗體。再加入酶標(biāo)記抗抗體進(jìn)行酶活性的放大作用，顯色后終止，測(cè)定樣品的吸光度值，該值與樣品中呋喃西林代謝物殘留量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出呋喃西林代謝物的濃度。包被原為抗抗體時(shí)是將抗抗體吸附于固相載體上，加入呋喃西林代謝物衍生物特異性抗體，再加入呋喃西林代謝物衍生物酶標(biāo)記抗原和樣本或呋喃西林代謝物衍生物標(biāo)準(zhǔn)品溶液，待測(cè)樣本中殘留的呋喃西林代謝物(經(jīng)前處理衍生化以后)和酶標(biāo)記呋喃西林代謝物衍生物抗原競(jìng)爭(zhēng)呋喃西林代謝物衍生物特異性抗體，顯色后終止，測(cè)定樣品的吸光度值，該值與樣品中呋喃西林代謝物殘留量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出呋喃西林代謝物的濃度，與標(biāo)準(zhǔn)溶液顏色比較則可判斷樣品中呋喃西林代謝物的濃度范圍。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)動(dòng)物源性食品中呋喃西林代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒，它含有(1)包被呋喃西林代謝物衍生物抗原的酶聯(lián)板或包被抗抗體的酶聯(lián)板；(2)酶標(biāo)記物；(3)呋喃西林代謝物衍生物特異性抗體；(4)呋喃西林代謝物衍生物標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(5)底物顯色液；(6)終止液；(7)濃縮洗滌液；(8)濃縮復(fù)溶液。本發(fā)明所述試劑盒中呋喃西林代謝物衍生物包被抗原是采用活潑酯法將呋喃西林代謝物衍生物半抗原與牛丙種球蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到的，抗抗體可為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體，羊抗鼠抗抗體是以鼠源抗體為免疫原對(duì)無病原體山羊進(jìn)行免疫得到，羊抗兔抗抗體是以兔源抗體為免疫原對(duì)無病原體山羊進(jìn)行免疫得到。制備酶聯(lián)板過程中所用的包被緩沖液為pH值9.6、0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液;包被呋喃西林代謝物衍生物抗原或抗抗體的載體物質(zhì)可為聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等；載體的形式可以是試管、微量反應(yīng)板凹孔、小珠、小圓片等；所用的洗滌液為含有0.1%~0.5%吐溫80，0.5%疊氮化鈉(NaN3)防腐劑的磷酸鹽緩沖液；所用的封閉液是含有8%~15%的脫脂奶和1%惰性蛋白的溶液。本發(fā)明所述試劑盒中包被呋喃西林代謝物衍生物抗原的酶聯(lián)板或包被抗抗體的酶聯(lián)板的制備步驟為(1)用包被緩沖液將呋喃西林代謝物衍生物半抗原與牛丙種球蛋白(BGG)偶聯(lián)物或抗抗體以0.02~0.08pg/ml濃度稀釋成抗原稀釋液或抗抗體稀釋液；(2)向酶聯(lián)板的每孔中加入100^1已經(jīng)稀釋好的抗原稀釋液或抗抗體稀釋液，37'C溫育6h，傾去包被液，用洗滌液洗滌4次，每次1530s，拍干；(3)向酶聯(lián)板的每孔中加入150200nl封閉液，37'C溫育l2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。以上方法制備的酶聯(lián)板具有很好的穩(wěn)定性，經(jīng)過冷熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，酶聯(lián)板的相關(guān)技術(shù)參數(shù)均在正常范圍，且包被原有良好的特異性。本發(fā)明所述試劑盒中酵標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)記呋喃西林代謝物衍生物抗原，所用酶可為過氧化物酶或半乳糖甘酶，本發(fā)明優(yōu)選過氧化物酶；酶標(biāo)記物形式可為凍干粉、濃縮液和工作液；酶標(biāo)記物工作液所用的稀釋液為含有50n/。甘油(可防止放入-2(TC環(huán)境的酶標(biāo)記物凍結(jié)，亦可長時(shí)間保持酶標(biāo)記物的生物活性)、1%的疊氮化鈉防腐劑(便于保存)的溶液。本發(fā)明所述試劑盒中酶標(biāo)記抗抗體的制備步驟為(1)抗抗體的制備以鼠源性抗體為免疫原對(duì)無病原體山羊迸行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；或以兔源性抗體為免疫原對(duì)無病原體山羊進(jìn)行免疫，得到羊抗兔抗抗體。(2)過氧化物酶標(biāo)記抗抗體的制備將抗抗體與過氧化物酶(HRP)進(jìn)行偶聯(lián)，采用的方法是戊二醛法，采用戊二醛法使得抗抗體與辣根過氧化物酶的結(jié)合率升高，傳統(tǒng)GA—步法偶聯(lián)反應(yīng)不易控制，反應(yīng)速度快的分子易發(fā)生自生聚合，且偶聯(lián)效率不高。為了解決這些問題，我們將一步法進(jìn)行了改進(jìn)，克服了一步法的缺點(diǎn)。首先在被偶聯(lián)的兩種分子中，與偶聯(lián)劑反映較弱的分子先用過量的偶連劑活化，然后去處多余的偶連劑；第二步將一端與某種分子連接的偶連劑，通過改變反應(yīng)條件而與另一種分子連接起來。二步法雖然操作較繁，但偶連效率提高，而且形成的同分子聚合物減少。本發(fā)明所述試劑盒中酶標(biāo)記抗原是采用活性酯法將標(biāo)記酶與呋喃西林代謝物半抗原進(jìn)行偶聯(lián)得到。