專利名稱：一種豚鼠氣單胞菌膠體金快速檢測試紙條的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種豚鼠氣單胞菌檢測試紙條在 水產動物疾病診斷上的應用。
背景技術：
豚鼠氣單胞菌"eroy^/7as ca^ae)是水產養(yǎng)殖中常見的致病菌，傳染途徑 為通過損傷的皮膚或傷口侵襲宿主，具有發(fā)病快、流行廣、導致死亡率高等特 點，嚴重影響水產養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。按常規(guī)的細菌分離鑒定診斷豚鼠氣單胞菌復 雜費時，易延誤防治時機，因此，建立準確、及時的診斷技術是控制豚鼠氣單 胞菌危害的基本前提。國內對豚鼠氣單胞菌病的診斷也進行了一系列的研究， 如利用兔抗豚鼠氣單胞菌多克隆抗體、抗豚鼠氣單胞菌單克隆抗體建立的ELISA 檢測方法應用于豚鼠氣單胞菌的免疫學檢測，雖然他們都能在幾小時內診斷出 豚鼠氣單胞菌，具有較高的特異性和靈敏度，但存在技術要求高、設備比較昂 貴等缺點；另外，豚鼠氣單胞菌噬菌體診斷技術雖然操作簡便，但存在一定的 交叉反應。已建立的這些方法都存在著不便于基層生產應用、設備要求高、檢 測時間長等缺點。針對豚鼠氣單胞菌在水產動物中的流行狀況以及防治要求， 對豚鼠氣單胞菌的診斷，不但要求較高的特異性和靈敏度，還需要快速、簡便， 適合于基層水產生產者、基層水產技術推廣單位和水產動物檢疫的使用。膠體金免疫層析技術由于其快速、便捷，不需特殊設備，結果判斷直觀等 優(yōu)勢，越來越受到人們的重視。本發(fā)明利用單克隆抗體和膠體金標記技術建立 豚鼠氣單胞菌膠體金免疫層析快速檢測方法。發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于公開一種豚鼠氣單胞菌的膠體金快速檢測試紙條，并提 供該試紙條的制備方法，應用于水產病原檢測，具有特異、準確、快速、操作 簡單、現場檢測、高通量檢測、易于推廣應用的優(yōu)勢。應用該試紙條檢測豚鼠 氣單胞菌全過程不超過10min。本發(fā)明制備的檢測豚鼠氣單胞菌的膠體金快速檢測試紙條，該試紙條從上 到下依次重疊固定有吸水紙、免疫硝酸纖維素膜、金標抗體結合墊、樣品墊， 金標抗體結合墊上干燥結合了膠體金標記的抗豚鼠氣單胞菌單克隆抗體或抗豚 鼠氣單胞菌多克隆抗體；免疫硝酸纖維素膜的檢測線上包被了抗豚鼠氣單胞菌 單克隆抗體或抗豚鼠氣單胞菌多克隆抗體、質控線包被了抗鼠IgG抗體或葡萄 球菌A蛋白。本發(fā)明提供的檢測豚鼠氣單胞菌的膠體金快速檢測試紙條采用如下方法制備(1) 金標抗體結合墊的制備制備膠體金顆粒，并采用標記體系標記抗豚 鼠氣單胞菌單克隆抗體或多克隆抗體，將金標抗體在支持膜上固相化；(2) 免疫硝酸纖維素膜的制備在硝酸纖維素膜檢測線位置上包被抗豚鼠 氣單胞菌單克隆抗體或抗豚鼠氣單胞菌多克隆抗體，質控線位置上包被抗鼠IgG抗體或葡萄球菌A蛋白；(3) 將吸水紙、免疫硝酸纖維素膜、金標抗體結合墊、樣品墊、底板組裝 成膠體金快速檢測試紙條。本發(fā)明的積極效果在于(1) 低價格產品生產流程簡單，生產成本低；(2) 檢測速度快全過程10min內完成；(3) 可用于生產現場檢測、高通量檢測；(4) 高質量本方法制備而成的試紙條特異性好、靈敏度高、重復性好；(5) 操作簡單本方法制備而成的試紙條以膠體金作為指示標記，快速定 性，結果準確、快速，操作簡便，只需要加樣檢測與結果記錄步驟；(6) 易于推廣使用操作人員無需專業(yè)培訓，按說明書即可完成操作。


