專利名稱：人體重要寄生蟲抗原芯片及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，特別是用于檢測血清中人體重要寄生蟲抗體的 抗原芯片及其制備方法。
背景技術：
日本血吸蟲病仍在我國7省市流行，有些地區(qū)出現(xiàn)疫情回升，據(jù)統(tǒng)計我國 現(xiàn)有血吸蟲感染人數(shù)達80多萬。隨著國民生活水平的提高，飲食多樣化、生鮮 菜肴時尚化等社會因素導致食源性寄生蟲病流行狀況發(fā)生明顯變化， 一些本已 基本控制的食源性寄生蟲病如華支睪吸蟲病、肺吸蟲病和原來較為少見的食源 性寄生蟲病如廣州管圓線蟲病、曼氏裂頭呦病發(fā)生再流行或小范圍暴發(fā)流行。 根據(jù)2001 2004第二次全國人體重要寄生蟲病現(xiàn)狀調(diào)查，華支睪吸蟲等食源性 寄生蟲感染率明顯上升，估計我國現(xiàn)有華支睪吸蟲感染者1200多萬，肺吸蟲、 囊蟲感染者200多萬。1996年之前在我國大陸極為少見的廣州管圓線蟲病，分 別在溫州、福州、北京等地發(fā)生暴發(fā)流行，引起嚴重的公共衛(wèi)生問題。裂頭蚴 病的病例數(shù)也在不斷增多。因臨床上缺乏簡便易行、準確的診斷試劑，寄生蟲 病被誤診或漏診的現(xiàn)象較為普遍，給患者帶來極大的痛苦。特別是豬囊蟲、曼 氏裂頭蚴、肺吸蟲、血吸蟲、廣州管圓線蟲、旋毛蟲、棘顎口線蟲、弓形蟲侵 入人體后，其幼蟲或成蟲或蟲卵可移行寄生在腦、眼、肝、肺、心等人體重要 臟器，嚴重時甚至危及生命。
查見蟲卵、幼蟲或成蟲等病原體雖可確診，但是這些寄生蟲的寄生部位多 變，病原學檢測存在很大的局限性。如，腦脊液中廣州管圓線蟲的檢出率僅1 3%，血吸蟲病、華支睪吸蟲病、肺吸蟲病糞檢陽性率僅30 50%，囊蟲、曼氏裂
頭呦、旋毛蟲、弓形蟲需組織活檢病原體，當寄生在深部組織時病原學檢査受 到限制。因此，這些寄生蟲病的病原學診斷遠遠不能滿足臨床診治的要求，血 清中特異性抗體檢測結果通常是這些寄生蟲病診斷和鑒別診斷的重要依據(jù)。
生物芯片技術是新近發(fā)展起來的高新技術，集生物信息學、材料學、自動 化等交叉學科的優(yōu)勢，能對生物信息進行快速、高效、準確的檢測分析。生物
芯片被認為是繼大規(guī)模集成電路之后的又一次具有深遠意義的科學技術革命。 生物芯片根據(jù)芯片上的探針不同可以分為基因芯片和蛋白芯片兩大類。芯片上 固定的探針是特定的基因片段，稱為基因芯片。芯片上固定的探針是蛋白質或 多肽類分子，稱為蛋白芯片。若蛋白芯片上固定的均為特異性抗原，這種蛋白 芯又可稱之為抗原芯片。在臨床醫(yī)學中，感染性疾病免疫診斷主要依靠抗原和 抗體的檢測。因此，在生物芯片領域中，對感染性疾病的早期診斷、療效考核 上，蛋白芯片明顯優(yōu)于基因芯片。利用蛋白芯片技術同時對多種疾病的標志物 (特異性抗體或抗原等)進行平行檢測分析，使得用常規(guī)方法需要多次檢測才 能完成的檢驗工作在蛋白芯片上僅需一次就可以完成，并且多項指標平行檢測 分析，結果更準確可靠。
現(xiàn)有蛋白芯片技術的檢測系統(tǒng)大多用熒光標記，雖然靈敏度高，但檢測 時需用昂貴的特殊儀器設備，大大限制了該技術在臨床上推廣應用。
國內(nèi)外已有血吸蟲、肺吸蟲、華支睪吸蟲、囊蟲、旋毛蟲、廣州管圓線蟲、 弓形蟲抗體檢測試劑和相關的研究報道，但多為單項寄生蟲抗體檢測。由于這 些寄生蟲病的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，醫(yī)務人員難以確定是何種寄生蟲感染時， 需用單項試劑盒一一進行檢測，每次檢測只能完成一個指標，不僅速度慢、效 率低、費用高，而且待檢樣本的量要大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡易、快速、不需特殊儀器設備，且能同時完成 多種人體重要寄生蟲抗體平行檢測的抗原芯片及制備方法。