本發(fā)明所述試劑盒中呋喃西林代謝物衍生物特異性抗體為鼠源單克隆抗體或兔源多克隆抗體，免疫原是采用活潑酯法將呋喃西林代謝物衍生物半抗原與鑰孔槭血藍(lán)蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到的；抗體形式可為凍干粉、濃縮液、工作液；抗體稀釋液為pH值8.2、0.05mol/L、含有3%小牛血清和596oN，N，-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明所述試劑盒中呋喃西林代謝物衍生物特異性抗體可為單克隆抗體或多克隆抗體，其制備方法如下(l)呋喃西林代謝物衍生物單克隆抗體制備的步驟為a.動(dòng)物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動(dòng)物，免疫原(呋喃西林代謝物衍生物半抗原與鑰孔槭血藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物)免疫劑量為80100pg/只，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔2~3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，四免后腹腔加強(qiáng)免疫一次，3天后取脾細(xì)胞；b.細(xì)胞融合與克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按510:1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔，利用有限稀釋法對(duì)陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；C.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇取處于對(duì)數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成l5xl06個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存，復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37'C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)；d.單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7~14天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5><105~106個(gè)/只，7~10天后采集腹水，用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，小瓶分裝，-20°<:保存；e.抗體凍干粉可將腹水在37'C環(huán)境下烘干，放入-2(TC保存；f.抗體工作液是用抗體稀釋液將抗體以0.02~0.08ng/ml濃度進(jìn)行稀釋。(2)呋喃西林代謝物衍生物多克隆抗體制備的步驟為采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，免疫原(呋喃西林代謝物衍生物半抗原與鑰孔槭血藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物)免疫劑量為lmg/kg，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔34周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7~10天后采血，測(cè)定血清抗體效價(jià)，心臟采血，經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀得到純化的多克隆抗體。本發(fā)明所述試劑盒中當(dāng)標(biāo)記酶為過氧化物酶時(shí)底物顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲、底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽或氨基水楊酸、終止液為0.1~0.5mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶為半乳糖甘酶時(shí)，底物顯色液為0.5mol/L磷酸鉀緩沖液，終止液為2mol/L的檸檬酸緩沖液濃縮洗滌液為含有0.1%~0.5%吐溫80，0.5%疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液；濃縮復(fù)溶液為含1%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明所述試劑盒中呋喃西林代謝物衍生物標(biāo)準(zhǔn)品溶液為六個(gè)濃度梯度的呋喃西林代謝物衍生物溶液，呋喃西林代謝物衍生物稀釋液為含有1%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明所述試劑盒中試劑的配制具體為a.呋喃西林代謝物衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液呋喃西林代謝物衍生物系列標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，濃度為0ng/L、0.05ng/L、0.15ng/L、0.45pg/L、1.35ng/L、4.05ng/L，l~3ml/瓶。b.包被緩沖液pH值為9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液。c.封閉液含有8%~15%的脫脂奶和1%惰性蛋白的溶液。d.