專利名稱：：一種檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫和獸藥殘留檢測分析
技術(shù)領(lǐng)域：
中的一種檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑及方法。
背景技術(shù)：
：氯霉素(chloramphenicol,CAP)是第一個(gè)采用化學(xué)合成法生產(chǎn)的抗生素，對多種病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用。由于其效高價(jià)廉，曾被廣泛應(yīng)用于各類家禽、家畜、蜜蜂和水產(chǎn)品的各種傳染病的防治。然而，氯霉素存在著嚴(yán)重的毒副作用，能引起人的再生障礙性貧血、粒狀白細(xì)胞缺癥以及新生兒、早產(chǎn)兒灰色綜合癥等，對人類健康構(gòu)成巨大的潛在威脅[12]。因此，氯霉素殘留問題已引起國際組織和許多國家及地區(qū)的高度重視。歐盟、美國等發(fā)達(dá)國家已相繼禁止氯霉素用于動物源性食品，并明確規(guī)定氯霉素殘留限量為不得檢出。目前國內(nèi)外的氯霉素檢測技術(shù)方法主要有微生物法、放射免疫法、氣相色譜法(GC)、液相色譜法(HPLC)、質(zhì)譜分析等,這些方法各有優(yōu)劣,而酶聯(lián)免疫法(ELISA)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高，樣品預(yù)處理簡單，檢測時(shí)間短、檢測樣本量大等優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的檢測原理當(dāng)包被原為氯霉素偶聯(lián)抗原時(shí)是將氯霉素半抗原與牛丙種球蛋白偶聯(lián)物(CAP-BGG)吸附于固相載體上，加入樣本或氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，然后加氯霉素特異性抗體，待測樣品中殘留的氯霉素和酶標(biāo)板上包被的氯霉素抗原競爭氯霉素特異性抗體。再加入酶標(biāo)記抗抗體進(jìn)行酶活性的放大作用，顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中氯霉素殘留量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出氯霉素的濃度。包被原為抗抗體時(shí)是將抗抗體吸附于固相載體上，加入氯霉素特異性抗體，再加入氯霉素酶標(biāo)記抗原和樣本或氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，待測樣本中殘留的氯霉素和酶標(biāo)記氯霉素抗原競爭氯霉素特異性抗體，顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中氯霉素殘留量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出氯霉素的濃度，與標(biāo)準(zhǔn)溶液顏色比較則可判斷樣品中氯霉素的濃度范圍。本發(fā)明提供了一種檢測動物源性食品中氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，它含有(1)包被氯霉素抗原的酶聯(lián)板或包被抗抗體的酶聯(lián)板；(2)酶標(biāo)記物；(3)氯霉素特異性抗體；(4)氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(5)底物顯色液；(6)終止液；(7)濃縮洗滌液；(8)濃縮復(fù)溶液。本發(fā)明所述試劑盒中氯霉素包被抗原是采用活潑酯法將氯霉素半抗原與牛丙種球蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到的，抗抗體可為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體，羊抗鼠抗抗體是以鼠源抗體為免疫原對無病原體山羊進(jìn)行免疫得到，羊抗兔抗抗體是以兔源抗體為免疫原對無病原體山羊進(jìn)行免疫得到。制備酶聯(lián)板過程中所用的包被緩沖液為批pH值9.6、0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液；包被氯霉素抗原或抗抗體的載體物質(zhì)可為聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等；載體的形式可以是試管、微量反應(yīng)板凹孔、小珠、小圓片等；所用的洗滌液為去離子水或三蒸水；所用的封閉液是含有8%15%的馬血清和1%惰性蛋白的溶液。本發(fā)明所述試劑盒中包被氯霉素抗原的酶聯(lián)板或包被抗抗體的酶聯(lián)板的制備步驟為(1)用包被緩沖液將氯霉素半抗原與牛丙種球蛋白(BGG)偶聯(lián)物或抗抗體以0.02~0.08pg/ml濃度稀釋成抗原稀釋液或抗抗體稀釋液；(2)向酶聯(lián)板的每孔中加入10(^1已經(jīng)稀釋好的抗原稀釋液或抗抗體稀釋液，37'C溫育2h，傾去包被液，用洗滌液洗滌4次，每次15~30s，拍干；(3)向酶聯(lián)板的每孔中加入150~200[il封閉液，37。C溫育12h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。