附圖為本發(fā)明豚鼠氣單胞菌膠體金快速檢測試紙條的組裝結構圖1、樣品墊2、金標抗體結合墊3、檢測線位置 4、質控線位置 5、免疫硝酸纖維素膜6、吸水紙7、底板。
具體實施方式
本發(fā)明的具體實施方式
參照下面的實施例進行詳細說明，但并不局限于此。 具體來說，本檢測試紙條采用如下方法制備 U)抗豚鼠氣單胞菌單克隆抗體的制備取雜交瘤細胞株在體外常規(guī)培養(yǎng)、傳代后，用Balb/c小鼠腹腔注射制備腹水，并經過純化提純單克隆抗體；(2) 膠體金顆粒的制備采用還原劑將氯金酸還原成膠體金顆粒；(3) 抗豚鼠氣單胞菌單克隆抗體膠體金標記物的制備將上述膠體金溶液 的pH值調值7.6-10，將膠體金溶液與抗豚鼠氣單胞菌單克隆抗體混合均勻，并使膠體金與抗體形成穩(wěn)定的膠體金復合物，在通過純化、濃縮后形成膠體金標記物；(4) 抗豚鼠氣單胞菌多克隆抗體的制備用豚鼠氣單胞菌多次免疫新西蘭 兔，獲得血清，純化得多克隆抗體；(5) 將抗豚鼠氣單胞菌單克隆抗體金標記物噴涂在支持膜上，將豚鼠氣單胞菌單克隆抗體或多克隆抗體和抗鼠IgG抗體噴涂在硝酸纖維素膜上，烘干；(6) 將免疫硝酸纖維素膜、金標抗體結合墊、樣品墊、吸水墊等依次粘在 底板上；(7)將粘好的底板材料切成一定寬度的試紙條。如果制作成試紙板則再將 制成的試紙條裝到一定大小的塑料盒內即可。實施例l.膠體金顆粒的制備 1材料與方法1. 1試驗材料三角瓶500mL—個，三角瓶100mL—個、量筒500mL—個、量筒100mL 一個、檸檬酸、氯金酸、移液管10mL—條、電子天平 1.2試驗方法1.2.1三角瓶、量筒、移液管經洗凈并用雙蒸水沖洗，再經1%雙氯硅垸/氯仿 浸泡lh，烘干。1.2.2將三角瓶、量筒、移液管用超純水清洗干凈備用。 1.2.3用超純水配置0.01。/。四氯化金溶液500mL、 lX檸檬酸溶液10mL。 1.2.4取500mL三角瓶一個，加500 mL0.01o/。氯金酸溶液，加熱至沸騰； 1.2.5取8mL 1%檸檬酸鈉加入上述溶液中，迅速混勻，再保持沸騰15min， 溶液顏色首先變黑，再逐漸變紅。2、 試驗結果經過電子顯微鏡、紫外分光光度計波長掃描觀察測定，光譜掃描最大吸收 峰在254 nm處，所制備的膠體金顆粒均勻度較高，電子顯微鏡測定顆粒直徑為 25 nm。實施例2.單克隆抗體的建株 1材料與方法 1.1 試驗材料U.l儀器C02培養(yǎng)箱，無菌罩，臺式離心機，液氮罐，倒置顯微鏡，熒光顯微鏡，酶聯免疫檢測儀，手持電動移液器，單孔、多孔微量移液槍。l丄2材料50mL和lOOmL細胞培養(yǎng)瓶；圓底離心管50mL;塑料離心管 5-20mL;康氏管、華氏管；移液管l-20mL;彎頭、直頭滴管，菌種瓶(玻璃、 塑料)l-1.5mL;橡皮頭，96、 24孔細胞培養(yǎng)板；96孔酶標板，l-50mL注射器。 l丄3 培養(yǎng)基RPMI-1640，小牛和胎牛血清，8-氮雜鳥嘌呤，HAT， HT。l丄4 試劑雙抗，7.5%NaHC03， PEG, DMSO，液體石蠟，兔抗鼠酶標二抗、 1.2雜交融合實驗 1.2.1雜交瘤細胞復蘇1.2.1.1 SP2/0細胞的制備收集SP2/0細胞，于50mL離心管內，lOOOonin" 離心5min，棄上清，將SP2/O細胞重懸在10mL培養(yǎng)基中備用。 1.2丄2 Balb/c小鼠免疫脾細胞的制備取三免3 5d內的免疫小鼠無菌將脾臟 完整地剪下，移到平皿中，剪除多余的脂肪和結締組織，用彎頭眼科鑷子的背 部反復輕壓脾臟，充分搗碎脾內細胞，用培養(yǎng)液將含有脾細胞的懸液吹打數次， 然后將脾細胞移到離心管內，1000r.min"離心5min，棄上清，在手背部反復磨 擦，直至細胞團基本散開。