濃縮洗滌液濃縮洗滌液為含有0.1%~0.5%吐溫80，0.5%疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液(0.01M、pH7.4)，為正常使用濃度的1525倍，3050ml/瓶，1瓶。e.酶標(biāo)記物酶標(biāo)記抗抗體工作液或酶標(biāo)記呋喃西林代謝物衍生物抗原工作液，712ml/瓶，l瓶。f.底物顯色液A液過氧化氫或過氧化脲；g.底物顯色液B液鄰苯二胺(OPD)或四甲基聯(lián)苯胺(TMB);h.底物顯色液對(duì)硝基磷酸鹽緩沖液pH8.1、含有MgCl20.01。/。的訓(xùn)mmolTris-HCl;i.終止液12mol/L硫酸、鹽酸或2mol/L氫氧化鈉緩沖液，58ml/瓶，1瓶。j.抗體稀釋液pH8.2的0.05mol/L、含有3%小牛血清和596oN,N'-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖液。k.濃縮復(fù)溶液含有50%甲醇、P/。小牛血清(BSA)的磷酸鹽緩沖液，為正常使用濃度的510倍，3050ml/瓶，1瓶。1.抗體溶液抗體工作液本發(fā)明所述檢測(cè)動(dòng)物源性食品中呋喃西林代謝物的方法，包括了以下步驟(1)樣品前處理；(2)用本發(fā)明所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)；(3)分析檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明中樣品前處理方法為樣本前處理需配制用去離子水將2x濃縮復(fù)溶液按l:l稀釋，用于樣本提取后的復(fù)溶。C液(供奶樣用)稱12.5g亞硝基鐵氰化鉀用去離子水定溶至100ml。D液(供奶樣用)稱29.8g硫酸鋅用去離子水溶解定溶至100ml。0.1MK2HPO4稱22.8gK2HPCV3H20加去離子水溶解定溶至1L。1MHC1取8.6ml濃HC1加水定溶至100ml。1MNaOH稱取4gNaOH加水定溶至100ml。a.肉樣或魚蟲下取l±0.05g的均質(zhì)樣本(肉樣/魚蝦)加入4ml的去離子水，0.5ml1MHC1和100pl衍生化試劑，充分振蕩；置于72X:孵育(大約24h);分別加入5ml0.1MK2HP04，0.4ml1MNaOH和5ml的乙酸乙酯，充分振蕩30s;在室溫下(20~25°C)4000r/min以上離心lOmin;取出2.5ml的乙酸乙酯到另一潔凈容器中于5(TC氮?dú)?空氣吹干；用lml正己垸溶解干燥物，用1ml已稀釋好的復(fù)溶液充分混合；在室溫下(20~25'C)4000r/min以上離心lOmin;取50^1下層相用于分析。樣本稀釋倍數(shù)-2本法的優(yōu)點(diǎn)在于提高了衍生化的溫度，使反應(yīng)時(shí)間大大縮短。b.奶樣取出5ml的奶樣本到玻璃離心管中，分別加入C液和D液各25(^1:用振蕩器充分混合樣本，用恒溫離心機(jī)4000r/min以上離心10min(4~12°C)，若沒有恒溫離心機(jī)，則先將樣本降溫至大約8'C,然后離心；取離心上清液1.1ml(相當(dāng)lml奶樣)，分別加入4ml的去離子水，0.5ml1MHC1和lOOpl衍生化試劑，充分振蕩；置于72"孵育(大約2~4h);分別加入5ml0.1MK2HPO4，0.4ml1MNaOH和5ml的乙酸乙酯，充分振蕩30s;在室溫下(20~25°C)4000r/min以上離心lOmin;取出2.5ml的乙酸乙酯到另一潔凈容器中于5(TC氮?dú)?空氣吹干用lml正己烷溶解干燥物，用lml已稀釋好的復(fù)溶液充分混合；在室溫下(20~25°C)4000r/min以上離心lOmin;取50nl下層相用于分析。樣本稀釋倍數(shù)2c.蜂蜜取l士0.05g樣本到離心管中；加入4ml的去離子水溶解,再加入0.5ml1MHC1和lOOpl衍生化試劑,充分振蕩；2.置于72'C孵育(大約2~4h);分別加入5ml0.1MK2HPO4，0.4ml1MNaOH和5ml的乙酸乙酯，充分振蕩30s;在室溫下(20~25°C)4000r/min以上離心lOmin;取出2.5ml的乙酸乙酯到另一潔凈容器中于5(TC氮?dú)?空氣吹干；用lml正己烷溶解干燥物，用lml已稀釋好的復(fù)溶液充分混合；在室溫下(20~25°C)4000r/min以上離心lOmin。樣本稀釋倍數(shù)2d蛋類稱取制備好的雞蛋樣本2g，加入到50ml離心管中，分別加入4ml水，0.5mllMHCl，200^1C液，振蕩混勻；加入200jilD液，充分振蕩5min，室溫(2025。C)3000g以上離心lOmin;取全部上清液，加入200nl衍生化試劑，充分振蕩，5(TC水浴2h(中間每半個(gè)小時(shí)劇烈振蕩1~2分鐘)；分別加入5ml0.1MK2HPO4,0.4ml1MNaOH5ml乙酸乙酯，劇烈振蕩30s，室溫(20~25°C)4000r/min以上離心10min;取2.5ml上層有機(jī)相于50'C下氮?dú)獯蹈?；加入lml正己烷溶解干燥物；加入2ml稀釋后的復(fù)溶液，振蕩10s，4000r/min以上離心10min(如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，請(qǐng)于6(TC水浴中加熱5min，再重復(fù)離心)；除去上層有機(jī)相；取下層水相50nl用于分析。(2)用本發(fā)明所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)1)從^C冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室溫(20~25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。2)取出需要數(shù)量的微孔及框架，將不用的微孔放入自封袋，保存于28。C。3)配液將40ml濃縮洗滌液(20倍濃縮)用蒸餾水或去離子水稀釋至800ml備用(或按需要量稀釋)。4)編號(hào)將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。