本發(fā)明將對人體危害嚴重的血吸蟲、肺吸蟲、華支睪吸蟲、囊蟲、曼氏裂 頭呦、旋毛蟲、廣州管圓線蟲、弓形蟲等寄生蟲的抗原陣列點樣于固相膜性載 體上，采用特制的垂直流芯片檢測裝置，應用顏色鮮艷的膠體金二抗結合物或
膠體金蛋白A結合物為檢測標記物，檢測病人血清中人體重要寄生蟲特異性Y免 疫球蛋白(IgG)。血清中IgG抗體在層層滲濾過程中與膜上抗原發(fā)生特異性結 合，用膠體金標記物檢測與抗原特異性結合的人IgG。僅需幾分鐘就能同時完成 人血清樣本中多種寄生蟲抗體指標檢測，具有高通量、操作簡單，使用方便，
適用于寄生蟲病臨床檢驗和血清流行病學調(diào)査。
本發(fā)明集現(xiàn)代免疫學技術、生物芯片高新技術和膠體金標記技術為一體， 將對人體危害較嚴重、診斷較難的血吸蟲病、肺吸蟲病、華支睪吸蟲病、囊蟲 病、曼氏裂頭呦病、旋毛蟲病、廣州管圓線蟲病、弓形蟲病等寄生蟲的抗原以
微陣列形式密集在一張10X10 mm大小的固相膜性載體上，只需一次采樣、加 樣檢測，就能完成上述所有寄生蟲的特異性抗體指標檢測，并且多種寄生蟲抗 體指標平行檢測，有利于結果比較分析，可大大提高診斷的可靠性。
本發(fā)明涉及一種人體重要寄生蟲抗原芯片，檢測系統(tǒng)由人體重要寄生蟲
抗原陣列點樣芯片、特制垂直流芯片反應體系、金標液、洗脫液組成。
本發(fā)明涉及的一種人體重要寄生蟲抗原芯片，其垂直流芯片反應體系由 垂直流芯片反應器、吸水墊料和固相膜性載體組成。芯片反應器為由聚丙烯
反應盒，分底座、反應盒蓋有一10X10mm方形反應檢測示窗。
本發(fā)明人體重要寄生蟲抗原芯片的制備方法，包括以下步驟
1) 將人體重要寄生蟲抗原探針用pH為7. 0 8. 5的磷酸鹽緩沖液(PBS) 配制成0.2 2mg/ml的蛋白濃度，用芯片自動點樣儀將抗原探針和內(nèi)參照質控 點人Y免疫球蛋白(IgG)點樣在孔徑為0.2 0.65pm的硝酸纖維素膜或醋酸纖 維素混合膜上，20 25'C放置2小時，或4 10。C放置過夜。
2) 將抗原芯片置垂直流芯片反應器檢測示窗下方，下面襯以吸水墊料和反 應盒底座，反應盒蓋和底座扣緊，4 2(TC密封保存。
本發(fā)明涉及人體重要寄生蟲抗原芯片的制備方法，其點樣密度、蛋白點的 大小、點間距，可隨抗原樣品數(shù)的數(shù)目而改變；點樣密度9 25點/cm2，點樣量 10 200 nl/點。
人體重要寄生蟲抗原和內(nèi)參照質控人Y免疫球蛋白(IgG)以矩陣列點樣在一 張10XlOmm的膜性載體上，同屬吸蟲類的華支睪吸蟲(Cls)、并殖吸蟲(Pw)、 日本血吸蟲抗原(Sj)依次相鄰排列，同屬線蟲的旋毛蟲(Ts)、廣州管圓線蟲(Ac) 抗原相鄰排列，同屬絳蟲的豬囊蟲(Cyt)、曼氏裂頭蚴(Sm)抗原相鄰排列，內(nèi)參 照質控點人Y免疫球蛋白(IgG) (C)居中，起座標作用。
本發(fā)明涉及的人體重要寄生蟲抗原芯片，包括點陣列抗原芯片、垂直流芯 片反應體系、膠體金標記顯色體系。