以上方法制備的酶聯(lián)板具有很好的穩(wěn)定性，經(jīng)過冷熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，酶聯(lián)板的相關(guān)技術(shù)參數(shù)均在正常范圍，且包被原有良好的特異性。本發(fā)明所述試劑盒中酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)記氯霉素抗原，所用酶可為過氧化物酶或半乳糖甘酶，本發(fā)明優(yōu)選過氧化物酶；酶標(biāo)記物形式可為凍干粉、濃縮液和工作液；酶標(biāo)記物工作液所用的稀釋液為含有50。/。甘油(可防止放入-2(TC環(huán)境的酶標(biāo)記物凍結(jié)，亦可長時(shí)間保持酶標(biāo)記物的生物活性)、1%的疊氮化鈉防腐劑(便于保存)的溶液。本發(fā)明所述試劑盒中酶標(biāo)記抗抗體的制備步驟為(1)抗抗體的制備以鼠源性抗體為免疫原對無病原體山羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；或以兔源性抗體為免疫原對無病原體山羊進(jìn)行免疫，得到羊抗兔抗抗體。(2)過氧化物酶標(biāo)記抗抗體的制備將抗抗體與過氧化物酶(HRP)進(jìn)行偶聯(lián)，釆用的方法是戊二醛法，采用戊二醛法使得抗抗體與辣根過氧化物酶的結(jié)合率升高，傳統(tǒng)GA—步法偶聯(lián)反應(yīng)不易控制，反應(yīng)速度快的分子易發(fā)生自生聚合，且偶聯(lián)效率不高。為了解決這些問題，我們將一步法進(jìn)行了改進(jìn)，克服了一步法的缺點(diǎn)。首先在被偶聯(lián)的兩種分子中，與偶聯(lián)劑反映較弱的分子先用過量的偶連劑活化，然后去處多余的偶連劑；第二步將一端與某種分子連接的偶連劑，通過改變反應(yīng)條件而與另一種分子連接起來。二步法雖然操作較繁，但偶連效率提高，而且形成的同分子聚合物減少。本發(fā)明所述試劑盒中酶標(biāo)記抗原是采用活性酯法將標(biāo)記酶與氯霉素半抗原進(jìn)行偶聯(lián)得到。本發(fā)明所述試劑盒中氯霉素特異性抗體為鼠源單克隆抗體或兔源多克隆抗體，免疫原是采用活潑酯法將氯霉素半抗原與鑰孔槭血藍(lán)蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到的；抗體形式可為凍干粉、濃縮液、工作液；抗體稀釋液為pH值8.2、0.05mol/L、含有3%馬血清和5%0明膠的磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明所述試劑盒中氯霉素特異性抗體可為單克隆抗體或多克隆抗體，其制備方法如下(1)氯霉素單克隆抗體制備的步驟為a.動物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動物，免疫原(氯霉素半抗原與鑰孔槭血藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物)免疫劑量為80100^ig/只，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔2~3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，四免后腹腔加強(qiáng)免疫一次，3天后取脾細(xì)胞；b.細(xì)胞融合與克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按5~10:1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔，利用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；c.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇取處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成1~5><106個(gè)/1111的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存，復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37'C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)；d.單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，714天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5夂105~106個(gè)/只，710天后釆集腹水，用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，小瓶分裝，-2(TC保存；e.抗體凍干粉可將腹水在37'C環(huán)境下烘干，放入-2(TC保存；f.抗體工作液是用抗體稀釋液將抗體以0.020.08pg/ml濃度進(jìn)行稀釋。(2)氯霉素多克隆抗體制備的步驟為采用新西蘭大白兔作為免疫動物，免疫原(氯霉素半抗原與鑰孔槭血藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物)免疫劑量為lmg/kg，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔34周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫710天后采血，測定血清抗體效價(jià)，心臟采血，經(jīng)硫酸銨分級沉淀得到純化的多克隆抗體。