專利名稱：與pkr激酶結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的多肽及其應(yīng)用的制作方法
與pkr激酶，域特異性結(jié)合的多uyi其i^
獄領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物工程與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用噬菌體展示技鄉(xiāng)選能與PKR激酶結(jié)構(gòu) 域(Pit)特異性結(jié)合的多月級(jí)其應(yīng)用。 背景駄
PKR是一種由干擾素i秀導(dǎo)的,于雙鏈RNA的蛋白激酶，是^t刻I譯起始因子elF2 a激酶家 方M員之一。它是一種有551個(gè)氨基酸纟賊的絲氨酸_蘇氨酸 ，而近S^開究也發(fā)現(xiàn)其具有酪 氨酸激酶的活性[Su, Q. et a丄 Tyrosine phosphorylation acts as a molecular switch to full-scale activation of the eIF2 a RNA-d印endent protein kinase. 2006. PNAS]。結(jié)構(gòu)上， 主要包括2個(gè)功能性結(jié)構(gòu)域N端與RNA結(jié)合的調(diào)節(jié)性結(jié)構(gòu)嫩BC端的催化結(jié)構(gòu)域。PKR在干矛綠 誘導(dǎo)的抗病毒防御應(yīng)答中發(fā)揮主要的作用，被認(rèn)為是IFN誘導(dǎo)的最具有特征性的抗病毒路徑。
PKR也可能是治療多種神經(jīng)退行性病變的藥物靶標(biāo)[Peel， Alyson L. PKR Activation in Neurodegenerative Disease]。其中，阿爾茨海默癥(AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶力損 害為主的中樞神經(jīng)系鄉(xiāng)Bi行',病，l斑，神經(jīng)纖維絲纏結(jié)和神經(jīng)細(xì)胞死亡，理變化為病理 特征。0 —淀粉誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡中半胱天冬KCaspase/APKR的Asp251切掉PKR的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，
釋放出組成型激活的elF2a激酶結(jié)構(gòu)域從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞蛋白合成的抑制[MlILl1. et a丄 Activation of caspase-8 in the Alzheimer's disease brain. 2001. Neurobiol Dis.]。以PKRcat
作為耙蛋白篩選抑制劑可以用于開發(fā)延緩群癡呆病中神經(jīng)細(xì)胞的死亡，纟 和治療1癡呆的藥物。
在過(guò)去的10年間，多肽療法對(duì)醫(yī)藥行 說(shuō)，被認(rèn)為是一項(xiàng)很Wltf途的新開發(fā)。，范圍內(nèi) 有600—700種多肽正處于開發(fā)階段。其中，在細(xì)胞信號(hào)fflS各的基5臓究和藥物研發(fā)方面，激酶多 肽鄉(xiāng)制劑己成為一個(gè)非常輸途的領(lǐng)域。例如，多肽PKI抑制PKA的激酶活性棚于研究人淋巴 細(xì)胞的調(diào)亡通路[Zhang, B. et a丄 Racl inhibits apoptosis in human lymphoma cells bystimulating Bad pho印horylation on Ser-75. 2004. Mol. Cell. Biol.]。豆蔻?；鞍准?歐的抑制肽在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平都能夠特異的抑制PKC的活性。