專利名稱：細菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)熒光顯微鏡觀察與計數方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種細菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)熒光顯微鏡觀察與計數方 法，屬于生物技術領域。
背景技術：
熒光顯微鏡觀察與計數是細菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(Viable but Non-culturable， VBNC)研究所用的最基本的技術手段。目前，國內外用 于VBNC細菌熒光觀察與計數的現有技術主要源自于Hobbie等人于1977 年在《應用與環(huán)境微生物學》上發(fā)表的一篇題為"利用核孔濾膜進行細 菌熒光計數"的文章。該技術的一大亮點就是利用聚碳酸酯核孔濾膜替 代纖維素微孔濾膜，用于細菌總菌數的測定。同時還利用吖啶橙和萘啶 酮酸對細菌核染，用以區(qū)分細菌的"死"與"活"。除此之外，該項技術 所涉及的材料還包括伊拉克黑、甲醛、可換膜針頭式濾器等。其具體技 術措施如下。首先，在適當濃度的稀釋液中加入終濃度為0.001%的萘啶 酮酸和0.025%酵母膏，37'C培養(yǎng)16h — 24h，隨后加入2%甲醛固定(終濃 度)，而后再加入O. ly。的吖啶橙溶液染色3min。將稀釋液中的細菌過濾 到直徑25mm孔徑0.2um的核孔濾膜上。為消除濾膜本身的熒光，濾膜先 用0. 2%伊拉克黑的2%醋酸溶液染色24h。最后將濾膜放在載玻片上滴一 滴無自發(fā)熒光的香柏油，在油上蓋一張蓋玻片，在蓋玻片上再滴加一滴 無自發(fā)熒光的香柏油，于落射熒光顯微鏡下進行觀察計數。通過上述方
法，細菌總數能被客觀地計數出來，并且活菌與死菌也能被明顯地區(qū)分
開來。因此，該技術在VBNC細菌研究領域中被廣泛應用。但是隨著VBNC 研究范圍的不斷擴大，具有VBNC性質的細菌種類也越來越多，已不局限 于當初發(fā)現的16個種屬的30多種細菌。不但革蘭氏陰性病原菌存在VBNC 狀態(tài)，革蘭氏陽性益生菌也存在；不但水中細菌存在，土壤、空氣、動 植物體內細菌也存在。那么此項技術在該領域研究中也顯現出了儲多不 利方面，存在著一定的局限性。歸納其技術缺點如下(l)操作繁瑣，耗 費時間，不利于VBNC細菌的快速檢測。 一般地，在觀察VBNC細菌時， 需用萘啶酮酸抑制細菌生長16h — 24h。 (2)適用范圍窄，僅對革蘭氏陰 性菌適用，而對革蘭氏陽性則不適用。(3)不能真實反映活菌數量。經吖 啶橙染色，呈現橙黃或橙紅色熒光的菌體難于有效確定是活菌還是死菌。 (4)所用材料種類多，且取材不便。例如，伊拉克黑是在印染工業(yè)中所使 用的一種黑色染料，但在國內各大生化及生物公司卻很少銷售此類物質。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種細菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)熒光顯微鏡觀察
與計數方法，其以SYT0-9和PI替代吖啶橙和萘啶酮酸，以市售的黑色 鋼筆墨水替代伊拉克黑，自行建立了一套VBNC細菌熒光顯微鏡觀察與計 數方法，簡化了操作流程，克服了現有技術的適用范圍狹窄、取材困難、 觀察結果不準確等缺點，解決了細菌VBNC研究領域中的技術難題，提高 同業(yè)者的實踐操作水平。