本發(fā)明所述試劑盒中當(dāng)標(biāo)記酶為過氧化物酶時(shí)底物顯色液為過氧化氫或過氧化脲、四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽混合溶液、終止液為0.10.5mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶為半乳糖甘酶時(shí)，底物顯色液為0.5mol/L磷酸鉀緩沖液，終止液為2mol/L的檸檬酸緩沖液；濃縮洗滌液為去離子水或三蒸水；濃縮復(fù)溶液為去離子水或三蒸水。本發(fā)明所述試劑盒中氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液為六個(gè)濃度梯度的氯霉素溶液，氯霉素稀釋液為去離子水或三蒸水。本發(fā)明所述試劑盒中試劑的配制具體為a.氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液氯霉素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，濃度為0ng/L、0.025pg/L、0.05pg/L、0.15|ug/L、0.45pg/L、1.35pg/L，13ml/瓶。b.包被緩沖液pH值為9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液。c.封閉液8%~15%的馬血清和1%惰性蛋白的溶液。d.濃縮洗滌液去離子水或三蒸水3050ml/瓶，l瓶。e.酶標(biāo)記物酶標(biāo)記抗抗體工作液或酶標(biāo)記氯霉素抗原工作液，712ml/瓶，l瓶。f.底物顯色液為過氧化氫或過氧化脲與鄰苯二胺(OPD)或四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的混合液；g.終止液12mol/L硫酸、鹽酸或2mol/L氫氧化鈉緩沖液，5~8ml/瓶，1瓶。h.抗體工作稀釋液為pH值8.2、0.05mol/L、含有3%馬血清和5%。明膠的磷酸鹽緩沖液。i.濃縮復(fù)溶液去離子水或三蒸水，3050ml/瓶，l瓶。本發(fā)明所述檢測動物源性食品中氯霉素的方法，包括了以下步驟-(1)樣品前處理；(2)用本發(fā)明所述的試劑盒進(jìn)行檢測；(3)分析檢測結(jié)果。本發(fā)明中樣品前處理方法為樣本前處理需配制配液l:C液(牛奶樣本使用)0.36M亞硝基鐵氰化鈉(Na2Fe(CN)5'NO2H20)10.7g亞硝基鐵氰化鈉加去離子水100ml溶解配液2:D液(牛奶樣本使用)1M硫酸鋅(ZnS(V7H20)28.8g硫酸鋅加去離子水100ml溶解配液3:(尿樣本使用)pH4.8100mM醋酸鈉緩沖液，稱2.4g醋酸鈉、1.2ml醋酸加去離子水500ml溶解混合配液4:乙腈-水溶液V乙腈VH20=84:16配液5:將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1:l稀釋。(用于抗體的稀釋和樣本提取后的復(fù)溶)(a)組織(雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚等)前處理方法1、用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；2、稱3士0.05g樣本于離心管中，先加入3ml去離子水充分混勻再加入6ml乙酸乙酯，振蕩10min，室溫4000r/min以上，離心10min;3、取出2ml上層液體(約相當(dāng)于lg的樣本)在氮?dú)饬?0-60°C水浴中干燥；4、加入lml正己烷溶解干燥的殘留物，再加lml稀釋后的復(fù)溶液強(qiáng)烈振蕩lmin，室溫4000r/min以上離心15min。5、取50nl下層相用于分析。樣本稀釋倍數(shù)1(b)血清血漿1、取lml血清或血漿至試管中，力卩2ml乙酸乙酯振蕩lmin;2、靜置使水相與有機(jī)相分層或室溫4000r/min離心5min;3、移取上層的乙酸乙酯至另一試管中，用氮?dú)饬?(TC水浴中干燥；4、殘留物用lml稀釋后的復(fù)溶液溶解；5、取50pl用于分析。(c)尿液1、移取2ml尿液到離心管中，加pH4.8100mM醋酸鈉緩沖液0.5ml混合；2、力Q40^1葡萄糖苷酸酶(Merck,ArtNo.4n4)到稀釋的尿液中，在37'C水解至少2小時(shí)(或過夜)；3、該溶液恢復(fù)至室溫后加入8ml乙酸乙酯混合lmin;4、室溫4000r/min離心10min，取出4ml上層液體在氮?dú)庀?060°C干燥；5、用lml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物；6、取50pl用于分析。(d)蜂蜜1、取2土0.05g蜂蜜，放入離心管中，用4ml去離子水溶解；2、加入4ml乙酸乙酯上下振蕩10min;3、室溫4000r/min以上離心10min;4、移取lml上層乙酸乙酯(相當(dāng)于0.5g樣本)到另一離心管中，50-6(TC氮?dú)饬飨赂稍铮?、用0.5ml稀釋后的復(fù)溶液溶解；6、取50nl用于分析。e)腸衣1、用均質(zhì)器均質(zhì)樣本注干樣本需剪碎(長度不超5mm)后再均質(zhì)，濕樣本需用去離子水漂洗20min以上(去除表面的鹽份)，瀝干后再進(jìn)行均質(zhì)。2、稱l土0.05g均質(zhì)后的樣本于離心管中，加入10ml乙酸乙酯，振蕩10min，室溫4000r/min以上，離心10min。3、取出5ml上層液體(相當(dāng)于0.5g的樣本)在氮?dú)饬飨?0-60。C干燥。