[Spyridopoulos， I. a丄 Divergence of angiogenic and vascular permeability signaling by VEGF inhibition of protein kinase C suppresses VEGF-induced angiogenesis but promotes VEGF-induced， NOd印endent vascular permeability. 2002. Aterioscler. Throrab. Vase. Biol.]。 盡管PKR激酶結(jié)構(gòu):I^老 年癡呆等疾病中辦作用，但目前絲舒KR抑制劑和PKR多肽鄉(xiāng)制劑的報(bào)道。
多肽藥物設(shè)計(jì)中，禾,噬菌體呈現(xiàn)技^l勾建不同容量的隨棚，，從這^l，中快速篩選出 活性多肽，并鑒定其結(jié)構(gòu)，可以簡(jiǎn)便決速地獲得與耙好具有強(qiáng)親禾叻禾晚異性的小肽或新型蛋 白，這翻太段可以作為纟魏藥物進(jìn)行開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是麟一種倉(cāng)激與PKR激酶結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的多B級(jí)其應(yīng)用。 PKR是神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病，如^^癡呆癥藥物開發(fā)的新耙點(diǎn)。本發(fā)明自12肽噬菌體展示
文庫(kù)對(duì)PKIU4行五輪蹄選，獲得了能與PKL特異性結(jié)合的12肽，并且該12肽倉(cāng)^q]制PKL的激酶活性。
本發(fā)明應(yīng)用噬菌體展示文庫(kù)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白PKJU謝満選，獲得了一，異性結(jié) 合Plt的12肽，其氨基,列如下
Ser-Val-His-Leu-Tyr-His-Ser-Thr-Lys-Thr-Leu-Aig。
戰(zhàn)多肽，肖的PKR激酶結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，并且倉(cāng),制PKR^磷酸化elF2a的能力，IC^ 為2.5yM。
所述的多肽可以用于抑制PKL激酶活性。可應(yīng)用于開發(fā)Pl抑制劑。 本發(fā)明提供的與PKR激酶結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的多肽的篩選和鑒定步驟如下
^M人PKIU進(jìn)行五輪篩選，獲躬PKR結(jié)合的重組噬菌體；
ELISA法檢測(cè)噬菌體與PKIC的結(jié)合； 單克隆,體的分離制備；
M體基因組單鏈DNA的提取和獲得寡ttl^列；*多肽固相合成，競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)多肽與PKIU的結(jié)合；
應(yīng)用體外生物化學(xué)方f敘if究12月樹PU鵬活性的影響。
本發(fā)明的有 ^是:本發(fā)明提供的12肽倉(cāng),特異性的與Plt結(jié)合糊制Pit的 活性， 可應(yīng)用于PKIU抑制劑的藥物設(shè)計(jì)。


圖1.是免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)純化PKR^的激酶活性，
圖2.是噬菌體展示中每輪淵兌的噬菌體數(shù)，以空孔作為對(duì)照，
圖3.是ELISA法檢測(cè)篩選得到的噬菌體和原噬菌體庫(kù)與包被PKILt的孑L和空孔的結(jié)
合，
圖4.是ELISA法檢測(cè)10個(gè)噬菌,克隆與Plt及空孔的結(jié)合，
