專利名稱：人體組織液成分含量傳感器、流體通道單元及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)人體組織液中待測(cè)成分含量的傳感系統(tǒng)。更具體地說，本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)人體組織液中諸如葡萄糖之類的待測(cè)成分的濃度(或含量)的諧振式微懸臂梁傳感器、 一種與這種傳感器一起使用的流體通道單元、 一種采用這種傳感器和流體通道單元檢測(cè)人體組織液中諸如葡萄糖之類的待測(cè)成分的濃度(或含量)的檢測(cè)方法、以及一種感應(yīng)人體組織液中諸如葡萄糖之類的待測(cè)成分含量的傳感器系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
糖尿病是中老年人的常見和多發(fā)病，隨著人們生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率也日益上升，世界衛(wèi)生組織將它和腫瘤，心腦血管病一起列為世界范圍內(nèi)的三大難癥。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，目前世界上約有糖尿病人
1.7億而中國(guó)就大約有糖尿病人3000萬(wàn)，到2025年將增加到3億人。糖尿病早已被列為亞洲前十位殺手之一，它的流行程度已超過感染性疾病的威脅，因此積極預(yù)防和治療糖尿病己迫在眉睫，而人體葡萄糖濃度的精確檢測(cè)是臨床上預(yù)防和治療糖尿病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。
人體葡萄糖濃度的檢測(cè)方法主要包括有創(chuàng)、微創(chuàng)和無(wú)創(chuàng)三種。目前的葡萄糖檢測(cè)方法主要依靠的是有創(chuàng)測(cè)量，即通常需要從病人的手指處取血，然后依靠酶電極等化學(xué)方法，測(cè)定病人血液中葡萄糖的濃度，有創(chuàng)方法在血糖檢測(cè)過程中需要消耗品，每次對(duì)病人進(jìn)行血糖檢測(cè)時(shí)都會(huì)對(duì)病人帶來(lái)一定程度的傷害，給他們帶來(lái)痛苦并有感染的危險(xiǎn)。而且這種方法最大的缺點(diǎn)就是不能實(shí)現(xiàn)對(duì)于人體血糖濃度的動(dòng)態(tài)檢測(cè)，無(wú)法反映病人體內(nèi)血糖濃度的實(shí)時(shí)變化情況，達(dá)不到很好的輔助資料的效果，比如定期的取指血試驗(yàn)經(jīng)常不能探測(cè)到所有的低血糖事件和高血糖事件，特別是夜間的低血糖經(jīng)常是測(cè)不到的，因此能動(dòng)態(tài)和實(shí)時(shí)連續(xù)地監(jiān)測(cè)人體葡萄糖濃度，
6將是糖尿病臨床預(yù)防和治療領(lǐng)域的巨大發(fā)展。
研究中的人體葡萄糖濃度的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)主要包括近紅外光譜法、 中紅外光譜法、拉曼光譜法和旋光測(cè)定法等一系列光學(xué)方法，這些方法在 檢測(cè)葡萄糖濃度的同時(shí)，不會(huì)給人體造成任何創(chuàng)傷，屬于最有前景的技術(shù)， 但由于無(wú)創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)階段檢測(cè)精度有限和可靠性較低等缺點(diǎn)，無(wú)創(chuàng)檢測(cè) 技術(shù)一直未能實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用，目前尚處于研究階段。
鑒于人體葡萄糖濃度有創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)和無(wú)創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，近 年來(lái)基于人體組織液微創(chuàng)抽取和精確分析的人體葡萄糖濃度的微創(chuàng)檢測(cè) 技術(shù)倍受關(guān)注，這一方法所依據(jù)的基本原理是人體組織液中的葡萄糖濃度 與人體血糖濃度有著很高的相關(guān)性。所謂微創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)，就是首先通過微 創(chuàng)、無(wú)痛的方法從人體皮膚表層抽取組織液，然后精確檢測(cè)人體組織液中 的葡萄糖濃度，最后根據(jù)人體組織液中葡萄糖濃度與人體血液中葡萄糖濃 度的相關(guān)性，對(duì)人體的血糖濃度進(jìn)行準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。由于采用低頻超聲透皮 處理和反向離子電滲等一系列方法，可以實(shí)現(xiàn)人體皮膚中組織液的連續(xù)抽 取，微創(chuàng)方法對(duì)于實(shí)現(xiàn)人體血糖濃度的動(dòng)態(tài)和連續(xù)檢測(cè)這一臨床檢測(cè)需求 具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