5)加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本5(Hil/孔到各自的微孔中，然后加抗體50nl/孔，用蓋板膜封板，輕輕震蕩混勻。37r環(huán)境中反應(yīng)30min。6)取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250^1/孔洗板4~5次，每次間隔10秒，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。7)每孔加入酶標(biāo)記物IOOW，蓋板膜蓋板后置37t:環(huán)境中反應(yīng)30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗，4~5遍(同上)，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。8)顯色每孔加入底物A液50nl，再加底物B液5(HU，輕輕振蕩混勻，37"C環(huán)境中避光顯色15min。9)測(cè)定每孔加入終止液50nl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測(cè)，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))，測(cè)定每孔OD值。(3)分析檢測(cè)結(jié)果結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第l種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與SEM的含量成負(fù)相關(guān)。1)定性判定用樣品的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出樣本所含SEM濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣品1的吸光度值為0.268，樣品2的吸光度值為1.230，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是Oppb為1.671;0.05ppb為1.425;0.15ppb為1.103;0.45ppb為0.567;1.35ppb為0.205;4.05ppb為0.104。則樣品1的濃度范圍是0.45ppb-1.35ppb;樣品2的濃度范圍是0.05ppb"0.15ppb。(再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù))2)定量判定所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(Bo)再乘以100%，即百分吸光度值。百分吸光度值(％)=2x100%B^標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值B(T"0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以SEM標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/ml)的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中SEM實(shí)際濃度。圖1是呋喃西林代謝物的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其中橫坐標(biāo)表示呋喃西林代謝物藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/L),縱坐標(biāo)表示標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明迸行說明，但本發(fā)明不局限于以下幾種具體實(shí)施例。實(shí)施例1檢測(cè)呋喃西林代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒組分的制備1.抗原的合成a.包被原的合成將呋喃西林代謝物采用衍生物法合成呋喃西林4t謝物衍生物半抗原，再將半抗原通過重氮化反應(yīng)和牛丙種球蛋白載體蛋白用活潑酯法進(jìn)行偶聯(lián)得到。b.免疫原的合成將呋喃西林代謝物采用衍生物法合成呋喃西林代謝物衍生物半抗原，再將半抗原通過重氮化反應(yīng)和鑰孔槭血藍(lán)蛋白載體蛋白用活潑酯法進(jìn)行偶聯(lián)得到。2.呋喃西林代謝物衍生物鼠單克隆抗體的制備a.動(dòng)物免疫采用Balb/c小鼠作為免疫動(dòng)物，以呋喃西林代謝物衍生物半抗原與鑰孔槭血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為300pg/只，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔2周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，四免后腹腔加強(qiáng)免疫一次，3天后取脾細(xì)胞。b.細(xì)胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按5:1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。c.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇取處于對(duì)數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成5xl()S個(gè)/rnl的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37。