本發(fā)明人體重要寄生蟲抗原芯片所涉及的點陣列抗原芯片包括固相膜性載 體和陣列式分布的寄生蟲抗原與內(nèi)參照質控人IgG。固相膜性載體可以是孔徑為 0. 2 0. 65|am的硝酸纖維素膜或硝酸醋酸混合纖維素膜。人體重要寄生蟲抗原可 以是蟲源性粗抗原或部分純化抗原組分或重組抗原，如l)華支睪吸蟲(Cls)， 為成蟲可溶性抗原；2)并殖吸蟲抗原(Pw)，可以是衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲可溶性 抗原或排泄分泌抗原；3)日本血吸蟲抗原(Sj)，可以是蟲卵可溶性抗原、成 蟲可溶性抗原或尾蚴膜可溶性抗原；4)囊蟲抗原(Cyt)，可以是囊液抗原或囊
尾呦可溶性抗原或兩者的層析純化抗原；5)曼氏裂頭呦抗原(Sm)，可以是裂頭 呦可溶性抗原或29~36kDa純化抗原；6)廣州管圓線蟲抗原(Ac)，可選用III~V 期幼蟲可溶性抗原或成蟲可溶性抗原；7)旋毛蟲抗原(Ts)，可為感染期幼蟲 可溶性抗原；8)弓形蟲抗原(Tox)可選用全蟲抗原或排泄分泌抗原。
本發(fā)明人體重要寄生蟲抗原芯片所述的人體重要寄生蟲抗原和內(nèi)參照質3 控人IgG，點樣前用pH為7. 0 8. 5的PBS稀釋到蛋白濃度為0. 2 2. 0mg/ml。 PBS稀釋液的配方0.2g/L氯化鉀，1.44g/L磷酸氫二鈉，0. 24g/L磷酸二氫 鉀，8g/L氯化鈉。
本發(fā)明人體重要寄生蟲抗原芯片所述的人體重要寄生蟲抗原和內(nèi)參照質控 人IgG矩陣排列為9~11個蛋白樣品按3X3點陣，點陣密度9點/cm2; 1215 個蛋白樣品按3X4點陣，點陣密度12點/cm2; 16 19個蛋白樣品按4X4點陣， 點陣密度16點/cm2; 20 24個蛋白樣品按4X5點陣，點陣密度20點/cm2; 25 個蛋白樣品按5X5點陣，點陣密度25點/cm2。
本發(fā)明人體重要寄生蟲抗原芯片所涉及的垂直流芯片反應器，為長 65mm、寬30腿、高18mm的塑料小盒，分底座和盒蓋，盒蓋右側有一 IO咖X 10mm 的方孔，即芯片的反應檢測示窗，左側留有空白處可記錄樣本編號等信息，如 示意圖1。底座和盒蓋之間有腔室，用于置吸水墊料，能充分吸納樣本檢測時流 下的液體?？乖酒梅磻獧z測示窗正下方的吸水墊料上，盒蓋和底座扣合時 使得芯片與盒蓋、墊料緊密接合，保證樣本檢測時，示窗中的反應液勻速垂直 流下。
本發(fā)明人體重要寄生蟲抗原芯片所涉及的金標液制備方法0.01%氯金酸 (HAuCl4)溶液100ml加熱煮沸，攪拌下加入l^檸檬酸鈉2 6ml，繼續(xù)加熱至 溶液呈酒紅色，冷卻至室溫，用新鮮配制的0.2MK2C03溶液調(diào)pH值至6.0 9.0 條件下標記抗人IgG二抗或膠體金(SPA)，加少量PEG20000， 4 1(TC高速離心 濃縮膠體金標記物，用pH為6. 0 8. 5，濃度為0. 01 0. 05M的三羥甲基氨基甲 烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液(TBS)稀釋至工作濃度，4 20。C避光保存。
本發(fā)明人體重要寄生蟲抗原芯片所涉及的洗脫液配方100ml 0.01 0.05M TBS (PH7. 0 8. 5)，加0. 05 0. 1克疊氮鈉、10 100|ul吐溫-20、 10 100|ul 曲拉通X-IOO，攪拌混勻。
上述人體重要寄生蟲抗原芯片制備方法的具體步驟如下
1、抗原準備
血吸蟲、肺吸蟲、華支睪吸蟲、囊蟲、曼氏裂頭蚴、旋毛蟲、廣州管圓線 蟲、弓形蟲等寄生蟲抗原點樣前用抗原稀釋液稀釋至工作濃度。
2、 最佳抗原工作濃度確定
每一種抗原用抗原稀釋液稀釋成0、 0. 1、 0. 2、 0. 4、 0. 8、 1. 0、 1. 5、 2. 0mg/ml 蛋白濃度，再加O. lmg/ml人IgG為內(nèi)參照質控，共9個樣品，按 3X3陣列點樣制成最佳抗原工作濃度篩選芯片，用該芯片檢測30份健康人 血清、30份病人血清，以特異性、敏感性最高的最小抗原濃度為最佳抗原點樣 濃度。