4、加入lml正己烷溶解干燥的殘留物，再加0.5ml稀釋后的復(fù)溶液強(qiáng)烈振蕩lmin，室溫4000r/min以上，離心5min。5、去上層相，取下層50pl用于分析。(f)牛奶和奶粉牛奶樣本處理方法一1、牛奶樣本，10°C4000r/min以上離心10min，吸除上層脂肪；2、取5ml去除脂肪奶樣至離心管中，加入150nlC液出現(xiàn)沉淀，短暫振蕩后加入150plD液混合；3、15°C4000r/min以上，離心10min，移取上層液；4、用稀釋后的復(fù)溶液以等體積稀釋上層液；5、取50^il用于分析。注如果離心后仍然渾濁，再重復(fù)沉淀過程。牛奶樣本處理方法二1、取5ml去除脂肪奶樣至離心管中；2、加入250plC液和250plD液徹底混合，4-12°C4000r/min以上離心10min。如果沒有冷凍離心機(jī)，請預(yù)先將樣本冷卻到8。C;3、轉(zhuǎn)移出2.2ml上層液(相當(dāng)于2ml奶樣)至一個(gè)新的離心管中，加入4ml乙酸乙酯上下振蕩10min;4、室溫(20-25°C)4000r/min以上離心10min;5、轉(zhuǎn)移出2ml乙酸乙酯上層液體(相當(dāng)于lml奶樣)，60°C氮?dú)饬飨峦耆稍铮?、用0.5ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物；7、取50W用于分析。由于陰性樣本可能會產(chǎn)生背景干擾(在某些情況下干擾數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn)2到3之間)，所以推薦標(biāo)準(zhǔn)3作為陽性結(jié)果的CUTOFF判斷值。奶粉樣本處理方法1、稱2士0.05g奶粉至離心管中，加入10ml去離子水，振蕩溶解；2、力BlmlC液和lmlD液徹底混合。4-12°C4000r/min以上離心10min。若無冷凍離心機(jī)，請預(yù)先將樣本冷卻到8"C;3、轉(zhuǎn)移出3.6ml上層液(相當(dāng)于0.6g奶粉)至一個(gè)新的離心管中，加入6ml乙酸乙酯上下來回振蕩10min;4、室溫(20-25°C)4000r/min以上離心10min;5、轉(zhuǎn)移出4ml乙酸乙酯上層液體(相當(dāng)于0.4g奶粉)，60°C氮?dú)饬飨峦耆稍铮?、用0.4ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物；7、取50pl用于分析。由于陰性樣本可能會產(chǎn)生背景干擾(在某些情況下干擾數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn)2到3之間)，所以推薦標(biāo)準(zhǔn)3作為陽性結(jié)果的CUTOFF判斷值。(g)蛋類1、用均質(zhì)器低速均質(zhì)樣本(蛋黃或全蛋)；2、稱取3±0.05g均質(zhì)過的樣本，與9ml乙腈-水溶液(84:16;V乙腈V水)振蕩10min，15°C4000r/min以上離心10min;3、取3ml上層與3ml蒸餾水混合，加入4.5ml乙酸乙酯混合5min，15°C4000r/min以上離心10min;4、將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移到試管中50"C下氮?dú)獯蹈桑?、加入lml正己垸溶解殘留物后，用2ml稀釋后的復(fù)溶液混合lmin，離心去除正己烷。6、取50pl用于分析。(2)用本發(fā)明所述的試劑盒進(jìn)行檢測1、從4'C冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室溫(20-25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數(shù)量的微孔及框架，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8'C。3、配液將40ml濃縮洗滌液(20倍濃縮)用蒸餾水或去離子水稀釋至800ml備用(或按需要量稀釋)。4、編號將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50nl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50pl/L，用蓋板膜封板，輕輕震蕩混勻。37"C環(huán)境中反應(yīng)30min。6、取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250^il/孔洗板4-5次，每次間隔10秒，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。7、每孔加入酶標(biāo)記物100inl，蓋板膜蓋板后置37'C環(huán)境中反應(yīng)30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗，4-5遍(同上)，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。8、顯色每孔加入底物100pl，輕輕振蕩混勻，37"C環(huán)境中避光顯色15min。9、測定每孔加入終止液50Ml，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))，測定每孔OD值。七、結(jié)果判定結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含氯霉素成反比。