圖5.是競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)合成12肽與PKILt的結(jié)合，
圖6.是體外酶學(xué)方法檢測(cè)合成12月樹PKIU激酶活性的影響。
具體實(shí)駄式
實(shí)施例l:重組PKIC的^i^做活性的初步研究
1. 魏PKILt質(zhì)粒的構(gòu)建
利用已有的pET28a-PKR f皿，TM的PCR弓胸和Pfu聚合酶PCR擴(kuò)增PKR^: 正向引物5 ' —CATGCCATGGGCGACATGAAAGAAACAAAGTATACTG- 3' 反向弓慨5 ' -GGCTCTCGAGACATGTGTGTCGTTCATTTTTCTC-3' 禾,NcoI/XhoI消化擴(kuò)增DNA片段，并且克[tJtA質(zhì)粒pET28a (Novagen)。將這樣構(gòu)建的 重組質(zhì)粒命名為pET28a-PKlU并且導(dǎo)入;yif桿菌BL21 。重組質(zhì)粒pET28a-PKILt允許在成熟的PKIU 的N ^^具有另夕卜一個(gè)甲基硫氨酸殘凝口在C ^J需具有另外61^且氨酸的重組PKL的皿。
2. 魏PKIU的純化
① .齢有pET28a-PKILt的BL21于5raL LB培養(yǎng)基(50ug/ml卡那霉素)，37°C， 250rpm搖菌過(guò) 夜。
② 丄50的比例轉(zhuǎn)接到4個(gè)大瓶中(^!250mLLB培養(yǎng)基，50 u g/ml卡那霉素)，37°C， 250rpm搖菌2小時(shí)。加入300uMIPTG， 27°C， 250rpm，過(guò)夜誘導(dǎo)。
③.將誘導(dǎo)過(guò)夜的菌液10000rpm,離心15射中。用Lysis Buffer (20mM Tris-HC1， 500mM NaCl， pH 7.5)重懸沉淀，lOOOOrpm，離心15辦中。
.用40mL Lysis Buffer重懸所有沉淀，加入PMSF蛋白,帝擠i」至終濃度為lmM，在冰浴中超聲 破碎(功率300W，超聲5s，停15s， 90循環(huán))。
. 4 12000rpm， 15射中離心兩次。將離心后的上清與4mL Ni樹脂4'C結(jié)合1小時(shí)。
⑥ .在蛋白與樹脂結(jié)合的同時(shí)，清洗蛋白純化儀:先用清7K清洗B難，彌洗A魏(5mL/射中)； 再用Elution Buffer (20rnM Tris-HCl， 500rnM NaCl， 250mM咪唑，pH 7. 5)清洗B髓(0. 5mL/ 射中)；最后用Lysis Buffer清洗A髓(0. 5mL/^H中)。
⑦ .將結(jié)合蛋白的樹脂離心，棄上清，裝柱，連接于AKTA prime plus蛋白純化儀(通用電氣)。 用Lysis Buffer漂洗Beads,洗下一時(shí)寺異結(jié)合的蛋白。用Elution Buffer梯度淘說(shuō)目的蛋白。
⑧ .根據(jù)蛋白峰的隨，收集相應(yīng)管的艦液，跑SDS-聚丙烯醐窮繊電泳(SDS-PAGE)，考馬斯 絵她魁正。
3. PKRcat激酶活性的初步分析 反應(yīng)體系為40 nL:
① .將50ng純化PKR^加入置于冰上的試管中，其終濃度為25nM。
② .混合底物純化的elF2 a ， ATP， 5 X Buffer A (lOOmM Tris-HCl， 200nM KC1， lOmM MgCl2)和 雙蒸水使反應(yīng)液中含終濃度為20nMTris-HC1， 40mMKCl， 2mMMgCl2， 500nMelF2 a ， lOOuM ATP， 以此混合液?jiǎn)⑹挤磻?yīng)。
③ .以(D 昆合TO始反應(yīng)，30。C水浴準(zhǔn)確鵬10射中。力口8wL 6 X Loading Buffer終止反應(yīng)。
. 9(TC沸水中煮5^I中。樣品7轉(zhuǎn)PMM溫，微型離心機(jī)短暫離心( 15s)。
.上樣，進(jìn)行SDS—PAGE電泳。
⑥.Western Blot法檢測(cè)elF2 a的磷酸化狀態(tài)。
方法如下