C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。d.單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將8周齡的Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5xl()S個(gè)/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，小瓶分裝，2(TC保存。3.呋喃西林代謝物衍生物兔多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以呋喃西林代謝物衍生物半抗原與鑰孔槭血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為3mg/kg，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7天后采血，測(cè)定血清抗體效價(jià)，心臟采血，經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀得到純化的多克隆抗體。4.酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液將羊抗兔抗抗體稀釋成0.06ng/ml，每孔加入100nl，37'C溫育6h，傾去包被液，用洗滌液洗滌4次，每次lmin，拍干，然后在每孔中加入150^1封閉液，37t溫育lh，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。實(shí)施例2檢測(cè)呋喃西林代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建組建檢測(cè)呋喃西林代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被呋喃西林代謝物衍生物抗原的酶聯(lián)板；(2)用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體；(3)呋喃西林代謝物衍生物鼠單克隆抗體；(4)呋喃西林代謝物標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0pg/L、0.05pg/L、0.15pg/L、0.45pg/L、1.35ng/L、4.05嗎/L;(5)底物顯色液A液為過氧化氫，底物顯色液B液為鄰苯二胺；(6)終止液為2mol/L。的硫酸緩沖液；(7)濃縮洗滌液為pH7.4，含有0.1%~0.5°/。吐溫80，0.5%疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液；(8)抗體稀釋液為pH值8.2、0.05mol/L、含有3%小牛血清和596。N,N，-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖液；(9)濃縮復(fù)溶液為含有50%甲醇、P/。小牛血清(BSA)的磷酸鹽緩沖液。實(shí)施例3檢測(cè)呋喃西林代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒的的組建組建檢測(cè)呋喃西林代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被羊抗兔抗抗體的酶聯(lián)板；(2)用堿性磷酸酯酶標(biāo)記的呋喃西林代謝物衍生物抗原；(3)呋喃西林代謝物衍生物兔多克隆抗體；(4)呋喃西林代謝物衍生物標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為Opg/L、0.05pg/L、0.15pg/L、0.45嗎/L、1.35嗎/L、4.05ng/L;(5)底物顯色液對(duì)硝基磷酸鹽緩沖液；(6)終止液為2mol/L的氫氧化鈉緩沖液；(7)濃縮洗漆液為PH7.4，含有0.8%吐溫20和0.P/。疊氮化鈉(NaN3)防腐劑的磷酸鹽緩沖液；(8)濃縮復(fù)溶液為含有50%甲醇、P/。小牛血清(BSA)的磷酸鹽緩沖液。實(shí)施例4樣品中呋喃西林代謝物殘留的檢測(cè)1.樣品前處理取lg魚蝦的均質(zhì)物，依次加入4ml的蒸餾水，0.5mllM的HC1和100pl10mM的2-硝基苯甲醛，充分振蕩。超聲振蕩1小時(shí)后于72'C孵育3小時(shí)，分別加入5ml0.1MK2HP04，0.4ml1MNaOH和5ml的乙酸乙酯，劇烈振蕩30秒鐘在室溫下(2025")離心，轉(zhuǎn)速為3000rpm。取出2.5ml的乙酸乙酯層蒸干，用lml的正己垸溶解干燥物，用lml的復(fù)溶液適當(dāng)?shù)幕旌?。在室?2025-C)、3000rpm離心。用50nl的下層液體進(jìn)行分析。2.用試劑盒檢測(cè)向呋喃西林代謝物衍生物偶聯(lián)抗原包被的96孔酶標(biāo)板微孔中加系列標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液(各2孔)50pl，再加入呋喃西林代謝物衍生物抗體工作液50nl，用蓋板膜封板，37'C恒溫箱中反應(yīng)30min。倒出孔中液體，每孔加入250W濃縮洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體10(^1，用蓋板膜封板，37'C恒溫箱中反應(yīng)30min，重復(fù)洗滌工作。加入底物顯色液A液過氧化氫50nl，再加B液鄰苯二胺50nl，輕輕振蕩混勻，37t:恒溫箱避光顯色15min。每孔加入終止液2mol/L。硫酸50-，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度值。3.