1、粗略判定用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.250，樣本2的吸光度值為0.720，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是Oppb為1.610;0.025ppb為1.380;0.05ppb為U00;0.15ppb為0.620;0.45ppb為0.289;1.35ppb為0.108。則樣本1的濃度范圍是0.45ppb-1.35ppb;樣本2的濃度范圍是0.05ppb-0.15ppb。2、定量分析1、百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光度值(％)二-^-xl00%BoB^標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值Bff~0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/ml)的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氯霉素實(shí)際濃度。若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析圖1為氯霉素的檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，橫坐標(biāo)表示氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度，縱坐標(biāo)表示標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率。而圖2為氯霉素的檢測精確度曲線圖。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒組分的制備1.抗原的合成a.包被原的合成將氯霉素采用衍生物法合成氯霉素半抗原，再將半抗原通過重氮化反應(yīng)和牛丙種球蛋白載體蛋白用活潑酯法進(jìn)行偶聯(lián)得到。b.免疫原的合成將氯霉素半抗原通過重氮化反應(yīng)和鑰孔槭血藍(lán)蛋白載體蛋白用活潑酯法進(jìn)行偶聯(lián)得到。2.氯霉素鼠單克隆抗體的制備a.動物免疫采用Balb/c小鼠作為免疫動物，以氯霉素半抗原與鑰孔槭血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為300ng/只，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔2周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，四免后腹腔加強(qiáng)免疫一次，3天后取脾細(xì)胞。b.細(xì)胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按5:1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。c.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇取處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成5xl()S個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37"C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。d.單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將8周齡的Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5><106個(gè)/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，小瓶分裝，2(TC保存。3.氯霉素兔多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以氯霉素半抗原與鑰孔槭血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為3mg/kg，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7天后采血，測定血清抗體效價(jià)，心臟采血，經(jīng)硫酸銨分級沉淀得到純化的多克隆抗體。4.酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液將羊抗兔抗抗體稀釋成0.06pg/ml，每孔加入100|li1，37'C溫育6h，傾去包被液，用洗滌液洗滌4次，每次lmin，拍干，然后在每孔中加入15(Hil封閉液，37'C溫育lh，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。實(shí)施例2檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建組建檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被氯霉素抗原的酶聯(lián)板；(2)用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體；(3)氯霉素鼠單克隆抗體；(4)氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0pg/L、0.025pg/L、0.05,、0.15pg/L、0.45pg/L、1.35,;(5)底物顯色液為過氧化氫或過氧化脲與鄰苯二胺(OPD)或四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的混合液；(6)終止液為2mol/L的硫酸緩沖液；(7)濃縮洗滌液為去離子水或三蒸水；(8)抗體稀釋液為pH值8.2、0.05mol/L、含有3%馬血清和5%。