100mA，電轉(zhuǎn)移1.5小時(shí)。用3%的腳旨牛^5^寸閉膜，室溫?fù)u床輕搖l小時(shí)。加入第一抗體(磷酸化elF2a抗體，兔源， Invitrogen)，室溫?fù)u床輕搖l小時(shí)。1XTBST(含O. 1% Tween附BS， pH 7. 4) 3次，每次5分 鐘。與第二抗體反應(yīng)(HRP偶聯(lián)羊抗兔二抗，Santa Cruz Biotechnology),室溫?fù)u床輕^40射中。 1XTBST鵬3次，每次5射中。去離子7X洗5射中。加化學(xué)發(fā)艦物(ECL)曝光。曝光5艘經(jīng)^|$ 成像系統(tǒng)Chemidoc XRS System (Bio-Rad)定量。
Stripe Buffer (7M鹽酸胍，lOraMDTT)處理膜30併中。去離子水TO3次，每次5射中。用3% 的腳旨牛^5i寸閉膜，室溫?fù)u床輕搖l小時(shí)。加入第一抗體(anti-elF2 a antibody,兔源，Santa Cruz Biotechnology),室溫?fù)u床輕搖l小時(shí)。1XT BST(含0.W Tween附BS， pH 7.4) ^鎖3次，每次 5射中。與第二抗體反應(yīng)(HRP偶聯(lián)羊抗兔二抗，Santa Cruz Biotechnology),室溫?fù)u床^g40分 鐘。1XTBST鵬次，每次5射中。去離子7]C洗5併中。力口化學(xué)發(fā)艦物(ECL)曝光。曝光弓驢經(jīng) Ml^成像系統(tǒng)Chemidoc XRS System (Bio-Rad)定量。
eIF2 a磷酸化禾號(hào)磷酸化elF2 a曝光弓膨全elF2 a曝光鵬。
結(jié)果從1L菌液中純化出4.8呢的PKIU蛋白，酶活分析表明純化蛋白具有激酶活性，倉(cāng),酸 化elF2a;對(duì)照組未加APl elF2a未被磷酸化(圖l)。
實(shí)施例2:鄉(xiāng)S15:輪篩選獲得能與PKRcat特異性結(jié)合的魏噬菌體
1.第一輪篩選與離
① .用NaHCOs溶 釋PKR^蛋白至100 pg/mL的溶液,要求NaHC03的終濃度為0.1M。加100|aL
該溶游U96孑L板的一個(gè)孔中，4。C包l艦夜。
② .加150^§^羊配制的含0.5% (w/v) BSA的TBS (BTBS)溶液到上步包被蛋白的孔中，室溫
搖擺平臺(tái)方爐1小時(shí)。
③ .與此同時(shí)，將噬菌俠10"pfU)加到100iaLBTBS中，加到一個(gè)空孔中，室溫?fù)u擺平臺(tái)方燈l小
時(shí)，目的是將可以與ELISA板非特異性結(jié)合的噬菌體吸收掉。
.倒掉蛋白/BTBS溶液，用200nLTBST (含O. 1% Tween的TBS， pH 7.4)洗6遍，注意每次都 不要讓孔干了。最后一次洗完后，將先前與板吸M的噬菌柳TBS溶鵬移到這個(gè)孔中。室 溫MM平臺(tái)放置1小時(shí)。⑤ .倒掉噬菌^/BTBS溶液，用200nLTBST洗10遍。
⑥ .加100iaL0,2MGlysine 結(jié)合的噬菌體，室溫 離平臺(tái)體8射中，立即轉(zhuǎn)移至lj小離心管中，
并用Tris-HCl buffer中和到pH為7—8。 4 'C保存直至頓啶噬菌微度或擴(kuò)增。
⑦ .對(duì)照另一 L不包被蛋白按相同方法操作，得到 噬菌體并測(cè)定濃度。
2. 擴(kuò)增，第二輪奴后幾f^與艦
① .保留10-20&上步得到的噬菌做脫、細(xì)于測(cè)噬菌術(shù)商度，^絲除的噬菌體鄉(xiāng)擴(kuò)增產(chǎn)頓
于下一輪篩選的噬菌體。
提前將大腸桿菌ER2738 [F， lacf1 A(lacZ)M15 proA4^ zzf::Tn10 (Jet"VfhuA2 supE thi A(lac-proAB) A(hsdMS-mcrB)5 ("_1111{^0 0")菌;1*^存在含50%甘油的LB培養(yǎng)基中，存于一70 °C]接到LB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)到ODeoto為0.5時(shí)，取lmL大腸桿菌ER2738轉(zhuǎn)接到含有30rnL LB培養(yǎng)基的三角瓶中，同喻艘擴(kuò)增的噬菌糊[]入，37'C搖床培養(yǎng)4,5小時(shí)。