L2丄3將低滲處理的脾細胞離心，棄上清，松弛細胞團，重懸在10mL培養(yǎng) 基中，并進行計數。 1.2.2雜交融合1.2.2.1 SP2/0細胞和免疫脾細胞按1:2 1:5比例混合，混勻，同上離心5min， 棄上清，同上松弛細胞團。1.2.2.2緩慢加入lmL細胞融合劑，同時不斷地旋轉離心瓶。 1.2.2.3 3min內緩慢加入3mL RPMI-1640。 1.2..2.4 3min內緩慢加入9mLRPMI-1640。1.2.2.5 3min內緩慢加入20mL RPMI-1640。兩掌中搓捻離心管3min。同上離心， 棄上清，松弛細胞團。將細胞重懸在15M牛血清和HAT的全價選擇培養(yǎng)基。按 每mL10S個SP2/O細胞中做進一步稀釋，并移到一無菌的加樣槽中，用8孔微 量移液器，將細胞分裝到96孔培養(yǎng)板中，每孔0.1mL， 5。/。C02中培養(yǎng)到第五d， 每孔加0.1mL新的HAT培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)5d。1.2.2.6于第8 12d，觀察雜交瘤細胞的生長情況，待雜交瘤細胞長至占孔底二 分之一時或培養(yǎng)液顏色偏黃時，在細胞板上做好標記，首先是板的標記，然后 是孔的坐標，分別將待檢的上清移到無菌處理的舊板內，每孔取0.1mL，然后進 行抗體活性測定。第二批及第三批長大的細胞，按上述方法分批檢測，對于有 雜交瘤細胞生長細胞孔，生長時間超過12d的進行半量換液。當用于檢測的上 清移走后，馬上加入等量新鮮的HT培養(yǎng)基。 1.3細胞克隆取對數生長期的細胞，吹打成細胞懸液，滴加培養(yǎng)基中混勻后滴1滴于計 數板上計數，調整使終濃度大約20ceUs.mL'1，然后向96孔培養(yǎng)板每孔滴加1滴 (約含1個細胞)，5%C02 37T:培養(yǎng)。隔天觀察克隆細胞生長情況，挑選只含一 個細胞克隆的孔，做好標記并補加培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。待克隆長至孔底面積的 1/3~1/2時，轉至24孔板擴大培養(yǎng)。 1.4陽性雜交瘤細胞的擴大培養(yǎng)初篩檢測為抗體陽性的雜交瘤細胞擴大到24孔細胞培養(yǎng)板先用10(HiL微 量移液槍吹打原孔懸浮細胞，將細胞移到24孔板中，加lmL新鮮的HT培養(yǎng)基 同時在原孔中也加O.lmLHT培養(yǎng)基5%(:02培養(yǎng)24~48h，進行2次檢測。 1.5陽性雜交瘤細胞的特異性分析用ELISA、間接熒光法(FA)或其他方法如菌體凝集試驗、血球凝集抑制、 中和保護試驗等對擴大培養(yǎng)的細胞進行進一步的分析檢測。對于檢測出良好特 異性的或具有其他功能的雜交瘤細胞盡快進行克隆。 2試驗結果通過細胞融合后的陽性克隆化、特異性篩選，共建立3株抗豚鼠氣單胞菌 細胞株單克隆細胞株。分別為1F10、 0E10、 1C4。實施例3.單克隆抗體腹水的制備 1材料與方法 1.1試驗材料Balb/c小鼠，6~8周齡；液體石蠟12廠C滅菌15min， 4。C保存?zhèn)溆?；lmL、 2mL塑料一次性無菌注射器，針頭(5#、 6#);對數生長期的雜交瘤細胞。 1.2試驗方法1.2.1 Balb/c小鼠誘導注射雜交瘤前1 2周，每只小鼠腹腔注射滅菌的液體石 蠟0.2就，分籠飼養(yǎng)。1.2.2注射雜交瘤先取少量細胞上清液檢測抗體的活性和滴度，對數生長期 內的雜交瘤細胞吹打收集，1000 1500r.min"離心5min沉淀細胞，用不含血清的 培養(yǎng)基約0.5~lmL重懸，每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5mL。 