明膠的磷酸鹽緩沖液。(9)濃縮復(fù)溶液為去離子水或三蒸水。實(shí)施例3檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒的的組建組建檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被羊抗兔抗抗體的酶聯(lián)板；(2)用堿性磷酸酯酶標(biāo)記的氯霉素抗原；(3)氯霉素兔多克隆抗體；(4)氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為Opg/L、0.025pg/L、0.05pg/L、0.15ng/L、0.45pg/L、1.35pg/L;(5)底物顯色液對硝基磷酸鹽緩沖液；(6)終止液為2mol/L的氫氧化鈉緩沖液；(7)濃縮洗滌液去離子水或三蒸水；(8)濃縮復(fù)溶液為去離子水或三蒸水。實(shí)施例4樣品中氯霉素殘留的檢測1.樣品前處理用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本;稱3±0.05g樣本于離心管中，先加入3ml去離子水充分混勻再加入6ml乙酸乙酯，振蕩10min，室溫4000r/min以上，離心10min;取出2ml上層液體(約相當(dāng)于lg的樣本)在氮?dú)饬?0-6(TC水浴中干燥；加入lml正己烷溶解干燥的殘留物，再加lml稀釋后的復(fù)溶液強(qiáng)烈振蕩lmin，室溫4000r/min以上離心15min。取50pl下層相用于分析。2.用試劑盒檢測向氯霉素偶聯(lián)抗原包被的96孔酶標(biāo)板微孔中加系列標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液(各2孔)50pl，再加入氯霉素抗體工作液5(^1，用蓋板膜封板，37。C恒溫箱中反應(yīng)30min。倒出孔中液體，每孔加入250W洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體ioow，用蓋板膜封板，37。C恒溫箱中反應(yīng)30min，重復(fù)洗滌工作。加入底物顯色液100|Lil，輕輕振蕩混勻，37'C恒溫箱避光顯色15min。每孔加入終止液2mol/L。硫酸50inl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀測定每孔吸光度值。3.檢測結(jié)果分析用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度平均值(B)，除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液(O標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(Bo)，再乘以100%，得到百分吸光度值。以氯霉素濃度的半對數(shù)為x軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，將樣品溶液的百分吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品溶液中氯霉素所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣品溶液中氯霉素的實(shí)際濃度。實(shí)施例5樣品中氯霉素殘留的檢測1.樣品前處理取2±0.05g蜂蜜，放入離心管中，用4ml去離子水溶解；加入4ml乙酸乙酯上下振蕩10min;室溫4000r/min以上離心10min;移取lml上層乙酸乙酯(相當(dāng)于0.5g樣本)到另一離心管中，50-60。C氮?dú)饬飨赂稍?；?.5ml稀釋后的復(fù)溶液溶解；取50pl用于分析。2.用試劑盒檢測向羊抗兔抗抗體包被的96孔酶標(biāo)板微孔中加入氯霉素兔多克隆抗體工作液100pl，用蓋板膜封板，37"C恒溫箱中反應(yīng)30min,倒出孔中液體，每孔加入25(Hil濃縮洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。每孔加入細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶標(biāo)記的氯霉素抗原50m1，再加入系列標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液50nl，用蓋板膜封板，37'C恒溫箱中反應(yīng)30min，重復(fù)洗滌過程。加入對硝基磷酸鹽緩沖液IOOW，輕輕振蕩混勻，37'C恒溫箱避光顯色15min。每孔加入終止液2mol/L氫氧化鈉50^1，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀測定每孔吸光度值。3.檢測結(jié)果分析用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液(O標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(Bo)再乘以100%，得到百分吸光度值。