② .轉(zhuǎn)移上步的培 到離心管中，室溫，10000rpm離心15併中。將80%的上清吸至噺的離心管
中，加入l/6上清^f只的PEG溶液，4'C沉^趙夜。
③ .4。C， 10000rpm離心30 ^H中，緩慢倒出上清，再小心的將管壁上的液體離心下來(lái)，用微
液器小心棄掉。
.用200(iLTBS重懸沉淀，轉(zhuǎn)移懸液到0.5mL離心管中，室溫10000rpm離心5併中。
⑤.上清轉(zhuǎn)移到新的0,5mL離心管中，逸就是擴(kuò)增了的II鶴體。4'C保存用于測(cè)濃度和下一輪篩選。
包被ELISA板的另一個(gè)孔，加入10HpfU第一輪擴(kuò)增噬菌體。按第一輪的方、 S4行第二輪及之
后幾輪的篩選和擴(kuò)增，每輪噬菌體的力口入M,與第一輪一致。
3. 噬菌^t度的測(cè)定的具體實(shí)施
① .大腸桿菌ER2738接種到5mLLB培養(yǎng)基中，37。C搖^t咅養(yǎng)魏數(shù)早中期(ODeoonm大約0.5)。
② .融^li:層膠(含有0.7。/。瓊月謝的LB培養(yǎng)基)，條3mU管，45。C水,衡，準(zhǔn)備別頓。
③ .用LB培養(yǎng)翻爭(zhēng)疆(或擴(kuò)增)后的噬菌體進(jìn)行10倍系列稀釋。 稀釋比例如下
對(duì)于擴(kuò)增的噬菌，，稀釋iow和io"倍。 '對(duì)于》 下來(lái)的噬菌體液，第一輪按102和103稀釋，以后每多一輪就增加10倍##度。
將10|aL噬菌###、柳卩入到200^L第一步的ER2738菌液中，，輕輕混勻，室驗(yàn)置1 一5分 鐘。
.轉(zhuǎn)移第三步噬菌鵬染的ER2738菌液到第二步中45。C平衡的戰(zhàn)膠中，fflit搖動(dòng)，立即倒入 37。C預(yù)溫的LB平板(涂有IPTG和X-gal)上，均勻鋪平。
⑤ .7細(xì)5倂中，反轉(zhuǎn)平板，37。C:t歸過(guò)夜。
⑥ .計(jì)數(shù)器統(tǒng)計(jì)平fei:的噬m^數(shù)量，根據(jù),倍數(shù)計(jì)算噬菌體的濃度。
結(jié)果進(jìn)行5輪富集篩選，每輪從PKIU上洗脫下來(lái)的噬菌體量在總體J^漸升高，與對(duì)照孔 比較實(shí)現(xiàn)了 104倍富集(表1)。表1中五輪的噬菌,用圖1表示。圖1中縱坐標(biāo)用對(duì)數(shù)值表 示，橫坐標(biāo)條輪數(shù)。
表l篩^n特異性結(jié)合的噬菌體
Pl (pfu)空白(pfu)
第一輪3.0X1048.0X102
第二輪9.0X1052.0X103
第三輪2.0X1073.2X103
第四輪6.0X1084.7X103
第五輪7.0X108a5.0X103
a.第五輪繊下的噬菌體量與第四輪持平說(shuō)明對(duì)Plt結(jié)^離體的富集B^雖iJi魅U，更多輪的鵬并不能增
加富集禾鍍。
實(shí)施例3: ELISA檢測(cè)篩選到的噬菌體對(duì)PKRcat艦照結(jié)合能力
① .用NaHC(V溶、，釋蛋白為100|ag/mL的溶液，要求NaHCO3的終濃度為O.IM。加lOO^L該
溶液到96孑L板的兩個(gè)孔中，4'C過(guò)夜固定。同雌照同樣的方法將BSA加入另兩個(gè)孔作對(duì)照。
② .每孔加10(VL3。/。的BSA封閉未結(jié)合蛋白的部分，室溫?fù)u擺平臺(tái)方爐1小時(shí)。
③ .根據(jù)所測(cè)的第五輪冼脫下的噬菌體的濃度，將噬菌體用TBST稀釋，每孔加100nL，噬菌體約
109—101G。室溫?fù)u擺平臺(tái)方燈1小時(shí)。
.齡孔用200W TBST洗6次。