但是由于人體組織液中含有多種化學(xué)物質(zhì)和微量成分，如何選擇性地 精確檢測(cè)組織液中的微量葡萄糖是微創(chuàng)檢測(cè)方法的關(guān)鍵，同時(shí)人體葡萄糖 濃度的動(dòng)態(tài)和連續(xù)檢測(cè)要求病人實(shí)時(shí)攜帶微創(chuàng)檢測(cè)裝置，因此微創(chuàng)檢測(cè)裝 置必須是小型化的。因此，微小型化的可精確檢測(cè)組織液中微量葡萄糖的 傳感器是微創(chuàng)血糖檢測(cè)技術(shù)的核心。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提出一種用于感應(yīng)人體組織液中 待測(cè)成分含量的傳感器，其可以選擇性地精確檢測(cè)人體組織液中的待測(cè)成 分的濃度，可滿足臨床血糖微創(chuàng)檢測(cè)的要求。
本發(fā)明提供一種用于感應(yīng)人體組織液中待測(cè)成分含量的傳感器，所述
傳感器包括綁定GGBP (D-Galactose/D-Glucose Binding Protein, D-半 乳糖/D-葡萄糖結(jié)合蛋白質(zhì))蛋白質(zhì)的諧振式微懸臂梁，可選擇性地精確 檢測(cè)人體組織液中的微量葡萄糖。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種用于感應(yīng)人體組織液中待測(cè)成分含
量的傳感器，包括微懸臂梁傳感單元，所述微懸臂梁傳感單元包括第一
襯底；微懸臂梁，所述微懸臂梁與所述第一襯底基本上平行，并且所述微
懸臂梁的一端支撐在所述第一襯底上；金膜，所述金膜形成在所述微懸臂 梁的至少一個(gè)側(cè)面上；蛋白質(zhì)層，所述蛋白質(zhì)層形成在所述金膜上，用于
在其表面上吸附人體組織液中的待測(cè)成分；驅(qū)動(dòng)電極，所述驅(qū)動(dòng)電極設(shè)置 在所述第一襯底上；微懸臂梁電極，所述微懸臂梁電極形成在所述第一襯 底上的用于支撐所述微懸臂梁的位置，用于與所述驅(qū)動(dòng)電極結(jié)合以驅(qū)動(dòng)所 述微懸臂梁在垂直于所述第一襯底的方向上諧振；以及檢測(cè)電極，所述檢 測(cè)電極設(shè)置在所述第一襯底上，用于與所述微懸臂梁電極結(jié)合以檢測(cè)所述 微懸臂梁的諧振頻率。
在上述傳感器中，所述金膜形成在所述微懸臂梁的與面對(duì)所述第一襯 底的一側(cè)相反的另一側(cè)的表面上。
在上述傳感器中，利用濺射或蒸發(fā)工藝在由硅制成的微懸臂梁的表面 上淀積金膜。
在上述傳感器中，所述蛋白質(zhì)層包括用于選擇性地吸附人體組織液中 的葡萄糖分子的D-半乳糖/D-葡萄糖結(jié)合蛋白質(zhì)。
在上述傳感器中，所述蛋白質(zhì)層采用胺耦合或者硫醇耦合方式固定在 金膜表面。
在上述傳感器中，所述微懸臂梁的與所述第一襯底相對(duì)的一面和所述 檢測(cè)電極之間構(gòu)成平行板電容器。
進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供一種與上述傳感器一起使用的流體通道單 元，以將人體組織液均勻地吸附在上述傳感器的金膜表面上。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種流體通道單元，包括第二襯 底；以及形成在所述第二襯底上的流體通道，被檢測(cè)的人體組織液可從所 述流體通道中流動(dòng)，以使上述的用于感應(yīng)人體組織液中待測(cè)成分含量的傳 感器中的所述蛋白質(zhì)層與流動(dòng)的被檢測(cè)的人體組織液的表面至少部分地 接觸，從而使人體組織液中的人體組織液分子吸附在所述蛋白質(zhì)層表面 上。
在上述流體通道單元中，所述金膜的表面可用于與在所述流體通道中
8流動(dòng)的蛋白質(zhì)溶液至少部分地接觸，從而在所述金膜上形成所述蛋白質(zhì) 層。
根據(jù)本發(fā)明更進(jìn)一步的方面，提供一種采用上述傳感器和流體通道單 元檢測(cè)人體組織液中待測(cè)成分含量的檢測(cè)方法，包括如下步驟
固有諧振頻率測(cè)量步驟，用于測(cè)量上述用于感應(yīng)人體組織液中待測(cè)成 分含量的傳感器的固有諧振頻率，包括；
施加電壓步驟，在所述驅(qū)動(dòng)電極與微懸臂梁電極之間施加交流驅(qū) 動(dòng)電壓，以使所述微懸臂梁在垂直于所述第一襯底的方向上振動(dòng)；
電容測(cè)量步驟，實(shí)時(shí)測(cè)量所述微懸臂梁振動(dòng)過程中所述第一襯底
上的檢測(cè)電極與所述微懸臂梁電極之間的電容變化；以及
諧振頻率確定步驟，調(diào)節(jié)交流驅(qū)動(dòng)電壓的驅(qū)動(dòng)頻率，重復(fù)電容測(cè) 量步驟，當(dāng)所測(cè)量的電容值的變化達(dá)到最大時(shí)，確定此時(shí)的交流驅(qū)動(dòng)電壓
的驅(qū)動(dòng)頻率為微懸臂梁的第一諧振頻率/。；
吸附步驟，使包含人體組織液的流體接觸所述蛋白質(zhì)層表面，以將 人體組織液中的人體組織液分子吸附在所述蛋白質(zhì)層表面上；