以氯霉素濃度Oig/L)的半對數(shù)為x軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，將樣品溶液的百分吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品溶液所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣品溶液中氯霉素實(shí)際濃度。實(shí)驗(yàn)例1標(biāo)準(zhǔn)品精密度試驗(yàn)從每批按照實(shí)施例1(4)中的方法制備的酶聯(lián)板中，各抽出10個(gè)微孔，觀!l定0.45嗎/L。標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值(OD值)，重復(fù)3次，計(jì)算變異系數(shù)cvy。，結(jié)果見表l。。表1標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)性試驗(yàn)(CW。)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>結(jié)果表明變異系數(shù)范圍在4.3%9.2%之間，符合了變異系數(shù)小于20%的規(guī)定，說明本試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品精密度達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)例2樣本可重復(fù)性試驗(yàn)以0.5iig/L，濃度的氯霉素對魚蝦、雞肉和蜂蜜，添加到樣品中，分別取三個(gè)不同批次的試劑盒各五個(gè)，每個(gè)濃度重復(fù)5次，分別計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果見表2、表3。_表2魚蝦、雞肉樣品可重復(fù)性試_批號實(shí)測值^g/L變異系數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表3蜂蜜樣品可重復(fù)實(shí)驗(yàn)<table>complextableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>結(jié)果表明魚蟲下、雞肉樣本變異系數(shù)均低于20%，蜂蜜樣本的變異系數(shù)均低于20%,符合了變異系數(shù)小于25%的規(guī)定，說明本試劑盒測定樣本的精密度達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)例3抗體的特異性特異性是指抗體對待測物的識別能力，強(qiáng)調(diào)抗體與待測物間結(jié)合反應(yīng)的專一性和對結(jié)構(gòu)相近或相關(guān)物質(zhì)的區(qū)分能力。特異性取決于待測物與其他物質(zhì)的交叉反應(yīng)。在競爭分析中，不同物質(zhì)的交叉反應(yīng)率可用如下公式計(jì)算交叉反應(yīng)率(％)=IC5G(競爭物)/IC5G(待測物)*100表4用KLH蛋白偶聯(lián)的抗原制備的抗體的交叉反應(yīng)率<table>complextableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實(shí)驗(yàn)例4試劑盒的準(zhǔn)確度試驗(yàn)取兩個(gè)濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別為0.5ng/kg(L)和l|ng/kg(L)，分別對樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度做4個(gè)平行，分別計(jì)算回收率。表5試劑盒的準(zhǔn)確度<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>結(jié)果表明魚蟲下、雞肉添加的回收率在78.5%~98%之間，蜂蜜添加回收率在82%~97%之間。實(shí)驗(yàn)例5試劑盒保存條件為28"C，經(jīng)過6個(gè)月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50%抑制濃度、氯霉素添加實(shí)際測定值均在正常范圍之內(nèi)。考慮在運(yùn)輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37'C保存的條件下放置6天，進(jìn)行加速老化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求?？紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-20。C冰箱冷凍5天，測定結(jié)果也表明試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒在28。C可以保存6個(gè)月以上。權(quán)利要求1.一種檢測動物源性食品中氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，它含有(1)包被氯霉素抗原的酶聯(lián)板或包被抗抗體的酶聯(lián)板；(2)酶標(biāo)記物；(3)氯霉素特異性抗體；(4)氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(5)底物顯色液；(6)終止液；(7)濃縮洗滌液；(8)濃縮復(fù)溶液；試劑盒中氯霉素包被抗原是采用活潑酯法將氯霉素半抗原與牛丙種球蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到的，抗抗體可為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體，羊抗鼠抗抗體是以鼠源抗體為免疫原對無病原體山羊進(jìn)行免疫得到，羊抗兔抗抗體是以兔源抗體為免疫原對無病原體山羊進(jìn)行免疫得到。