⑤.HRP-抗M13抗體(PhaimaciaBiotech公司)按1:5000用TBST稀釋，每孔加lOO^L,室溫?fù)u擺平臺(tái)體l小時(shí)。
⑥ .針 Lffl TBST洗6次。
⑦ .按60nL四氨基聯(lián)苯胺OMB， Sigma公司，10mg/mL溶于DMSO)力口到10mL l!1i酸-醋酸
鈉(Critate-Ac)中，再加入3(^11202配制底物，每孔加10O|aL所配制的底物顯色。
⑧ .1倂中后加100nLlMH2SO4終ih&應(yīng)。
用RI示儀在OD450^下測(cè)定吸光值。
結(jié)果第五輪得到的特異性噬菌體庫(kù)與PKR^結(jié)合能力繊大于原始噬菌體庫(kù)，第五輪得到 的特異性噬菌體庫(kù)與PKRcat結(jié)合能力也繊大于購(gòu)BSA結(jié)合能力，即第五輪得到的噬菌體庫(kù)能
夠特異性與PKRcat結(jié)合(圖2)。圖2中橫坐標(biāo)4懐不同的噬菌體庫(kù)，輕標(biāo)表示平均凈吸光值，
lib寸様文庫(kù)噬菌體，R5代表第五輪篩超啲特異性噬菌體，白色柱代表與Plt的結(jié)合，黑色柱 代表與對(duì)照的結(jié)合。
實(shí)施例4:單克隆噬菌體的分離制備
1. 特異性結(jié)合的噬菌體克隆的確定
① .在測(cè)定第五輪淵兌噬菌體的平^h挑取IO個(gè)單克隆鑒定多B游列。
② .用滅菌的牙^M取一個(gè)藍(lán)色噬m9王轉(zhuǎn)接^i咅養(yǎng)魏數(shù)中期的規(guī)桿菌ER2738的試管中。③ .37。C搖床培養(yǎng)4—5小時(shí)。
④ .轉(zhuǎn)移培INtl到7mL離心管中，10000ipm離心10射中。
⑤ .將80%的上清吸到新的離心管中，加1/6上清體積的PEG溶液，4'C沉淀2小時(shí)。
⑥ .4'C， 10000rpm離心30射中，緩漫倒出上清，用微餓液器小心^l繊留的液懶及棄。
⑦ .用200nLTBS重懸沉淀，轉(zhuǎn)移懸游!J0.5mL離心管中，4°C ， 10000ipm離心5併中。
⑧ .上清轉(zhuǎn)移到新的0,5mL離心管中，逸就是所挑取的噬菌脾克隆。4'C保存用于測(cè)濃度，如果
要長(zhǎng)期保存，加50%甘油，凍于—2(TC。
2. ffi3iELISA檢測(cè)挑取的單克隆
①.用NaHCO3溶液稀釋蛋白為100iag/mL的溶液，要求NaHC03的終濃度為O.IM。對(duì)于*單 克隆要包MM少兩個(gè)孔， 一個(gè)孔包l炒萬(wàn)篩的蛋白，另一個(gè)孔包被BSA作對(duì)照。每孔加100^iL蛋白，4'C過(guò)夜固定。
② .每孔加100^L3M的BSA封閉未結(jié)合蛋白的部分，室溫?fù)u擺平臺(tái)艘1小時(shí)。
③ .根據(jù)所測(cè)的噬菌脾克隆濃度，將一定量的噬菌脾克隆用TBST稀釋，敏L加100^L，使噬
菌體加入量在109—101Q。室溫J離平臺(tái)體1小時(shí)。
. *孔用200)ul TBST洗6次。
⑤ .抗條1:5000用TBST稀釋，每孔加100^iL，室溫?fù)u擺平臺(tái)驢1小時(shí)。
⑥ .^孑固1BST洗6次。
⑦ .按60(jLTMB(10mg/mL溶于DMSO)加到10mLCritate-Ac中，再加入3|01^202配制底物，每
孑L加lOO^L顯色。
⑧ .1倂中后加100^L1MH2S04終止反應(yīng)。
⑨ .用Kt示儀在OD450nm下測(cè)定吸光值。
結(jié)果10個(gè)單克隆都表現(xiàn)出對(duì)Plt的高結(jié)合性(圖3)。圖3中橫坐標(biāo)標(biāo)不同的n織體 單克隆，縱坐標(biāo)表示平均凈吸光值；白色柱^Plt孔的平均凈吸光值；黑色柱^BSA孔的平 均凈吸光值。圖3中齡噬菌脾克隆均與PKR^及BSA結(jié)合。洗滌后，用辣M:氧化物謝禺聯(lián) M13抗體及其底物誦對(duì)針孑U4行ELISA反應(yīng)，并檢測(cè)OD450nm。對(duì)*克鰣行了兩組檢 測(cè)，圖中 為兩組檢測(cè)的平均值。