1.2.3收集腹水約7 10d后觀察小鼠腹部，有明顯腹水者用12井針頭由腹腔下 側穿刺回收腹水，3000r.min"離心5min，沉淀紅細胞及血細胞，收集上層淡黃 色的腹水，次日測定腹水效價，做好標記，長期保存的凍于-8(TC，短期可凍于 畫20。C 。2試驗結果通過腹水制備，共獲取抗豚鼠氣單胞菌單克隆抗體腹水3株，各約20mL。實施例4.單克隆抗體的純化 1材料與方法 1.1 試驗材料飽和硫酸銨pH7.1、超純水、0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PB) pH7.2、辛酸。 1.2試驗方法1.2.1 血清10mL經10000 r.min"離心10min去除沉淀，上清加10mL純水2 倍比稀釋。1.2.2 20%飽和硫酸銨(SAS)沉淀向20mL血清稀釋液內緩慢滴加冰冷的硫 酸銨5mL，邊滴加邊混勻，則液體的硫酸銨終濃度為20%飽和度。室溫靜置2h。1.2.3 4000r.min"離心10min，去除沉淀，上清滴加SAS 3.57mL ，終濃度30%飽和度，4t:靜置過夜。1.2.4 5000r,min"離心10min，分離沉淀和上清。沉淀重懸于4mL生理鹽水成 4.5mL溶液，在磁力攪拌的條件下滴加SAS 1.9mL至終濃度30%飽和度，繼續(xù) 磁力攪拌30min (壓加冰杯冷卻)，4。C反應2h， 4000 r.min"離心10min，沉淀重 懸于4mL生理鹽水成4.5mL溶液，滴加SAS 3mL至終濃度60%飽和度，4000 r.min"離心10min，沉淀4。C保存?zhèn)溆谩?.2.5取鼠腹水兩次硫銨沉淀后透析過夜. 1.2.6用紫外分光光度計測其濃度.1.2.7把蛋白稀釋至8 10mg.mi;1再用相應濃度的醋酸液2倍體積作用0 10min后加入辛酸，室溫作用25min， 4'C作用30min。1.2.8 4000r.min"離心10min后，取上清棄沉淀，PBS透析。實施例5.抗鼠IgG抗體的制備 1材料與方法 1.1 試驗材料經純化后的鼠抗豚鼠氣單胞菌的多抗血清7mg、不完全弗氏佐劑、完全弗氏 佐劑、新西蘭兔。 1.2試驗方法1.2.1免疫劑量每只新西蘭兔注射抗原1.5mL。1.2.2免疫程序首免抗原加等量的完全弗氏佐劑，腹腔注射1.5mL， 2 3周內 進行二免，抗原加等量不完全弗氏佐劑， 一個月后三免，并進行抗體效價檢測。 1.2.3免疫結束，通過頸動脈割取血，經5000r.min"離心后收集血清，無菌分 裝，-8(TC保存?zhèn)溆谩?2試驗結果獲得兔抗鼠IgG抗體血清60mL。實施例6.抗體的親和純化 1材料與方法 1.1試驗材料含IgG的樣品、PBS、裝有2mL固相化的蛋白A小型層析柱、透析袋、分 步收集器、蠕動泵、UV監(jiān)測器、pH計。 結合緩沖液 O.lmol丄-1 Tris-HCl pH7.5 + 0.15 mol丄"NaCl。 洗脫緩沖液0.1 mol丄-1 Gly-HCl pH2.8+0.15 moLI/1 NaCl。中和緩沖液 1 mol丄"Tris-HCl pH 8.0。 1.2試驗方法 1.2.1樣品(血清、腹水)。 1.2.2樣品與結合緩沖液l:l稀釋混合。1.2.4至少用10mL結合緩沖液，以lmL.min"速度，洗滌柱中的2mL親和層析 介質。1.2.5上樣。1.2.6樣品進入凝膠后，用結合緩沖液洗柱(至少IO個柱體積)，直至A280nm 小于0.03。1.2.7用洗脫緩沖液洗脫所結合的IgG，分布收集每管2mL。