2.如權(quán)利要求1所述的檢測動物源性食品中氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，試劑盒中酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)記氯霉素抗原，所用酶可為過氧化物酶或半乳糖甘酶，本發(fā)明優(yōu)選過氧化物酶;酶標(biāo)記物形式可為凍干粉、濃縮液和工作液。3.如權(quán)利要求2所述的檢測動物源性食品中氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，試劑盒中酶標(biāo)記抗原是采用活性酯法將標(biāo)記酶與氯霉素半抗原進(jìn)行偶聯(lián)得到。4.如權(quán)利要求3所述的檢測動物源性食品中氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，試劑盒中氯霉素特異性抗體為鼠源單克隆抗體或兔源多克隆抗體，免疫原是采用活潑酯法將氯霉素半抗原與鑰孔槭血藍(lán)蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到的；抗體形式可為凍干粉、濃縮液、工作液；抗體稀釋液為pH值8.2、0.05mol/L、含有3%馬血清和5%明膠的磷酸鹽緩沖液。5.如權(quán)利要求4所述的檢測動物源性食品中氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，試劑盒中當(dāng)標(biāo)記酶為過氧化物酶時(shí)底物顯色液為過氧化氫或過氧化脲、四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽混合溶液、終止液為O.l~0.5mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶為半乳糖甘酶時(shí)，底物顯色液為0.5mol/L磷酸鉀緩沖液，終止液為2mol/L的檸檬酸緩沖液;濃縮洗滌液為去離子水或三蒸水；濃縮復(fù)溶液為去離子水或三蒸水。6.如權(quán)利要求5所述的檢測動物源性食品中氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，制備酶聯(lián)板過程中所用的包被緩沖液為批pH值9.6、0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液；包被氯霉素抗原或抗抗體的載體物質(zhì)可為聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等；載體的形式可以是試管、微量反應(yīng)板凹孔、小珠、小圓片等；洗滌液為去離子水或三蒸水；封閉液是含有15%30%的馬血清和1%惰性蛋白的溶液。7.如權(quán)利要求1-6任一所述的檢測動物源性食品中氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，試劑盒中氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液為六個(gè)濃度梯度的氯霉素溶液，氯霉素稀釋液為去離子水或三蒸水，氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為Opg/L、0.025pg/L、0.05pg/L、0.15jng/L、0.45|ug/L、1.35嗎/L，13ml/瓶。8.—種檢測動物源性食品中氯霉素的方法，包括了以下步驟(1)樣品前處理；(2)用權(quán)利要求l-7任一所述的試劑盒的試劑進(jìn)行檢測;(3)分析檢測結(jié)果。全文摘要本發(fā)明提供了一種檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，它含有包被有包被原的酶聯(lián)板；酶標(biāo)記物；氯霉素特異性抗體；氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液；底物顯色液；終止液；濃縮洗滌液；濃縮復(fù)溶液。氯霉素包被抗原是采用活潑酯法將氯霉素半抗原與牛丙種球蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到，所述抗體為多克隆抗體或者單克隆抗體。本發(fā)明還提供了一種檢測動物源性食品中氯霉素的方法，包括了以下步驟樣品前處理；用試劑盒的試劑進(jìn)行檢測；分析檢測結(jié)果。本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、費(fèi)用低廉、適用于大量樣本篩查的檢測動物源性食品氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒及檢測方法。文檔編號G01N33/577GK101349696SQ200810042039公開日2009年1月21日申請日期2008年8月25日優(yōu)先權(quán)日2008年8月25日發(fā)明者青吳,俊唐,成李,宏楊,楊宗繁,溫俊梅,聶繼斌,欣齊申請人:深圳市綠詩源生物技術(shù)有限公司