第二諧振頻率測(cè)量步驟，重復(fù)所述的施加電壓步驟、電容測(cè)量步驟和 諧振頻率確定步驟，以測(cè)量吸附人體組織液分子后微懸臂梁的第二諧振頻
率/;;以及
計(jì)算步驟，根據(jù)第一諧振頻率/。和第二諧振頻率/;計(jì)算人體組織液中
待測(cè)人體組織液分子的含量。
在上述人體組織液含量的檢測(cè)方法的所述吸附步驟中，包含人體組織 液的流體在上述流體通道單元的流體通道中流經(jīng)所述蛋白質(zhì)層表面。
上述人體組織液含量的檢測(cè)方法進(jìn)一步包括蛋白質(zhì)層形成步驟，所述 蛋白質(zhì)層形成步驟包括將用于活化所述金膜表面的第一化學(xué)溶液通入所 述流體通道；所述化學(xué)溶液流經(jīng)金膜表面，以對(duì)所述金膜表面進(jìn)行活化， 并通過Au — S形成自組裝分子層；將用于表面耦合的第二化學(xué)溶液和D-半乳糖/D-葡萄糖結(jié)合蛋白質(zhì)分別通入微流體通道；在自組裝分子層表面， 通過胺耦合方式，將D-半乳糖/D-葡萄糖結(jié)合蛋白質(zhì)固定于經(jīng)表面活化處 理的所述金膜的表面。
在上述人體組織液含量的檢測(cè)方法中，所述D-半乳糖/D-葡萄糖結(jié)合蛋白質(zhì)為選擇性吸附葡萄糖分子的D-半乳糖/D-葡萄糖結(jié)合蛋白質(zhì)。
上述人體組織液含量的檢測(cè)方法進(jìn)一步包括形成所述D-半乳糖/D-葡
萄糖結(jié)合蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)形成步驟，所述蛋白質(zhì)形成步驟包括
對(duì)大腸桿菌D-半乳糖/D-葡萄糖結(jié)合蛋白質(zhì)編碼基因mglB進(jìn)行定點(diǎn) 突變，突變的位點(diǎn)包括在E149位點(diǎn)單獨(dú)突變或者E149C+A213S兩點(diǎn)突變 或者在E149、 A213、 L238三個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變；
構(gòu)建過量表達(dá)大腸桿菌野生型D-半乳糖和D-人體組織液結(jié)合蛋白質(zhì) 和突變型D-半乳糖和D-人體組織液結(jié)合蛋白質(zhì)的基因工程菌株；
在搖瓶上對(duì)所形成的工程菌株進(jìn)行發(fā)酵，以穩(wěn)定地表達(dá)D-半乳糖和 D-人體組織液結(jié)合蛋白質(zhì)；以及
對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行GBP蛋白質(zhì)的分離純化。
根據(jù)本發(fā)明再進(jìn)一步的方面，提供一種用于感應(yīng)人體組織液中待測(cè)成
分含量的傳感器系統(tǒng)，包括
上述用于感應(yīng)人體組織液中待測(cè)成分含量的傳感器；以及上述流體通 道單元。
上述傳感器系統(tǒng)進(jìn)一步包括至少兩個(gè)第一自對(duì)準(zhǔn)孔，所述第一自對(duì) 準(zhǔn)孔形成在所述第一襯底的相對(duì)的兩端；至少兩個(gè)第二自對(duì)準(zhǔn)孔，所述第
二自對(duì)準(zhǔn)孔形成在所述第二襯底的相對(duì)的兩端并且分別與所述第一自對(duì)
準(zhǔn)孔相對(duì)應(yīng)；以及多個(gè)支撐柱，所述支撐柱分別設(shè)置在自對(duì)準(zhǔn)孔中，以將 所述微懸臂梁傳感器支撐在所述流體通道單元上并保持在所述流體通道 中流動(dòng)的蛋白質(zhì)溶液與所述金膜的表面至少部分地接觸。
本發(fā)明綁定GGBP蛋白質(zhì)的諧振式微懸臂梁葡萄糖傳感器系統(tǒng)，在結(jié) 構(gòu)上包括諧振式微懸臂梁傳感器和微流體通道單元兩個(gè)部分。測(cè)量中通過 微流體通道單元，使待人體組織液流經(jīng)傳感器的諧振式微懸臂梁敏感單元 表面，由該敏感單元檢測(cè)人體組織液中諸如葡萄糖之類的待測(cè)成分的含 量。諧振式微懸臂梁敏感單元和微流體通道單元兩個(gè)部分可通過鍵合等微 加工工藝集成在一起，構(gòu)成上下兩層的傳感器結(jié)構(gòu)。諧振式微懸臂梁敏感 單元包括微懸臂梁和襯底，微懸臂梁加工在襯底上，微懸臂梁是一個(gè)三明 治結(jié)構(gòu)，包括硅微懸臂梁、金膜和GGBP蛋白質(zhì)三層，襯底上集成有微懸 臂梁的驅(qū)動(dòng)電極和檢測(cè)電極。微流體通道單元包括試樣入口、微流體通道和試樣出口三個(gè)部分，其中試樣入口和試樣出口提供待測(cè)溶液進(jìn)入和流出 微流體通道的接口。
本發(fā)明綁定GGBP蛋白質(zhì)的諧振式微懸臂梁葡萄糖傳感器的工作原理
為
利用綁定在微懸臂梁上表面的GGBP蛋白質(zhì)，選擇性地吸附人體組織 液中的微量葡萄糖；
采用靜電致動(dòng)和電容檢測(cè)相結(jié)合的方法，驅(qū)動(dòng)微懸臂梁在垂直方向上 諧振；
通過測(cè)量吸附葡萄糖分子前后微懸臂梁諧振頻率的變化，檢測(cè)吸附在 微懸臂梁表面的葡萄糖分子的質(zhì)量。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例產(chǎn)生了以下技術(shù)效果