檢測(cè)結(jié)果分析用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度平均值(B)，除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液(O標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(Bo)，再乘以100%，得到百分吸光度值。以呋喃西林代謝物濃度的半對(duì)數(shù)為x軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，將樣品溶液的百分吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品溶液中呋喃西林代謝物所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣品溶液中呋喃西林代謝物的實(shí)際濃度。實(shí)施例5樣品中呋喃西林代謝物殘留的檢測(cè)1.樣品前處理取2ml牛奶，將其置5000rpm離心10min，除去上層脂肪，取下層50^1，試劑盒所提供的復(fù)溶液按l:40倍稀釋。2.用試劑盒檢測(cè)向羊抗兔抗抗體包被的96孔酶標(biāo)板微孔中加入呋喃西林代謝物衍生物兔多克隆抗體工作液10(^1，用蓋板膜封板，37'C恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，每孔加入250nl濃縮洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。每孔加入細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶標(biāo)記的呋喃西林代謝物衍生物抗原5(^1，再加入系列標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液50^1，用蓋板膜封板，37'C恒溫箱中反應(yīng)30min，重復(fù)洗滌過程。加入對(duì)硝基磷酸鹽緩沖液100nl，輕輕振蕩混勻，37。C恒溫箱避光顯色30min。每孔加入終止液2mol/L。氫氧化鈉50^1，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度值。3.檢測(cè)結(jié)果分析用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液(O標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(Bo)再乘以100%，得到百分吸光度值。以呋喃西林代謝物衍生物濃度(Hg/L)的半對(duì)數(shù)為x軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，將樣品溶液的百分吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品溶液所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣品溶液中呋喃西林代謝物實(shí)際濃度。實(shí)驗(yàn)例1標(biāo)準(zhǔn)品精密度試驗(yàn)在雞肉、蝦肉、蜂蜜和牛奶中，將呋喃西林代謝物添加至終濃度為0.5pg/kg，lpg/kg，2ng/kg。每種樣品，每個(gè)濃度各5個(gè)平行。測(cè)定3批。計(jì)算平均值、添加回收率及批內(nèi)批間變異系數(shù)，結(jié)果見表l。表1準(zhǔn)確度和精密度的測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>從表1可知，測(cè)定三批試劑盒，每批試劑盒測(cè)定結(jié)果取均值計(jì)算顯示，呋喃64.0—80.0%之間；在蟲下樣本中添加濃度0.5ng/kg、1(jg/kg和2ng/kg時(shí)的回收率均在76.0—102%之間；在蜂蜜樣本中添加濃度0.5ng/kg、lpg/kg和2(ig/kg時(shí)的回收率均在80.0—100.0%之間；在牛奶樣本中添加濃度0.5pg/kg、lng/kg和2pg/kg時(shí)的回收率均在70.0—88.0%之間；各添加濃度的批內(nèi)變異系數(shù)為7.5%—16.6%，均低于13%。批間變異系數(shù)為9.6~25.2%，均低于20%。結(jié)果表明魚蟲下、肌肉添加的回收率在73.4%~92.8%之間，牛奶添加回收率在73.5%~86.1%之間。實(shí)驗(yàn)例2樣本可重復(fù)性試驗(yàn)以0.5pg/L，濃度的呋喃西林代謝物對(duì)魚蝦、肌肉和牛奶，添加到樣品中，分別取三個(gè)不同批次的試劑盒各五個(gè)，每個(gè)濃度重復(fù)5次，分別計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果見表2、表3。表2魚蝦、肌肉樣品可重復(fù)性試_批號(hào)實(shí)測(cè)值pg/L變異系數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>0.40.30.30.30.416.10.30.30.30.40.416.1060.40.40.30.30.316.10.40.40.40.50.410.6結(jié)果表明魚蝦、肌肉樣本變異系數(shù)均低于20%，牛奶樣本的變異系數(shù)均低于20%，符合了變異系數(shù)小于25%的規(guī)定，說明本試劑盒測(cè)定樣本的精密度達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)例3抗體效價(jià)實(shí)驗(yàn)一、用KLH偶聯(lián)的免疫原制備出的抗體，經(jīng)過效價(jià)的測(cè)定結(jié)果如下表表4用間接法測(cè)定鑰孔書或血藍(lán)蛋白(KLH)制備的抗原抗體效價(jià)抗體稀釋倍數(shù)—抗原稀釋倍數(shù)1:30001:60001:卯001:120001:3000承承承承3.4122.