1.2.8收集過程中，每管立即加入O.lmL中和緩沖液，以中和洗脫所得的IgG液。1.2.9含IgG的各管對PBS透析，其后根據抗體的穩(wěn)定性，加入防腐劑，4'C或冷凍保存。2試驗結果獲得兔抗鼠多克隆抗體血清5mg， 3個細胞株的單克隆抗體各2mg。實施例7.配對抗體的選擇 1材料與方法 1.1 試驗材料0.1 mol丄'1 PBS pH7.4 1000mL， HRP酶底物OPD 500mL，鄰苯二胺(OPD)， H2O2(30%) ，PBST(PBS+0.1。/。Tween-20)2000mL，封閉液(抗體稀釋液)100mL， 2mol丄-1 H2S04。 1.2試驗方法1.2.1包被包被量根據具體條件有所不同，包被蛋白用PBS稀釋至濃度范圍 l^.mL'LsO^ig.mL-1,可設不同抗體稀釋度來確定最佳使用量。每孔50|iL。 4 'C過夜或者室溫3h后封閉。1.2.2封閉棄去包被液，以含2%牛血清的PBST封閉，每孔80^L， L5 2h 后棄去封閉液，經PBST洗滌一次拍干。1.2.3 —抗 一抗用抗體稀釋液稀釋至適當濃度，毎孔50mL，室溫孵育1.5h左 右，PBST洗三遍，拍干。1.2.4 二抗用抗體稀釋液稀釋(約1:100(M:2000)，每孔50pL，室溫孵育lh， PBST洗三遍，蒸餾水洗一遍，拍干。1.2.5顯色加H2(V活化的opd毎孔50mL，置37。C濕盒(避光)，每十分鐘觀 察一次，當顯色較強時(大約15min后，顯棕黃色)，加終止液2mol丄"H2S04每 孔50|jL，置于酶聯免疫檢測儀中492nm波長處讀數。2試驗結果純化后的豚鼠氣單胞菌單克隆抗體的效價分別為104，兔抗鼠IgG抗體效價 為106。間接測定表明鼠單克隆抗體與兔多克隆抗體的可形成夾心免疫復合物。實施例8.抗體的膠體金標記以及金標抗體結合墊的制備 1材料與方法 1. 1 試驗材料膠體金溶液、單克隆抗體、10% NaCl、 25 mmol.L-1 K2C03、 1 mol.U1 HC1、 1.5mL試管、玻璃纖維素膜。 1.1試驗方法1. 1. 1蛋白與膠體金結合最佳pH測定1.1.1.1取若干個1.5mL試管，分別加入1.5mL25nm膠體金。1. 1.1.2用0.05 mol七"K2C03和0.1 mol七"HC1將膠體金溶液的pH分別調為3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11。1.1.1.3分別加入單克隆抗體20pL，濃度為lmg，ml/1，迅速混勻，室溫下放 置30 min。1.1.1.4每孔分別加入5%KC1 50^L，混勻后靜置4h。 1.1.1.5觀察顏色變化較小的組，記錄pH (X)值。1.1.1.6 將pH調為X-0.8、 X-0.6、 X-0.4、 X-0.2、 X、 X+0.2、 X+0.4、 X+0.6、 X+0.8、 X+l，重復(l. 1. 1. 1)-( 1. 1. 1.5)步。1.1.1.7觀察顏色變化較小的組為穩(wěn)定組，該pH值為最適標記酸堿度。 l丄2最小蛋白濃度的確定1.1.2.1 蛋白經過10000 r.min"離心20 min，棄沉淀。 1丄2.2抗體濃度調至lmg.mU1。L1.2.3用0.05 moLL"K2C03和0.1 mol丄'1 HC1將膠體金溶液調至最適pH值。 1.1.2.4 10000 r.min"離心20 min，棄沉淀。1丄2.5取一 96孔滴定板，每個重復為3個孔，分別加入最佳pH的膠體金 100pL。L1.2.6各孔依次加入蛋白(1， 2， 3， 4， 5， 6 25pL)，混勻，室溫下放置40min。