本發(fā)明的技術方案是這樣實現的細菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)熒光顯微 鏡觀察與計數方法，其特征在于具體步驟是1、 VBNC細菌觀察樣本的前處理 VBNC細菌誘導前的菌液濃度為10s — 106個/mL，取可培養(yǎng)菌數為1 X
10，/mL的VBNC細菌液lmL至無菌離心管中，8000 r/min離心2min， 棄上清；然后用滅菌生理鹽水充分洗滌菌體沉淀2次，每次均8000 r/min， 離心2min，棄上清；洗滌菌體時，應盡可能地除盡細菌培養(yǎng)液，以免培 養(yǎng)液產生自發(fā)光而干擾觀察結果；最后需將洗滌完畢的沉淀置于室溫， 用于立即觀察；或者將菌體保存于4t;，在2天內備用；
2、 微孔濾膜疏水性檢查與處理
首先將直徑25mm孔徑0. 2um的微孔濾膜完全浸入滅菌生理鹽水中2 rnin，再將微孔濾膜取出置于平皿中，光面朝上，仔細觀察微孔濾膜表面， 若微孔濾膜表面有部分面積沒有水痕，則表示此濾膜疏水，應重新更換； 或者將疏水濾膜浸入0.5%的吐溫-80中，浸泡lmin，而后將微孔濾膜 轉入可換膜針頭式濾器內，在針管內注入滅菌生理鹽水2mL， 一并將吐 溫-80和鹽水濾出；驗證后的和吐溫-80處理后的濾膜均光面朝上平鋪于 平皿內，37'C烘干，室溫存放備用，微孔濾膜最好直接使用親水性濾膜;
3、 微孔濾膜染色
將上述處理完畢的微孔濾膜光面朝上平鋪于平皿中，膜與膜之間不 能重疊；而后用吸管吸取適量"英雄牌"黑色鋼筆墨水，在濾膜圓心處 滴一滴，要讓墨水從膜中心向四周自行浸染擴散，待墨水已全部浸透膜 后，將平皿移至干熱箱內，6(TC烤膜20min，其間需用鑷子輕輕夾起濾 膜翻動2次，而后冷卻，室溫存放備用；4、 VBNC細菌樣本熒光染色
將SYTO-9和PI染料配制成工作濃度，一20'C存放備用；將步聚1 中的VBNC菌體沉淀溶于50 til滅菌生理鹽水中，貼壁加入工作濃度的 SYTO-9和PI各25u 1至離心管中，瞬間離心，吹吸混勻，室溫避光染 色15minj
5、 VBNC細菌熒光標本的制備
將經墨水染黑的微孔濾膜置于無自發(fā)熒光的載玻片中心處，吸取 10y 1染色完畢的VBNC菌液，滴在微孔濾膜圓心上，待菌液剛好被濾膜 吸干時，在其上蓋上蓋玻片，并用手用力壓片，除盡空氣夾層；最后在 蓋玻片上滴一滴無自發(fā)熒光的油，用OLYMPUS BX-51落射熒光顯微鏡于 暗室中觀察并計數；熒光顯微鏡的激發(fā)光波長480nm，發(fā)射光波長為 610nm;待檢標片可置于溫盒內，在4'C低溫存放ld;
6、 VBNC細菌熒光顯微鏡計數
計數時至少隨機選擇10個不同視野，而每個視野中的細菌數不低于 30 — 50個，而后取平均值；觀察計數時，每個視野在lmin之內完成； 當看到呈現綠色熒光的即為活菌，而呈現紅色熒光的即為死菌；VBNC細 菌數的具體計數可參考以下公式
其中E為樣品中細菌總數(個/mL); X為各計數視野細菌總數的平均 值(個)；S,為濾膜面積(鵬)；S2為顯微鏡油鏡的視野面積(mm); V為待 檢VBNC細菌液的體積(mL)。
本發(fā)明的積極效果是選用的SYT0-9和PI兩種核酸熒光染料是VBNC
細菌熒光觀察的關鍵材料，其中，SYT0-9是一種能滲入具有完整細胞膜 細胞內的小分子，呈綠色熒光，PI則是一種僅能滲到細胞膜破損的菌體 內且呈紅色熒光的大分子，并且與SYT0-9競爭核酸著染位點；經此試劑 染色后，發(fā)出綠色熒光的即為活菌，而發(fā)出紅色熒光的為死菌。這兩種 染料還對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌都適用，都利于活細胞與死細胞的 區(qū)分；因而，SYT0-9和PI不但能縮短VBNC細胞觀察期，而且還應用廣