實(shí)施例5:噬菌體基因組單鏈DNA的提取和12 ，列的獲得
① .將所挑取的IO個(gè)單克隆噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增。
② .取60nL擴(kuò)增后的單克隆噬菌鵬液，加入20^iLPEG溶液，置于4'C》嫌內(nèi)節(jié)^1夜。
③ .10000rpm離心10射中，棄上清并倒扣離心管，使液術(shù)紘。
.加入200nL碘化物緩沖液，再加入500^L無(wú)水乙醇，室溫孵育10併中。
⑤ .10000ipm離心10射中，棄上清，用70%乙||^先沉淀。
⑥ .10000ipm離心10射中，棄上清，千燥，讓殘余液條發(fā)完全。
⑦ .重懸沉淀于30^L去離子水中，該溶液即該單克隆fl筮菌體的基因組單鏈DNA。
⑧ .以—96 gm弓物(5，-CCCTCATAGTTAGCGTAAC03'， New England Biolabs隨機(jī)十二肽噬菌體展示文庫(kù)產(chǎn)品)測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用Prime Primier軟#0譯，得到多月游列。序列如下
Ser-Val-His-Leu-Tyr-His陽(yáng)Ser國(guó)Thr-Lys-Thr-Leu-Arg Asp-Tyr陽(yáng)Met-Ser陽(yáng)Thr-Leu-Phe-Met-Ala-His-Gln-Thr
實(shí)施例6:固相多肽合成
① .采用Fmoc微魏酸合成的策略，在固相載體上合成多肽；合成完鵬用TFA (三氟乙酸) 切割，乙醚沉淀得到多肽fi^品。
② .用制備色譜(HPLC)純化多肽，得到多膨屯品。
用Merck C18色譜柱，含0.05%的TFA的乙驗(yàn)性梯度冼脫(乙腈濃度在30min內(nèi)從5%變化到 35%)，紫夕卜210nm波長(zhǎng)檢測(cè)，收集單一組分的峰。
③ 質(zhì)譜測(cè)試(MS)。
結(jié)果HPLC峰面積積分比較得到兩種多膨艘均大于95%，質(zhì)譜中目標(biāo)肽的肝離子,口 設(shè)計(jì)肽的理論M量一致，兩啊^驗(yàn)結(jié)果表明獲得了高 的目標(biāo)肽。 實(shí)施例7:合成多肽的競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)
① .用NaHC03溶液稀釋蛋白為20pg/mL的溶液，要求NaHC03的終濃度為0.1M。每孔加60^L，共 48個(gè)孔，4。C過(guò)夜固定。
② .倒掉蛋白液，齡孔用200^iLTBS洗四遍。
③ .每孔加200(^3%的BSA封閉未結(jié)合蛋白的部分，室溫J離平臺(tái)方燈1小時(shí)。
.倒掉BSA液，加入不同濃度梯度的多肽1和多肽2 (6個(gè)梯度)，每 L加100pL，室溫?fù)u擺平 臺(tái)S5(S1小時(shí)。多肽1和多肽2分別以無(wú)，列(ScrambledSequence)為對(duì)照，其它步驟相同。
⑤ .針 1^應(yīng)加入109的噬菌體(如加入多肽1的 L用帶有多肽1的噬菌體去競(jìng)爭(zhēng))，讓其和多 肽競(jìng)爭(zhēng)與蛋白的結(jié)合，室溫?fù)u擺平臺(tái)方燈l小時(shí)。
⑥ .^NPL用200^LTBST洗8次。
⑦ .抗體按1:5000用TBST稀釋，每孔加60pL，室溫?fù)u擺平臺(tái)驢1小時(shí)。
⑧ .齡 L用TBST洗8次。
⑨ .60^LTMB(10mg/mL溶于DMSO)加入到10mLCritate-Ac (pH6.0)中，再加入3^11202即
12為底物，每孑L加lOOpL顯色。90s后加50|oL 1M H2S04終lhS應(yīng)。
⑩.用^fe儀在OD450nm下測(cè)定吸光值。
結(jié)果隨著多肽1和多肽2濃度增加，表征噬菌體與Plt結(jié)合的OD,逐漸斷氐；而無(wú)， 列多肽的加入并不引起0D^的斷氐(圖4)。表明合成多肽1和合成多肽2會(huì),與對(duì)應(yīng)噬菌體競(jìng)爭(zhēng)