3、 點樣制備抗原芯片
寄生蟲抗原加內(nèi)參照質控人IgG，按抗原樣品數(shù)目設計的點陣排列方式和位 置，用芯片自動點樣儀接觸式點樣。點陣形式為矩形陣列，點直徑為0. 5 1. 5mm， 點間距O. 5 1.0mm，抗原陣列大小為6. 5 9. OmmX6. 5 9. Omm。點樣后置4 20°C 24小時，使抗原蛋白質與膜性載體牢固結合。
4、芯片反應器組裝
反應器底座空槽內(nèi)置滿吸水墊料，將抗原芯片放置在吸水墊料上，抗原芯片 的位置和方向與反應器盒蓋上方形反應檢測示窗吻合，反應器底座和盒蓋合攏 扣緊，密封包裝后置4 2(TC保存。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點1)高通量，最多可以同時進行24種人體重要寄生 蟲抗體指標平行檢測；2)采用垂直流檢測裝置，操作簡易、快速，整個檢測過 程僅需3 5分鐘；3)采用膠體金標記，肉眼直接判讀結果，不需特殊儀器設 備，非常適合臨床即時檢測和流行病學調(diào)查；4)所需樣本量少， 一次檢測只需 30 50微升血清。


圖1為垂直流抗原芯片反應器平面圖，其中1)為樣品信息記錄處；2)為 反應檢測示窗。
圖2為3X3抗原點排列位置示意圖，第一排華支睪吸蟲抗原(Cls)、并
殖吸蟲抗原(Pw)、日本血吸蟲抗原(Sj);第二排旋毛蟲抗原(TS)、人IgG
(C)、囊蟲抗原(Cyt);第三排廣州管圓線蟲抗原(Ac)、弓形蟲抗原(Tox)、 曼氏裂頭蚴抗原(Sm)。
具體實施例方式
實施例1:
人體重要寄生蟲抗原芯片檢測方法
8種人體重要寄生蟲抗原和1個內(nèi)參照質控人IgG，共9個蛋白樣品，設定 3X3點樣陣列，點樣量100nl，抗原點直徑l. 5腿，點間距1.2腿，抗原陣列大 小為7. 5 mmX7. 5 mm，芯片大小12 mmX 12腿；3X3抗原點陣列，如示意圖2。
按制備抗原芯片數(shù)目多少裁剪一定面積的孔徑為0. 45pm的硝酸纖維素膜。 用pH8.2 PBS分別將華支睪吸蟲成蟲可溶性抗原(Cls)、衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲可 溶性抗原(Pw)、日本血吸蟲蟲卵可溶性抗原(Sj)、廣州管圓線蟲成蟲抗原(Ac)、 曼氏裂頭呦可溶性抗原(Sm)、旋毛蟲幼蟲可溶性抗原(Ts)稀釋至0.5mg/ml， 將囊蟲囊液粗抗原(Cyt)稀釋至0.2mg/ml，將弓形蟲全蟲抗原(Tox)稀釋至 2.0mg/ml，人IgG稀釋至O. lg/ml，用自動點樣儀接觸式點樣，點樣針吸取稀釋 好的抗原樣品及內(nèi)參照質控人IgG后直接點印至硝酸纖維素膜。在一張膜上， 芯片按一個方向依次點樣排列，做好抗原芯片上抗原排列方向記號。點樣后20 25。C放置2小時，使抗原蛋白與硝酸纖維素膜充分結合固定。隨后將按12 mmX 12 mm大小一張張裁剪抗原芯片。
取芯片反應器底座，凹槽內(nèi)放置好吸水墊料，再將抗原芯片放在盒蓋反應 檢測示窗相對應的位置上，注意抗原芯片上下不要顛倒，然后取反應盒蓋與底 座對準，確定芯片的抗原陣列位于盒蓋反應檢測示窗中央后扣合。將裝配好抗 原芯片的反應器，用鋁鉑紙密封包裝，4 2(TC保存。
實施例2:
病人血清樣本檢測