泛。采用黑色鋼筆墨水不僅取材方便而且便宜；采用由上海英雄金筆廠 有限公司生產的英雄牌黑色鋼筆墨水不但不產生自發(fā)光，而且還能去除 濾膜的光亮；不但能加深視野背景深度，而且還能加強膜對玻片的吸附 力，因而該牌墨水對VBNC細菌的熒光觀察效果最好。采用物理固定方式， 即利用濕潤的濾膜對載玻片和蓋玻片的吸附作用以及手動壓力作用，這 種固定方式并不影響細菌的存活狀態(tài)，因而在測定總菌數的同時，也能 一并將活菌數測定出來。
具體實施例方式
實施例1:
1、 首先對VBNC細菌觀察樣本進行前處理，VBNC細菌誘導前的菌液 濃度為106個/mL，取可培養(yǎng)菌數1Xl(f個/mL的VBNC細菌液lmL至無 菌離心管中，以8000 r/min離心處理2min，棄上清；然后用滅菌生理 鹽水充分洗滌菌體并沉淀2次，每次均8000 r/min，離心2min，棄上清； 洗滌菌體時，應除盡細菌培養(yǎng)液，以免培養(yǎng)液產生自發(fā)光而干擾觀察結 果；最后需將洗滌完畢的沉淀置于室溫，用于立即觀察；
2、 接下來進行微孔濾膜疏水性檢査與處理，首先將直徑25mm孔徑0. 2um的微孔濾膜完全浸入滅菌生理鹽水中2 min，再將微孔濾膜取出置 于平皿中，光面朝上，仔細觀察微孔濾膜表面，若微孔濾膜表面有部分 面積沒有水痕，則表示此濾膜疏水，應重新更換；或者將疏水濾膜浸入 0.5%的吐溫_80中，浸泡1 min，而后將微孔濾膜轉入可換膜針頭式濾 器內，在針管內注入滅菌生理鹽水2mL， 一并將吐溫-80和鹽水濾出；驗 證后的和吐溫-80處理后的濾膜均光面朝上平鋪于平皿內，37'C烘干， 室溫存放備用，微孔濾膜最好直接使用親水性濾膜；
3、 將處理完畢的微孔濾膜光面朝上平鋪于平皿中，膜與膜之間不能 重疊；而后用吸管吸取適量"英雄牌"黑色鋼筆墨水，在濾膜圓心處滴 一滴，要讓墨水從膜中心向四周自行浸染擴散，待墨水已全部浸透膜后， 將平皿移至干熱箱內，6(TC烤膜20min，其間需用鑷子輕輕夾起濾膜翻 動2次，而后冷卻，室溫存放備用；
4、 對VBNC細菌樣本進行熒光染色，將SYT0-9和PI染料配制成工 作濃度，并在一20'C存放備用；將步聚l中的VBNC菌體沉淀溶于50ul 滅菌生理鹽水中，貼壁加入工作濃度的SYT0-9和PI各25u 1至離心管 中，瞬間離心，吹吸混勻，室溫避光染色15min;
5、 VBNC細菌熒光標本的制備，將經墨水染黑的微孔濾膜置于無自 發(fā)熒光的載玻片中心處，吸取10 ul染色完畢的VBNC菌液，滴在微孔濾 膜圓心上，待菌液剛好被濾膜吸干時，在其上蓋上蓋玻片，并用手用力 壓片，除盡空氣夾層;最后在蓋玻片上滴一滴無自發(fā)熒光的油，用OLYMPUS BX-51落射熒光顯微鏡于暗室中觀察并計數；熒光顯微鏡的激發(fā)光波長 480nm，發(fā)射光波長為610nm;待檢標片可置于溫盒內，在4XM氐溫存放 Id;
6、 VBNC細菌熒光顯微鏡計數，隨機選擇10個不同視野，而每個視 野中的細菌數為30個，而后取平均值；觀察計數時，每個視野在lmin 之內完成；當看到呈現綠色熒光的即為活菌，而呈現紅色熒光的即為死 菌；VBNC細菌數的具體計數可參考以下公式
其中E為樣品中細菌總數(個/mU ; X為各計數視野細菌總數的平均 值(個)；S,為濾膜面積(mm); S2為顯微鏡油鏡的視野面積(mm); V為待 檢VBNC細菌液的體積(mL)。
實施例2:
1、 首先對VBNC細菌觀察樣本進行前處理，VBNC細菌誘導前的菌液 濃度為K)5個/mL，取可培養(yǎng)菌數1X105個/mL的VBNC細菌液lmL至無 菌離心管中，以8000 r/min離心處理2min，棄上清；然后用滅菌生理 鹽水充分洗滌菌體并沉淀2次，每次均8000r/min，離心2min，棄上清； 將菌體保存于4'C，在2天內備用；
2、 接下來進行微孔濾膜疏水性檢查與處理，首先將直徑25mm孔徑 0. 2um的微孔濾膜完全浸入滅菌生理鹽水中2 min，再將微孔濾膜取出置 于平皿中，光面朝上，仔細觀察微孔濾膜表面，若微孔濾膜表面有部分 面積沒有水痕，則表示此濾膜疏水，應重新更換；或者將疏水濾膜浸入 0.5%的吐溫-80中，浸泡1 min，而后將微孔濾膜轉入可換膜針頭式濾 器內，在針管內注入滅菌生理鹽水2mL， 一并將吐溫-80和鹽水濾出；驗 證后的和吐溫-80處理后的濾膜均光面朝上平鋪于平皿內，37r烘干，室溫存放備用，微孔濾膜最好直接使用親水性濾膜；
3、 將處理完畢的微孔濾膜光面朝上平鋪于平皿中，膜與膜之間不能 重疊；而后用吸管吸取適量"英雄牌"黑色鋼筆墨水，在濾膜圓心處滴 一滴，要讓墨水從膜中心向四周自行浸染擴散，待墨水已全部浸透膜后， 將平皿移至干熱箱內，6(TC烤膜20min，其間需用鑷子輕輕夾起濾膜翻 動2次，而后冷卻，室溫存放備用；
4、 對VBNC細菌樣本進行熒光染色，將SYT0-9和PI染料配制成工 作濃度，并在一20'C存放備用；將步聚1中的VBNC菌體沉淀溶于50" 1 滅菌生理鹽水中，貼壁加入工作濃度的SYT0-9和PI各25u 1至離心管 中，瞬間離心，吹吸混勻，室溫避光染色15min;
5、 VBNC細菌熒光標本的制備，將經墨水染黑的微孔濾膜置于無自 發(fā)熒光的載玻片中心處，吸取10ul染色完畢的VBNC菌液，滴在微孔濾 膜圓心上，待菌液剛好被濾膜吸干時，在其上蓋上蓋玻片，并用手用力 壓片，除盡空氣夾層；最后在蓋玻片上滴一滴無自發(fā)熒光的油，用OLYMPUS BX-51落射熒光顯微鏡于暗室中觀察并計數；熒光顯微鏡的激發(fā)光波長 480nm，發(fā)射光波長為610nm;待檢標片可置于溫盒內，在4'C低溫存放 ld;
6、 VBNC細菌熒光顯微鏡計數，隨機選擇10個不同視野，而每個視 野中的細菌數為50個，而后取平均值；觀察計數時，每個視野在lrain 之內完成；當看到呈現綠色熒光的即為活菌，而呈現紅色熒光的即為死 菌；VBNC細菌數的具體計數可參考以下公式
<formula>complex formula see original document page 12</formula>
其中E為樣品中細菌總數(個/mL); X為各計數視野細菌總數的平均 值(個)；S,為濾膜面積(mm); S2為顯微鏡油鏡的視野面積(mm); V為待 檢VBNC細菌液的體積(mL)。
權利要求
1、細菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)熒光顯微鏡觀察與計數方法，其特征在于具體步驟是(1)、VBNC細菌觀察樣本的前處理VBNC細菌誘導前的菌液濃度為105-106個/mL，取可培養(yǎng)菌數為1×106個/mL的VBNC細菌液1mL至無菌離心管中，8000r/min離心2min，棄上清；然后用滅菌生理鹽水充分洗滌菌體沉淀2次，每次均8000r/min，離心2min，棄上清；洗滌菌體時，應盡可能地除盡細菌培養(yǎng)液，以免培養(yǎng)液產生自發(fā)光而干擾觀察結果；最后需將洗滌完畢的沉淀置于室溫，用于立即觀察；或者將菌體保存于4℃，在2天內備用；(2)、微孔濾膜疏水性