本發(fā)明通過GGBP蛋白質(zhì)選擇性地吸附人體組織液中的葡萄糖分子， 特異性好，能夠很好地降低甚至排除人體組織液中其他化學(xué)成分和微量元 素對(duì)葡萄糖測(cè)量的影響和干擾，綁定的GGBP具有較長(zhǎng)的使用壽命，克服 了傳統(tǒng)酶電極等方式在使用壽命上的不足；
本發(fā)明通過諧振方式檢測(cè)微懸臂梁傳感器表面吸附的葡萄糖分子的質(zhì) 量，具有很高的測(cè)量分辨率，理論分析和計(jì)算表明，通過合適的傳感器結(jié) 構(gòu)設(shè)計(jì)和驅(qū)動(dòng)電子電路設(shè)計(jì)，可提高該傳感器的質(zhì)量分辨率到fg量級(jí)， 以滿足微創(chuàng)葡萄糖檢測(cè)的要求；
本發(fā)明采用微懸臂梁結(jié)構(gòu)，相對(duì)傳統(tǒng)葡萄糖光學(xué)傳感器，器件結(jié)構(gòu)簡(jiǎn) 單，制造工藝簡(jiǎn)單，體積小，重量輕，容易與微流體通道集成，所需外圍 部件少，驅(qū)動(dòng)和檢測(cè)電路簡(jiǎn)單，所需待測(cè)組織液量小。微懸臂梁傳感器單 元和流體通道單元均均可通過微加工技術(shù)批量制造，生產(chǎn)成本很低。


本發(fā)明將參照附圖進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，在附圖中
圖1為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的綁定GGBP蛋白質(zhì)前微懸臂梁傳感器結(jié)構(gòu) 的剖視示意圖2為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的微流體通道單元結(jié)構(gòu)的剖視示意圖3為圖1所示的微懸臂梁傳感器和圖2所示的流體通道單元結(jié)合在一起的剖視示意圖，用于在傳感器的金膜表面綁定GGBP蛋白質(zhì)；
圖4為圖1所示的微懸臂梁傳感器綁定GGBP蛋白質(zhì)后的剖視示意圖 圖5為圖4所示的綁定GGBP蛋白質(zhì)后的微懸臂梁傳感器和圖2所示
的流體通道單元結(jié)合在一起的剖視示意圖，用于在金膜的表面上吸附人體
組織液中諸如葡萄糖分子之類的待測(cè)成分；
圖6為吸附葡萄糖分子后微懸臂梁傳感器上表面物質(zhì)的放大分布示意
圖7為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的微懸臂梁傳感器與微流體通道單元結(jié)合時(shí) 設(shè)有自定位裝配結(jié)構(gòu)的剖視示意圖。
盡管本發(fā)明可以修改為多種變體和可選形式，但是其細(xì)節(jié)已經(jīng)以示例 的方式在附圖中示出并將詳細(xì)描述。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于所述 的特定實(shí)施例的發(fā)明，相反，本發(fā)明覆蓋落入由所附權(quán)利要求限定的本發(fā) 明的保護(hù)范圍內(nèi)的所有變體、等價(jià)物和替代物。
具體實(shí)施例方式
在對(duì)優(yōu)選實(shí)施例的下列描述中，加入了在附圖中的附圖標(biāo)記，結(jié)合圖 解的方式，示出了本發(fā)明可以采用的具體的實(shí)施例。所示的實(shí)施例并不試 圖列出根據(jù)本發(fā)明的所有實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，在不偏離本發(fā)明的保護(hù)范圍 的情況下，可以采用其他的實(shí)施例，也可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)或邏輯上的改變。因 此，下列詳細(xì)的描述并不意味著對(duì)實(shí)施方式的限制。
下面參照?qǐng)D1說明根據(jù)本發(fā)明的一種示例性實(shí)施例的用于感應(yīng)人體組 織液中待測(cè)成分含量的傳感器在綁定GGBP蛋白質(zhì)前的結(jié)構(gòu)，參見圖1，該 傳感器包括微懸臂梁傳感單元，所述流體微懸臂梁傳感單元包括作為基 礎(chǔ)的第一襯底6;微懸臂梁4，該微懸臂梁4與第一襯底6基本上平行， 并且微懸臂梁4的一端被支撐在所述第一襯底上，在一種實(shí)施例中，整個(gè) 微懸臂梁4的形狀可呈"L"形，由此使微懸臂梁4通過所述一端懸于單 元襯底6上，這樣微懸臂梁4的與第一襯底6相對(duì)的一面和檢測(cè)電極2之 間構(gòu)成平行板電容器；金膜5形成在微懸臂梁4的至少一個(gè)側(cè)面上，在一 種示例性實(shí)施例中，金膜5通過形成在微懸臂梁4的與面對(duì)第一襯底6的 一側(cè)相反的另一側(cè)的表面上，即形成金膜5的一側(cè)與第一襯底6相反；驅(qū)動(dòng)電極l，所述驅(qū)動(dòng)電極1形成在第一襯底6上；微懸臂梁電極3，所述 微懸臂梁電極3形成在第一襯底6上的用于支撐所述微懸臂梁的位置，即