1.1.2.7 加入20 10% NaCl,混勻后靜置4h。1丄2.8觀察顏色變化較小的組，記錄加入的蛋白量，該蛋白濃度為抗體的最適 標記濃度。l丄3單克隆的膠體金標記L1.3.1取兩個50mL試管，分別加入10mL 25 nm膠體金。1.1.3.2 加入適量0.2moLU1 moll/1 K2C03把調整pH。1.1.3.3 冰浴條件下，加入抗體反應20min， 4°C 12000 rmin"離心60 min，棄上清。1.1.3.4用0.2mol.U1硼酸鹽緩沖液(1%BSA、 0.02% PEG、 0.3%Tween-20、 0.1moU"NaCl) 10mL重懸沉淀。1.1.3.5 4。C 12 000 r'min"離心60 min，棄上清。1.1.3.6 重復(1.1.3.4—1.1.3.5) 1次。1.1.3.7 0.05 mol'I/1 PB (1%BSA、 0.02% PEG、 12%蔗糖、0.3%Tween-20、 l%NaN3， 0.1 mol'L"NaCl)重懸沉淀，4。CIC存?zhèn)溆?。l丄4金標抗體結合墊的制備將標記好的免疫膠體金調整到合適的濃度，均勻的噴涂在支持膜上，在37 -C溫箱中過夜烘干后，密封包裝置于4'C冰箱備用。2試驗結果形成其中1F10單克隆抗體的膠體金標記配方，配方組成為標記體系pH 值為9.6;最佳蛋白包被濃度為lO嗎.mL'1，膠體穩(wěn)定劑為PEG、牛血清白蛋白， 濃度分別為0.02%， 1%，抗體保護劑為蔗糖12%，離子濃度為0.05mol丄"的磷 酸鹽緩沖液和0.1 mol丄-1 NaCl，表面活性劑為tween-20，濃度為0.3%。同時將膠體金標記的抗體噴涂到支持膜上，冷凍干燥，制成金標抗體結合墊備用o實施例9.免疫硝酸纖維素膜的制備 1材料與方法 U試驗材料Milliporel35硝酸纖維素膜，單克隆抗體，兔抗鼠多克隆抗體，bio-dot膠體 金噴點系統(tǒng)。 1.2試驗方法1.2.1將硝酸纖維素膜用3%的甲醇溶液浸泡飄洗后，迅速輕柔洗干，干燥。 1.2.2將上述的硝酸纖維素膜置于含有一定離子濃度、表明活性劑、聚合物濃 度的緩沖液中漂洗潤濕后，取出，37'C烘干備用。1.2.3將抗豚鼠氣單胞菌單克隆抗體、兔抗鼠IgG抗體分別加入bio-dot膠體金 噴點系統(tǒng)的檢測線、質控線的儲存瓶中，調整劃膜的位置，調整劃膜的量與速 度，進行噴膜劃線。1.2.4將劃好檢測線、質控線的硝酸纖維素膜置于37"C溫箱中烘干2h后取出。1.2.5取出硝酸纖維素膜置于中性蛋白中浸泡潤濕后立即取出，置于37。C溫箱 中烘干4h后，密封保存在4'C冰箱備用。 2試驗結果制備了具有免疫活性的檢測線和質控線，并將空白位點封閉了的免疫硝酸 纖維素膜。實施例IO.試紙條的組裝 1材料與方法 1.1試驗材料底板、吸水紙、免疫硝酸纖維素膜、金標抗體結合墊、樣品墊、塑料外殼。 1.2試驗方法1.2.1將吸水紙、免疫硝酸纖維素膜、金標抗體結合墊、樣品墊分別裁成寬為2.5 cm、 2cm、 0.5 cm、 1.5cm的長條形。 1.2.2將底板裁成寬6cm的長條形。1.23將免疫硝酸纖維素膜沿不干膠底板的長軸方向、距不干膠底板上邊沿 2.2cm、下邊1.8cm位置粘貼。1.2.4將吸水紙與免疫硝酸纖維素膜重疊0.3cm處粘貼在硝酸纖維素膜的上方。 1.2.5將金標抗體結合墊與免疫硝酸纖維素膜重疊O.lcm處粘貼在免疫硝酸纖 維素膜的下方。1.2.6樣品墊與金標抗體結合墊重疊O.lcm粘貼在金標抗體結合墊的下方。 1.2.7將從上到下依次固定有將吸水紙、免疫硝酸纖維素膜、金標抗體結合墊、 樣品墊的底板裁切成寬X長為0.4cmX6cm的長條，即成測試條，與干燥劑一起 裝入鋁箔袋內，密封貯存。 