取出裝配好抗原芯片的反應器一只，置水平臺面上，在芯片反應器反應檢 測示窗的方孔中加洗脫液(PH7.0， 0.02M TBS， 0.05%疊氮鈉，0. 05%吐溫-20， 0. l%Triton-100) 50^1，待完全滲入后，加待檢病人血清50^1，待完全滲入后 加洗脫液50|al，待完全滲入后加金標液50nl，待完全滲入后加洗脫液50^1， 待完全滲入后，可肉眼判讀結果或用掃描儀掃描保存檢測結果。每一操作步驟 之間應連續(xù)進行，整個檢測流程僅需3 5分鐘。結果判斷位于中央的內(nèi)參照 質控點顯示紅色小圓點為本次檢測有效，不顯示紅色小圓點，提示本次檢測無 效；觀察8個相應寄生蟲抗原點位置，出現(xiàn)抗原點大小的紅色圓點為該寄生蟲 抗體陽性，不出現(xiàn)紅色圓點為該寄生蟲抗體陰性。
權利要求
1、人體重要寄生蟲抗原芯片，其特征在于檢測系統(tǒng)由人體重要寄生蟲抗原陣列點樣芯片、垂直流芯片反應體系、金標液、洗脫液組成。
2、 根據(jù)權利要求l所述的寄生蟲抗原芯片，其特征是垂直流芯片反應體系 由芯片反應器、吸水墊料和固相膜性載體組成。
3、 根據(jù)權利要求l所述的人體重要寄生蟲抗原芯片的制備方法，其特征在 于抗原芯片的制備方法包括以下步驟1) 將人體重要寄生蟲抗原探針用pH為7. 0 8. 5的磷酸鹽緩沖液(PBS) 配制成0.2 2mg/ml的蛋白濃度，用芯片自動點樣儀將抗原探針和內(nèi)參照質控 點人Y免疫球蛋白(IgG)點樣在孔徑為0.2 0.65|Lim的硝酸纖維素膜或醋酸纖 維素混合膜上，20 25。C放置2小時，或4 10'C放置過夜。2) 將抗原芯片置垂直流芯片反應器檢測示窗下方，下面襯以吸水墊料和反 應盒底座，反應盒蓋和底座扣緊，4 2(TC密封保存。
4、 根據(jù)權利要求3所述的人體重要寄生蟲抗原芯片的制備方法，其特征在于點樣密度、蛋白點的大小、點間距，可隨抗原樣品數(shù)的數(shù)目而改變。
5、 根據(jù)權利要求3所述的人體重要寄生蟲抗原芯片的制備方法，其特征在 于點樣密度9 25點/cm2，點樣量10 200 nl/點。
6、 根據(jù)權利要求3所述的人體重要寄生蟲抗原芯片的制備方法，其特征在 于人體重要寄生蟲抗原和內(nèi)參照質控人Y免疫球蛋白(IgG)以矩陣列點樣在一張 10X10mm的膜性載體上，抗原排列設計為同屬吸蟲類的華支睪吸蟲(Cls)、并殖 吸蟲(Pw)、日本血吸蟲抗原(Sj)依次相鄰排列，同屬線蟲的旋毛蟲(Ts)、廣州 管圓線蟲(Ac)抗原相鄰排列，同屬緣蟲的豬囊蟲(Cyt)、曼氏裂頭呦(Sm)抗原相 鄰排列，內(nèi)參照質控點人IgG(C)居中，起座標作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術領域，特別是用于檢測血清中人體重要寄生蟲抗體的抗原芯片及其制備方法。本發(fā)明將對人體危害嚴重的血吸蟲、肺吸蟲、華支睪吸蟲、囊蟲、曼氏裂頭蚴、旋毛蟲、廣州管圓線蟲、弓形蟲等寄生蟲的抗原陣列點樣于固相膜性載體上，采用特制的垂直流芯片檢測裝置，應用顏色鮮艷的膠體金二抗結合物或膠體金蛋白A結合物為檢測標記物，檢測病人血清中人體重要寄生蟲特異性γ免疫球蛋白(IgG)。血清中IgG抗體在層層滲濾過程中與膜上抗原發(fā)生特異性結合，用膠體金標記物檢測與抗原特異性結合的人IgG。僅需幾分鐘就能同時完成人血清樣本中多種寄生蟲抗體指標檢測，具有高通量、操作簡單，使用方便，適用于寄生蟲病臨床檢驗和血清流行病學調(diào)查。
文檔編號G01N33/569GK101339190SQ20081006234
公開日2009年1月7日 申請日期2008年5月19日 優(yōu)先權日2008年5月19日
發(fā)明者干小仙, 施曉華, 越 王 申請人:浙江省醫(yī)學科學院