微懸臂梁4與第一襯底6接觸的位置，這樣微懸臂梁電極3與驅(qū)動(dòng)電極1 結(jié)合以驅(qū)動(dòng)微懸臂梁4在垂直于第一襯底6的方向上諧振；檢測(cè)電極2， 所述檢測(cè)電極2設(shè)置在第一襯底6上，用于與微懸臂梁電極3結(jié)合以檢測(cè) 微懸臂梁4的諧振頻率。在一種實(shí)施例中，檢測(cè)電極2設(shè)置在驅(qū)動(dòng)電極1 和微懸臂梁電極3之間。在本發(fā)明的示例性實(shí)施例中，采用微加工技術(shù)可 以制造出包含第一襯底6、驅(qū)動(dòng)電極l、檢測(cè)電極2、由例如硅材料制成的 微懸臂梁4和金膜5的集成式微傳感器，其中金膜用于綁定GGBP蛋白質(zhì)。 圖2為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的微流體通道單元結(jié)構(gòu)的剖視示意圖。該流 體通道單元包括第二襯底15;以及形成在第二襯底15上的流體通道7。 微流體通道7包括試樣入口 8和試樣出口 9，其中試樣入口和試樣出口提 供待測(cè)溶液進(jìn)入和流出微流體通道7的接口。在示例性實(shí)施例中，可通過 微加工技術(shù)直接制造出與該傳感器配合使用的微流體通道單元。在本發(fā)明 中，該流體通道單元具有兩種作用，即用于使傳感器單元的金膜5的表面 綁定GGBP蛋白質(zhì)層和用于GGBP蛋白質(zhì)層吸附人體組織液中的待測(cè)分子， 例如葡萄糖分子，從而在GGBP蛋白質(zhì)層11上形成葡萄糖分子層13 (參見 圖6)。
下面結(jié)合附圖3說明在傳感器單元的金膜5表面綁定GGBP蛋白質(zhì)的 操作過程。需要說明的是圖3所示的結(jié)構(gòu)為圖1所示的微懸臂梁傳感器和 圖2所示的流體通道單元結(jié)合在一起的示意圖，即把圖1所示的微懸臂梁 傳感器倒置過來(lái)使微懸臂梁4朝下、第一襯底6朝上，然后將倒置的微懸 臂梁傳感器和圖2所示的流體通道單元上下扣在一起。
在一種示例性實(shí)施例中，參見圖7，通過在微懸臂梁傳感器的第一襯 底6和流體通道單元的第二襯底19上形成的V型自對(duì)準(zhǔn)孔14，將微懸臂 梁傳感器和流體通道單元裝配在一起?？稍谖⒓庸ぶ型ㄟ^各項(xiàng)異性的自停 止腐蝕技術(shù)形成這種V型的自定位孔14。通過第一和第二襯底6和10之 間固定具有預(yù)定長(zhǎng)度的支撐柱10，使得金膜5的表面與微流體通道7表面 緊密接觸。
繼續(xù)參照?qǐng)D3，將用于活化金膜5的表面的化學(xué)溶液通過微泵通入微
13流體通道7，以使化學(xué)溶液以穩(wěn)定的速度流經(jīng)金膜5的表面，對(duì)微懸臂梁
傳感器的金膜5的表面進(jìn)行活化，通過Au—S鍵12 (參見圖6)形成自組 裝分子層。通過微泵將用于表面耦合的化學(xué)溶液和GGBP蛋白質(zhì)分別通入 微流體通道7，在自組裝分子層表面，通過諸如胺耦合或者硫醇耦合之類 的耦合方式，將GGBP蛋白質(zhì)固定于表面活化處理后的微懸臂梁傳感器的 金膜5的表面，由此形成如圖4所示的綁定GGBP蛋白質(zhì)后的傳感器結(jié)構(gòu)。 需要說明的是，本發(fā)明中用于特異性地選擇性吸附葡萄糖分子的GGBP 蛋白質(zhì)，需要采用生物技術(shù)合成，其合成方法和具體步驟為
1、 對(duì)大腸桿菌GGBP蛋白質(zhì)編碼基因mglB進(jìn)行定點(diǎn)突變，突變的位 點(diǎn)包括在E149位點(diǎn)單獨(dú)突變或者E149和A213兩點(diǎn)突變或者在E149、A213 和L238三個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變；
2、 構(gòu)建過量表達(dá)大腸桿菌野生型GGBP蛋白質(zhì)和突變型GGBP蛋白質(zhì) 的基因工程菌株；
3、 在搖瓶上對(duì)工程菌株進(jìn)行發(fā)酵，使GGBP蛋白質(zhì)能夠高水平的穩(wěn)定 表達(dá)；
4、 對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行GGBP蛋白質(zhì)的分離純化，使目標(biāo)蛋白質(zhì)的純度達(dá) 到95%以上。
本發(fā)明的另外一個(gè)方面，在于提供了一種采用上述傳感器和流體通道 單元檢測(cè)人體組織液中待測(cè)成分含量的檢測(cè)方法，包括如下步驟
固有諧振頻率測(cè)量步驟，用于測(cè)量上述用于感應(yīng)人體組織液中待測(cè)成 分含量的傳感器的固有諧振頻率，包括；
施加電壓步驟，在驅(qū)動(dòng)電極1與微懸臂梁電極4之間施加交流驅(qū) 動(dòng)電壓，以使微懸臂梁4在垂直于第一襯底6的方向上振動(dòng)；
電容測(cè)量步驟，實(shí)時(shí)測(cè)量微懸臂梁4振動(dòng)過程中第一襯底6上的 檢測(cè)電極2與微懸臂梁電極3之間的電容變化；以及
諧振頻率確定步驟，調(diào)節(jié)交流驅(qū)動(dòng)電壓的驅(qū)動(dòng)頻率，重復(fù)電容測(cè) 量步驟，當(dāng)所測(cè)量的電容值的變化達(dá)到最大時(shí)，確定此時(shí)的交流驅(qū)動(dòng)電壓 的驅(qū)動(dòng)頻率為微懸臂梁4的第一諧振頻率&