9562.5411:60003.4113.1152.5422.1241:90003.0122.9422.2201.9561:120002.8562.5322.0421.804表5用間接法測(cè)定牛血清白蛋白(BSA)制備的抗原抗體效價(jià)抗體稀釋倍數(shù)-抗原稀釋倍數(shù)1:30001:60001:90001:120001:30003.0222.9562.6952.1231:60002.5622.4562.3242.1241:90002.1142.0211,9561.6231:120001.8621.4401.3210.975表6用間接法測(cè)定卵清蛋白(OVA)制備的抗原抗體效價(jià)抗原稀釋倍數(shù)抗體稀釋倍數(shù)-1:30001:60001:90001:120001:30002.3422.2852.1452.0021:60002.1401.9561.7421.3421:90001.8561.6521.2440.9541:120001.3421.0240.8530.563~~根據(jù)方陣滴定原理，采用間接ELISA法測(cè)定三種抗原抗體的效價(jià)。效價(jià);稱滴度，是在給定的測(cè)定條件下有效抗體濃度的量度，一般以最大稀釋倍數(shù)表示?？贵w滴度越高則說明有效抗體濃度越高，質(zhì)量越好。從表4，表5，表6中可以看出，用鑰孔槭血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)的免疫原，抗原抗體的效價(jià)都要好過其他兩種，當(dāng)抗原為1:12000時(shí)，KLH的抗體效價(jià)為1:12000，而BSA和OVA的則為l:7000和1:4000。因此本發(fā)明選用KLH所制備的抗體。二、ICso的測(cè)定ICso是指產(chǎn)生50%抑制率(B/BQ=0.5)所需的半抗原量，IC5o是反映抗體對(duì)不同半抗原的相對(duì)親和性和半抗原競(jìng)爭(zhēng)質(zhì)量的重要參數(shù)。IC50越小，方法靈敏度越高，對(duì)低濃度樣品測(cè)定的準(zhǔn)確讀越高。將KLH偶聯(lián)、BSA偶聯(lián)和OVA偶聯(lián)制備的三種抗體分別做間接競(jìng)爭(zhēng)性EUSA，分別測(cè)定它們的ICs。，結(jié)果見表7，表6和表7。用KLH偶聯(lián)的抗原制備的抗體的IC5Q為0.22ng/ml,而用BSA和OVA偶聯(lián)的抗原制備的抗體的ICso則分別為0.892ng/ml和5.3ng/ml。表7三種偶聯(lián)蛋白制備的抗體的IC:偶聯(lián)的蛋白KLHBSAOVAIC50(ng/ml)0.23-0.470.8-1.15-9三、抗體的特異性是指抗體對(duì)待測(cè)物的識(shí)別能力，強(qiáng)調(diào)抗體與待測(cè)物間結(jié)合反應(yīng)的專一性和對(duì)結(jié)構(gòu)相近或相關(guān)物質(zhì)的區(qū)分能力。特異性取決于待測(cè)物與其他物質(zhì)的交叉反應(yīng)。在競(jìng)爭(zhēng)分析中，不同物質(zhì)的交叉反應(yīng)率可用如下公式計(jì)算交叉反應(yīng)率(％)=IC50(競(jìng)爭(zhēng)物)/IC5Q(待測(cè)物)*100表8用KLH蛋白偶聯(lián)的抗原制備的抗體的交叉反應(yīng)率化合物交叉反應(yīng)率(％)呋喃西林代謝物100呋喃唑酮代謝物0.01呋喃它酮代謝物0.01呋喃妥因代謝物0.01KLH偶聯(lián)、BSA偶聯(lián)和OVA偶聯(lián)制備的三種抗體分別做間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA，分別測(cè)定它們的交叉反應(yīng)率，結(jié)果見表8，用KLH偶聯(lián)的抗原制備的抗體與呋喃西林代謝物交叉率為100%，與呋喃唑酮代謝物、呋喃它酮代謝物、呋喃妥因代謝物沒有交叉反應(yīng)性；KLH偶聯(lián)蛋白制備的抗體的特異性遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于BSA和OVA。驗(yàn)例4試劑盒的靈敏度按50%抑制法評(píng)價(jià)結(jié)果根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，測(cè)定5次50%抑制濃度，計(jì)算平均值和波動(dòng)范圍。結(jié)果見表1。表9IC50計(jì)算結(jié)果<table>complextableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>山表9可知，綠詩源試劑盒IC5。平均值為0.367ng/kg，波動(dòng)范圍在0.280.47fig/kg之間。其他試劑盒ICw平均值為0.7ng/kg,波動(dòng)范圍在0.450.8ng/kg之間。(2)按最低檢測(cè)限評(píng)價(jià)樣品的最低檢測(cè)限是靈敏度的一個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，分別測(cè)定了雞肉、蜂蜜、蝦、牛奶各20個(gè)空白樣品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出測(cè)定值，計(jì)算出其平均值，再加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差，即為最低檢測(cè)限，測(cè)得檢測(cè)下限分別為。具體實(shí)驗(yàn)雞肉為43.5ng/kg，蜂蜜為47.1ng/kg，蝦為49.8ng/kg，牛奶為47.8ng/kg。