結(jié)合PKRcat。
實(shí)施例8:多JWPKR^t激酶活性的影響
① .用DMSO配制5mg/ml多肽(多肽l，多肽2，對(duì)照多肽)儲(chǔ)液，保存于一7(TC冰箱。
② .用緩沖液TBS稀釋多肽l至100ng/raL，對(duì)照多肽至100嗎/mL;用含2XDMSO的TBS ■ 多肽2至10pg/mL。用含2%DMSO的TBS ii^釋多肽1至濃度為50|ig/mL， 10ng/mL， 5pg/raL， l嗎/mL;稀釋多肽2至5嗎/mL， 2.5|ag/mL， l嗎/mL， 0.5|ag/mL。
③ .1(^L不同濃度多肽與50ng純化PKIU混合，冰上孵育15射中。
其佘歩驟與實(shí)施例l (3) PKR^活性的初步分析相同，求得elF2a的磷酸4^號(hào)。
結(jié)果:對(duì)照多月樹PKIU激酶活性沒有影響，多肽1和多肽2抑制PKR^對(duì)elF2 a的磷酸化反應(yīng)(圖 5)。多肽l的IO)約為2.5uM，多肽2的IC5o約為250nM。SEQUENCE LISTING
〈110〉南開大學(xué)
〈120〉與PKR激酶結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的多月級(jí)其應(yīng)用
〈歸2
<210> 1
〈211〉 12
〈212> PRT
〈213〉 AX序列
<220>
〈221〉 PEPTIDE
〈222〉 (1)..(12) 〈223〉
〈400〉 1
Ser Val His Leu Tyr His Ser Thr Lys Thr Leu Arg
1 5 10
〈210〉 2
〈211〉 12
〈212〉 PRT
〈213〉 AI序列
〈220〉
〈221〉 PEPTIDE
〈222〉 (1).. (12) 〈223〉
〈400〉 2
Asp Tyr Met Ser Thr Leu Phe Met Ala His Gin Thr
1 5 10
權(quán)利要求
1.與PKR激酶結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的多肽，其氨基酸序列如下Ser-Val-His-Leu-Tyr-His-Ser-Thr-Lys-Thr-Leu-Arg。
2. 如權(quán)利要求l戶艦的多肽，賺征在于，能與PKR激酶結(jié)構(gòu)鵬異性結(jié)合，并且能柳制 PKR^磷酸化elF2 a的能力，ICso為2. 5 P M 。
3. 權(quán)利要求1戶腿的多肽在開發(fā)PKReat抑制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
一種能夠與PKR激酶結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的多肽及其應(yīng)用。本發(fā)明涉及PKR激酶結(jié)構(gòu)域(PKR_cat)的抑制12肽序列，其氨基酸序列為Ser-Val-His-Leu-Tyr-His-Ser-Thr-Lys-Thr-Leu-Arg。本發(fā)明應(yīng)用噬菌體展示文庫(kù)，篩選能夠與PKR_cat特異性結(jié)合的12肽，該12肽具有與PKR_cat特異性結(jié)合的特性，并且能夠抑制其激酶活性。因此，該12肽對(duì)研究PKR_cat在細(xì)胞調(diào)亡中的作用及PKR_cat抑制劑的開發(fā)具有實(shí)用價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101293917SQ200810053528
公開日2008年10月29日 申請(qǐng)日期2008年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月16日
發(fā)明者常云松, 張宏愷, 張翠竹, 曹又佳, 杜明娟 申請(qǐng)人:南開大學(xué)