吸附步驟，使包含人體組織液的流體接觸蛋白質(zhì)層ll表面，以將人 體組織液中的人體組織液分子吸附在蛋白質(zhì)層11表面上；
14第二諧振頻率測(cè)量步驟，重復(fù)所述的施加電壓步驟、電容測(cè)量步驟和
諧振頻率確定步驟，以測(cè)量吸附人體組織液分子后微懸臂梁4的第二諧振 頻率A;以及
計(jì)算步驟，根據(jù)第一諧振頻率/。和第二諧振頻率A計(jì)算人體組織液中 待測(cè)人體組織液分子的含量。
本發(fā)明綁定GGBP蛋白質(zhì)的諧振式微懸臂梁葡萄糖傳感器所依據(jù)的基 本原理是，當(dāng)微懸臂梁4的表面通過GGBP選擇性吸附葡萄糖分子后，微 懸臂梁的諧振頻率將發(fā)生變化，微懸臂梁4的諧振頻率可表達(dá)為
1
2;r V w
其中m^為微懸臂梁的有效質(zhì): 下式表示
"——(N/m) 4 /3、 ,
(1)
A為微懸臂梁的彈性常數(shù)，并可用
(2)
其中^為微懸臂梁4的楊氏模量，w, /和f分別為微懸臂梁4的寬度、 長(zhǎng)度和厚度。當(dāng)微懸臂梁4通過GGBP蛋白質(zhì)吸附葡萄糖分子后，微懸臂 梁4的有效質(zhì)量的變化dW將引起傳感器諧振頻率的變化，Jm對(duì)微懸臂 梁4的彈性常數(shù)的影響一般認(rèn)為可以忽略不計(jì)，微懸臂梁有效質(zhì)量的變 化zlw可用下式表述
△m =
A;
4;r'
丄
7
(3)
由上述三式可知，微懸臂梁4有效質(zhì)量的變化zf/n與微懸臂梁4的楊 氏模量和幾何參數(shù)有關(guān)，
但由于本發(fā)明中的微懸臂梁4的結(jié)構(gòu)實(shí)際上是包括硅微懸臂梁4、金 膜5和GGBP蛋白質(zhì)層11等三個(gè)主要部分的復(fù)合結(jié)構(gòu)，因此在綁定GGBP 蛋白質(zhì)后，需要利用復(fù)合膜結(jié)構(gòu)力學(xué)理論對(duì)微懸臂梁的總楊氏模量f和有
改質(zhì)量柳^予以計(jì)算，并通過納米壓痕儀等力學(xué)測(cè)試設(shè)備對(duì)這些參數(shù)在計(jì) 享的基礎(chǔ)上進(jìn)行試驗(yàn)標(biāo)定，從而實(shí)現(xiàn)傳感器對(duì)葡萄糖分子質(zhì)量的精確檢
測(cè)'具體而言，在完成諧振式微懸臂梁4與微流體通道單元的設(shè)計(jì)與制造、
GGBP蛋白質(zhì)的生物合成與綁定、綁定GGBP蛋白質(zhì)的諧振式微懸臂梁葡萄 糖傳感器參數(shù)的標(biāo)定等工作之后，根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)人體組織液中諸如葡
萄糖之類的待測(cè)成分含量的檢測(cè)方法包括如下步驟
步驟SIO、測(cè)量綁定GGBP蛋白質(zhì)后的諧振式微懸臂梁葡萄糖傳感器
(如圖4所示)的固有諧振頻率，具體測(cè)量方法和過程為
步驟Sll:在如圖4所示的第一襯底6上的驅(qū)動(dòng)電極1與微懸臂梁電極 3之間施加交流驅(qū)動(dòng)電壓，使微懸臂梁4在垂直與第一襯底6的方向上開 始振動(dòng)；
步驟S12:實(shí)時(shí)測(cè)量微懸臂梁振動(dòng)過程中檢測(cè)電極2與微懸臂梁電極3 之間的電容變化。
步驟所13:通過掃頻方式，在一定范圍內(nèi)以一定頻率間隔，掃描調(diào)節(jié)
交流驅(qū)動(dòng)電壓的驅(qū)動(dòng)頻率，同時(shí)實(shí)時(shí)檢測(cè)步驟S12中的電容值。當(dāng)電容值 的變化達(dá)到最大時(shí)，微懸臂梁4將處于諧振狀態(tài)。此時(shí)交流驅(qū)動(dòng)電壓的第 一頻率/。即為微懸臂梁的固有諧振頻率；
步驟S20:停止靜電驅(qū)動(dòng)，將包含金膜5和GGBP的微懸臂梁4的傳感 器倒置過來(lái)。利用如圖2所示的微流體通道結(jié)構(gòu)，通過微懸臂梁傳感器的 第一襯底6和微流體通道單元的第二襯底15上的V型自對(duì)準(zhǔn)孔14，將傳 感器和流體通道單元裝配在一起。V型自對(duì)準(zhǔn)孔14的結(jié)構(gòu)與自定位裝配過 程如圖7所示。可在微加工中通過各項(xiàng)異性的自停止腐蝕技術(shù)形成這種V 型的自定位孔14。通過兩個(gè)襯底之間固定長(zhǎng)度的支撐柱10，使得GGBP表 面與微流體通道表面緊密接觸，從而形成如圖5所示的結(jié)構(gòu)；
步驟S30:利用圖5所示的結(jié)構(gòu)，將包含葡萄糖分子的人體組織液通 過微泵通入微流體通道，并使人體組織液以穩(wěn)定的速度流經(jīng)GGBP蛋白質(zhì) 層11的表面。通過GGBP蛋白質(zhì)層11將人體組織液中的葡萄糖分子吸附 在GGBP蛋白質(zhì)層11的表面上。此時(shí)微懸臂梁傳感器表面的物質(zhì)成分和結(jié) 構(gòu)如圖6所示，；
步驟S40:圖5所示的結(jié)構(gòu)中，移去下面的微流體通道結(jié)構(gòu)，從而將 微懸臂梁傳感器恢復(fù)至如圖4所示的狀態(tài)。需要注意的是，此時(shí)GGBP蛋 白質(zhì)層11表面將形成葡萄糖分子層13 (如圖6所示)，重復(fù)步驟Sll至步
1驟S13，測(cè)量吸附葡萄糖分子后微懸臂4新的諧振頻率力；