結(jié)果見表10-13表10空白雞肉測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表ng/kg<table>complextableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>權(quán)利要求1.一種呋喃西林代謝物(SEM)快速檢測(cè)試劑盒，包括(1)包被有包被原的酶聯(lián)板；(2)酶標(biāo)記物；(3)呋喃西林代謝物衍生物特異性抗體；(4)呋喃西林代謝物衍生物標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(5)底物顯色液；(6)終止液；(7)濃縮洗滌液；(8)濃縮復(fù)溶液；所述酶聯(lián)板中包被的包被原為呋喃西林代謝物衍生物抗原或包被抗抗體，其特征在于呋喃西林代謝物衍生物包被抗原是采用活潑酯法將呋喃西林代謝物衍生物半抗原與牛丙種球蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到，所述抗體為多克隆抗體或者單克隆抗體，多克隆抗體為呋喃西林代謝物衍生物半抗原與鑰孔槭血藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物免疫鼠或者兔得到，單克隆抗體采用細(xì)胞融合和克隆化得到，抗抗體可為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體，羊抗鼠抗抗體是以鼠源抗體為免疫原對(duì)無病原體山羊進(jìn)行免疫得到，羊抗兔抗抗體是以兔源抗體為免疫原對(duì)無病原體山羊進(jìn)行免疫得到。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于酶標(biāo)記物為嗨標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)記呋喃西林代謝物衍生物抗原，所用酶可為過氧化物酶或半乳糖甘酶，酶標(biāo)記物形式可為凍干粉、濃縮液和工作液，酶標(biāo)記抗原采用活性酯法將標(biāo)記酶與呋喃西林代謝物半抗原進(jìn)行偶聯(lián)得到。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于標(biāo)記酶為過氧化物酶時(shí)底物顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲、底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽或氨基水楊酸、終止液為0.10.5mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶為半乳糖甘酶時(shí)，底物顯色液為0.5mol/L磷酸鉀緩沖液，終止液為2mol/L的檸檬酸緩沖液；濃縮洗滌液為含有0.1%~0.5%吐溫80，0.5%疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液濃縮復(fù)溶液為含1%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的試劑盒，其特征在于呋喃西林代謝物衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0pg/L、0.05ng/L、0.15ng/L、0.45pg/L、1.35pg/L、4.05pg/L。5.—種檢測(cè)動(dòng)物源性食品中呋喃西林代謝物的方法，包括了以下步驟(l辨品前處理；(2)用權(quán)利要求1-4任一所述的試劑盒的試劑迸行檢測(cè)；(3)分析檢測(cè)結(jié)果。6.如權(quán)利要求5所述的檢測(cè)動(dòng)物源性食品中呋喃西林代謝物的方法，其特征是，向呋喃西林代謝物衍生物偶聯(lián)抗原包被的酶標(biāo)板微孔中加樣本溶液，再加入呋喃西林代謝物衍生物抗體工作液，用蓋板膜封板，37'C恒溫反應(yīng)，倒出孔中液體，加入濃縮洗滌液，拍干，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗抗體，用蓋板膜封板，37°C恒溫反應(yīng)，加入底物顯色液，37"C恒溫避光顯色，加入終止液，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度值。全文摘要本發(fā)明提供了一種檢測(cè)呋喃西林代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒，它含有包被有包被原的酶聯(lián)板；酶標(biāo)記物；呋喃西林代謝物衍生物特異性抗體；呋喃西林代謝物衍生物標(biāo)準(zhǔn)品溶液；底物顯色液；終止液；濃縮洗滌液；濃縮復(fù)溶液。呋喃西林代謝物衍生物包被抗原是采用活潑酯法將呋喃西林代謝物衍生物半抗原與牛丙種球蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到，所述抗體為多克隆抗體或者單克隆抗體。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)動(dòng)物源性食品中呋喃西林代謝物的方法，包括了以下步驟樣品前處理；用試劑盒的試劑進(jìn)行檢測(cè)；分析檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、費(fèi)用低廉、適用于大量樣本篩查的檢測(cè)動(dòng)物源性食品呋喃西林代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒及檢測(cè)方法。文檔編號(hào)G01N33/577GK101349695SQ200810042038公開日2009年1月21日申請(qǐng)日期2008年8月25日優(yōu)先權(quán)日2008年8月25日發(fā)明者青吳,俊唐,成李,宏楊,楊宗繁,溫俊梅,聶繼斌,欣齊申請(qǐng)人:深圳市綠詩源生物技術(shù)有限公司