2試驗結果經過組裝、剪裁、干燥、密封步驟，即可組裝成豚鼠氣單胞菌膠體金快速 檢測試紙條。實施例ll.檢測方法 1材料與方法 1.1試驗材料檢測樣本、豚鼠氣單胞菌膠體金快速檢測試紙條。 1.2試驗方法1.2.1待檢樣品的處理固態(tài)樣本如發(fā)病動物病灶組織、水產品或細菌培養(yǎng)物等 樣本，取25g加蒸餾水研磨離心或靜置待沉淀取上層清液；血液、腹水等液體 樣本可直接抽取檢測樣本；含菌量較少的樣品可經過培養(yǎng)基增菌后取菌液直接 檢測；1.2.2將豚鼠氣單胞菌膠體金快速檢測試紙條恢復室溫；1.2.3拆開試紙條密封袋，取出檢測試紙條，抽取檢測樣本150pL，緩慢加入 檢測卡上的加樣孔內；1.2.45min后觀察檢測試紙條的顯色情況，記錄結果。 2試驗結果若質控線與檢測線在5min內都顯色，則結果判定為陽性，可進行病原菌的 鑒定。若質控線顯色，檢測線不顯色則判定結果為陰性。 若檢測線、質控線都不顯色則結果判定為試紙條變質失效。
權利要求
1、一種豚鼠氣單胞菌膠體金快速檢測試紙條，該試紙條從上到下依次重疊固定有吸水紙(6)、免疫硝酸纖維素膜(5)、金標抗體結合墊(2)、樣品墊(1)，其特征在于金標抗體結合墊上干燥結合了膠體金標記的抗豚鼠氣單胞菌單克隆抗體或抗豚鼠氣單胞菌多克隆抗體；免疫硝酸纖維素膜的檢測線上包被了抗豚鼠氣單胞菌單克隆抗體或抗豚鼠氣單胞菌多克隆抗體、質控線包被了抗鼠IgG抗體或葡萄球菌A蛋白。
2、 一種權利要求l所述的豚鼠氣單胞菌膠體金快速檢測試紙條的制備方法，其 特征在于該試紙條的制備方法包括以下步驟(1) 金標抗體結合墊的制備制備膠體金顆粒，并采用標記體系標記抗豚 鼠氣單胞菌單克隆抗體或多克隆抗體，將金標抗體在支持膜上固相化；(2) 免疫硝酸纖維素膜的制備在硝酸纖維素膜檢測線位置上包被抗豚鼠 氣單胞菌單克隆抗體或抗豚鼠氣單胞菌多克隆抗體，質控線位置上包被抗鼠IgG 抗體或葡萄球菌A蛋白；(3) 將吸水紙、免疫硝酸纖維素膜、金標抗體結合墊、樣品墊、底板組裝成膠體金快速檢測試紙條。
3、 根據權利2所述的豚鼠氣單胞菌膠體金快速檢測試紙條的制備方法，其特征在于在權力要求2步驟(1)中所述的標記體系為標記pH值為9.6;蛋白包 被濃度為lOpg'ml/1,膠體穩(wěn)定劑為0.02。/。PEG、 1%牛血清白蛋白，抗體保護 劑為蔗糖12%，離子濃度為0.05mo卜L"的磷酸鹽緩沖液和0.1mol丄"NaCl，表 面活性劑為0.3%tween-20。
4、 一種權利1所述的豚鼠氣單胞菌膠體金快速檢測試紙條在檢測豚鼠氣單胞菌 上的應用。
全文摘要
一種豚鼠氣單胞菌膠體金快速檢測試紙條，涉及一種豚鼠氣單胞菌檢測試紙條及其在水產動物疾病診斷上的應用。該試紙條的特征在于金標抗體結合墊上干燥結合了膠體金標記的抗豚鼠氣單胞菌單克隆抗體或抗豚鼠氣單胞菌多克隆抗體；免疫硝酸纖維素膜的檢測線上包被了抗豚鼠氣單胞菌單克隆抗體或抗豚鼠氣單胞菌多克隆抗體、質控線包被了抗鼠IgG抗體或葡萄球菌A蛋白。本發(fā)明的檢測試紙條操作簡單、特異性好、靈敏度高、方便快速，不需要特殊儀器設備，不需專業(yè)培訓，結果清晰易辨，易于推廣。適合用于疾病診斷以及檢疫的大批量現場檢測，適合流行病學調查，對豚鼠氣單胞菌的感染、污染診斷起輔助作用。
文檔編號G01N33/577GK101329344SQ20081007080
公開日2008年12月24日 申請日期2008年3月25日 優(yōu)先權日2008年3月25日
發(fā)明者斌 吳, 張新艷, 樊海平, 辛志明 申請人:福建省淡水水產研究所