步驟S50:利用實(shí)施例上述公式(3)，計(jì)算出GGBP蛋白質(zhì)層所吸附的
人體組織液中葡萄糖分子的質(zhì)量。
盡管本發(fā)明提出的是一種用以測(cè)量人體組織液中葡萄糖濃度的綁定
GGBP蛋白質(zhì)的諧振式微懸臂梁葡萄糖傳感器，但是基于微加工技術(shù)，該傳 感器可以被擴(kuò)展成由多個(gè)微懸臂梁構(gòu)成的多傳感器陣列結(jié)構(gòu)，本發(fā)明中的 微流體通道結(jié)構(gòu)也可以相應(yīng)地?cái)U(kuò)展成微流體多通道陣列結(jié)構(gòu)，通過在不同 的微懸臂梁表面綁定對(duì)不同物質(zhì)具有選擇性吸附能力的蛋白質(zhì)(或抗體一 抗原)。進(jìn)一步地，這種陣列式的微懸臂梁傳感器可以對(duì)人體組織液中除 葡萄糖外的其他多種微量物質(zhì)或化學(xué)成分進(jìn)行一次性的快速多參數(shù)測(cè)量。 本發(fā)明公開和揭示的所有組合和方法可通過借鑒本文公幵內(nèi)容產(chǎn)生， 盡管本發(fā)明的組合和方法已通過詳細(xì)實(shí)施過程進(jìn)行了描述，但是本領(lǐng)域技 術(shù)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和裝 置進(jìn)行拼接或改動(dòng)，或增減某些部件，更具體地說，所有相類似的替換和 改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說是顯而易見的，他們都被視為包括在本發(fā)明精 神、范圍和內(nèi)容之中。
權(quán)利要求
1、一種用于感應(yīng)人體組織液中待測(cè)成分含量的傳感器，包括微懸臂梁傳感單元，所述微懸臂梁傳感單元包括第一襯底；微懸臂梁，所述微懸臂梁與所述第一襯底基本上平行，并且所述微懸臂梁的一端支撐在所述第一襯底上；金膜，所述金膜形成在所述微懸臂梁的至少一個(gè)側(cè)面上；蛋白質(zhì)層，所述蛋白質(zhì)層形成在所述金膜上，用于在其表面上吸附人體組織液中的待測(cè)成分；驅(qū)動(dòng)電極，所述驅(qū)動(dòng)電極設(shè)置在所述第一襯底上；微懸臂梁電極，所述微懸臂梁電極形成在所述第一襯底上的用于支撐所述微懸臂梁的位置，用于與所述驅(qū)動(dòng)電極結(jié)合以驅(qū)動(dòng)所述微懸臂梁在垂直于所述第一襯底的方向上諧振；以及檢測(cè)電極，所述檢測(cè)電極設(shè)置在所述第一襯底上，用于與所述微懸臂梁電極結(jié)合以檢測(cè)所述微懸臂梁的諧振頻率。
2、 如權(quán)利要求1所述的傳感器，其中所述金膜形成在所述微懸臂梁 的與面對(duì)所述第一襯底的一側(cè)相反的另一側(cè)的表面上。
3、 如權(quán)利要求2所述的傳感器，其中利用濺射或蒸發(fā)工藝在由硅制 成的微懸臂梁的表面上淀積金膜。
4、 如權(quán)利要求1所述的傳感器，其中所述蛋白質(zhì)層包括用于選擇性 地吸附人體組織液中的葡萄糖分子的D-半乳糖/D-葡萄糖結(jié)合蛋白質(zhì)。
5、 如權(quán)利要求4所述的傳感器，其中所述蛋白質(zhì)層采用胺耦合或者 硫醇耦合方式固定在金膜表面。
6、 如權(quán)利要求1所述的傳感器，其中所述微懸臂梁的與所述第一襯 底相對(duì)的一面和所述檢測(cè)電極之間構(gòu)成平行板電容器。
7、 一種流體通道單元，包括 第二襯底；以及形成在所述第二襯底上的流體通道，被檢測(cè)的人體組織液可從所述流 體通道中流動(dòng)，以使如權(quán)利要求1 — 5所述的用于感應(yīng)人體組織液中待測(cè)成分含量的傳感器中的所述蛋白質(zhì)層與流動(dòng)的被檢測(cè)的人體組織液的表 面至少部分地接觸，從而使人體組織液中的人體組織液分子吸附在所述蛋 白質(zhì)層表面上。
8、 如權(quán)利要求7所述的流體通道單元，其中所述金膜的表面可用于 與在所述流體通道中流動(dòng)的蛋白質(zhì)溶液至少部分地接觸，從而在所述金膜 上形成所述蛋白質(zhì)層。
9、 一種人體組織液中待測(cè)成分含量的檢測(cè)方法，包括如下步驟 固有諧振頻率測(cè)量步驟，用于測(cè)量如權(quán)利要求l一5所述的用于感應(yīng)人體組織液中待測(cè)成分含量的傳感器的固有諧振頻率，包括；施加電壓步驟，在所述驅(qū)動(dòng)電極與微懸臂梁電極之間施加交流驅(qū) 動(dòng)電壓，以使所述微懸臂梁在垂直于所述第一襯底的方向上振動(dòng)；電容測(cè)量步驟，實(shí)時(shí)測(cè)量所述微懸臂梁振動(dòng)過程中所述第一襯底上的檢測(cè)電極與所述微懸臂梁電極之間的電容變化；以及諧振頻率確定步驟，調(diào)節(jié)交流驅(qū)動(dòng)電壓的驅(qū)動(dòng)頻率，重復(fù)電容測(cè) 量步驟，當(dāng)所測(cè)量的電容值的變化達(dá)到最大時(shí)，確定此時(shí)的交流驅(qū)動(dòng)電壓 的驅(qū)動(dòng)頻率為微懸臂梁的第一諧振頻率/。；吸附步驟，使包含人體組織液的流體接觸所述蛋白質(zhì)層表面，以將 人體組織液中的人體組織液分子吸附在所述蛋白質(zhì)層表面上；第二諧振頻率測(cè)量步驟，重復(fù)所述的施加電壓步驟、電容測(cè)量步驟和 諧振頻率確定步驟，以測(cè)量吸附人體組織液分子后微懸臂梁的第二諧振頻 率力；以及計(jì)算步驟，根據(jù)第一諧振頻率/。和第二諧振頻率A計(jì)算人體組織液中 待測(cè)人體組織液分子的含量。