檢查與處理首先將直徑25mm孔徑0.2um的微孔濾膜完全浸入滅菌生理鹽水中2min，再將微孔濾膜取出置于平皿中，光面朝上，仔細觀察微孔濾膜表面，若微孔濾膜表面有部分面積沒有水痕，則表示此濾膜疏水，應重新更換；或者將疏水濾膜浸入0.5％的吐溫-80中，浸泡1min，而后將微孔濾膜轉入可換膜針頭式濾器內，在針管內注入滅菌生理鹽水2mL，一并將吐溫-80和鹽水濾出；驗證后的和吐溫-80處理后的濾膜均光面朝上平鋪于平皿內，37℃烘干，室溫存放備用；(3)、微孔濾膜染色將上述處理完畢的微孔濾膜光面朝上平鋪于平皿中，膜與膜之間不能重疊；而后用吸管吸取黑色鋼筆墨水，在濾膜圓心處滴一滴，要讓墨水從膜中心向四周自行浸染擴散，待墨水已全部浸透膜后，將平皿移至干熱箱內，60℃烤膜20min，其間需用鑷子輕輕夾起濾膜翻動2次，而后冷卻，室溫存放備用；(4)、VBNC細菌樣本熒光染色將SYTO-9和PI染料配制成工作濃度，-20℃存放備用；將步聚1中的VBNC菌體沉淀溶于50μ1滅菌生理鹽水中，貼壁加入工作濃度的SYTO-9和PI各25μ1至離心管中，瞬間離心，吹吸混勻，室溫避光染色15min；(5)、VBNC細菌熒光標本的制備將經墨水染黑的微孔濾膜置于無自發(fā)熒光的載玻片中心處，吸取10μl染色完畢的VBNC菌液，滴在微孔濾膜圓心上，待菌液剛好被濾膜吸干時，在其上蓋上蓋玻片，并用手用力壓片，除盡空氣夾層；最后在蓋玻片上滴一滴無自發(fā)熒光的油，用OLYMPUS BX-51落射熒光顯微鏡于暗室中觀察并計數；熒光顯微鏡的激發(fā)光波長480nm，發(fā)射光波長為610nm；待檢標片可置于溫盒內，在4℃低溫存放1d；(6)、VBNC細菌熒光顯微鏡計數計數時至少隨機選擇10個不同視野，而每個視野中的細菌數不低于30-50個，而后取平均值；觀察計數時，每個視野在1min之內完成；當看到呈現綠色熒光的即為活菌，而呈現紅色熒光的即為死菌；VBNC細菌數的具體計數可參考以下公式 其中E為樣品中細菌總數(個/mL)；X為各計數視野細菌總數的平均值(個)；S1為濾膜面積(mm)；S2為顯微鏡油鏡的視野面積(mm)；V為待檢VBNC細菌液的體積(mL)。
2、 權利要求1所述的細菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)熒光顯微鏡觀察與 計數方法，其特征在于所述的熒光顯微鏡標本制片的固定方式為物理 固定方式，即利用濕潤的濾膜對載玻片和蓋玻片的吸附作用以及手動 壓力作用。
3、 權利要求1所述的細菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)熒光顯微鏡觀察與 計數方法，其特征在于所述的黑色鋼筆墨水為"英雄牌"黑色鋼筆墨 水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)熒光顯微鏡觀察與計數方法，其特征在于具體步驟是(1)VBNC細菌觀察樣本的前處理；(2)微孔濾膜疏水性檢查與處理；(3)微孔濾膜染色；(4)VBNC細菌樣本熒光染色；(5)VBNC細菌熒光標本的制備；(6)VBNC細菌熒光顯微鏡計數。其簡化了操作流程，克服了現有技術的適用范圍狹窄、取材困難、觀察結果不準確等缺點，解決了細菌VBNC研究領域中的技術難題，提高從業(yè)者的實踐操作水平。
文檔編號G01N1/30GK101344476SQ20081005110
公開日2009年1月14日 申請日期2008年8月20日 優(yōu)先權日2008年8月20日
發(fā)明者鳳 候, 孫曉媛, 影 李, 銳 段, 王偉利, 錢愛東 申請人:影 李