10、 如權(quán)利要求9所述的人體組織液含量的檢測(cè)方法，其中在所述吸 附步驟中，人體組織液在如權(quán)利要求6所述的流體通道單元的流體通道中 流經(jīng)所述蛋白質(zhì)層表面。
11、 如權(quán)利要求9所述的人體組織液含量的檢測(cè)方法，進(jìn)一步包括蛋 白質(zhì)層形成步驟，所述蛋白質(zhì)層形成步驟包括將用于活化所述金膜表面的第一化學(xué)溶液通入所述流體通道； 所述化學(xué)溶液流經(jīng)金膜表面，以對(duì)所述金膜表面進(jìn)行活化，并通過Au一S形成自組裝分子層；將用于表面耦合的第二化學(xué)溶液和D-半乳糖/D-葡萄糖結(jié)合蛋白質(zhì)分 別通入微流體通道；在自組裝分子層表面，通過胺耦合或者硫醇耦合方式，將D-半乳糖/D-葡萄糖結(jié)合蛋白質(zhì)固定于經(jīng)表面活化處理的所述金膜的表面。
12、 如權(quán)利要求11所述的人體組織液含量的檢測(cè)方法，其中所述D-半乳糖/D-葡萄糖結(jié)合蛋白質(zhì)為選擇性吸附葡萄糖分子的D-半乳糖/D-葡 萄糖結(jié)合蛋白質(zhì)。
13、 如權(quán)利要求12所述的人體組織液含量的檢測(cè)方法，進(jìn)一步包括 形成所述D-半乳糖/D-葡萄糖結(jié)合蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)形成合成步驟，所述蛋 白質(zhì)合成步驟包括對(duì)大腸桿菌D-半乳糖/D-葡萄糖結(jié)合蛋白質(zhì)編碼基因mglB進(jìn)行定點(diǎn) 突變，突變的位點(diǎn)包括在E149位點(diǎn)單獨(dú)突變或者E149C+A213S兩點(diǎn)突變 或者在E149、 A213、 L238三個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變;構(gòu)建過量表達(dá)大腸桿菌野生型D-半乳糖/D-葡萄糖結(jié)合蛋白質(zhì)和突變 型D-半乳糖/D-葡萄糖結(jié)合蛋白質(zhì)的基因工程菌株；在搖瓶上對(duì)所形成的工程菌株進(jìn)行發(fā)酵，以穩(wěn)定地表達(dá)D-半乳糖/D-葡萄糖結(jié)合蛋白質(zhì)；以及對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行GBP蛋白質(zhì)的分離純化。
14、 一種用于感應(yīng)人體組織液中待測(cè)成分含量的傳感器系統(tǒng)，包括 如權(quán)利要求l一5所述的用于感應(yīng)人體組織液中待測(cè)成分含量的傳感器；以及如權(quán)利要求6所述的流體通道單元。
15、 如權(quán)利要求14所述的傳感器系統(tǒng)，進(jìn)一步包括 至少兩個(gè)第一自對(duì)準(zhǔn)孔，所述第一自對(duì)準(zhǔn)孔形成在所述第一襯底的相對(duì)的兩端；至少兩個(gè)第二自對(duì)準(zhǔn)孔，所述第二自對(duì)準(zhǔn)孔形成在所述第二襯底的相 對(duì)的兩端并且分別與所述第一自對(duì)準(zhǔn)孔相對(duì)應(yīng)；以及多個(gè)支撐柱，所述支撐柱分別設(shè)置在自對(duì)準(zhǔn)孔中，以將所述微懸臂梁 傳感器支撐在所述流體通道單元上并保持在所述流體通道中流動(dòng)的蛋白質(zhì)溶液與所述金膜的表面至少部分地接觸。
全文摘要
一種用于感應(yīng)人體組織液中待測(cè)成分含量的傳感器，包括微懸臂梁傳感單元，該微懸臂梁傳感單元包括第一襯底；微懸臂梁，與所述第一襯底平行，并且所述微懸臂梁的一端支撐在所述第一襯底上；金膜，形成在所述微懸臂梁的至少一個(gè)側(cè)面上；蛋白質(zhì)層，形成在所述金膜上，用于在其表面上吸附人體組織液中的葡萄糖分子；驅(qū)動(dòng)電極，設(shè)置在所述第一襯底上；微懸臂梁電極，形成在所述第一襯底上的用于支撐所述微懸臂梁的位置，用于與所述驅(qū)動(dòng)電極結(jié)合以驅(qū)動(dòng)所述微懸臂梁在垂直于所述第一襯底的方向上諧振；以及檢測(cè)電極，設(shè)置在所述第一襯底上，用于與微懸臂梁電極結(jié)合以檢測(cè)所述微懸臂梁的諧振頻率。本發(fā)明還提供一種流體通道單元、傳感器系統(tǒng)、以及人體組織液中待測(cè)成分含量的檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)G01N33/66GK101514990SQ20081005793
公開日2009年8月26日 申請(qǐng)日期2008年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月21日
發(fā)明者徐可欣, 栗大超 申請(qǐng)人:天津市先石光學(xué)技術(shù)有限公司