專利名稱：：超聲/微波協(xié)同萃取-hplc檢測食品中的罌粟殼生物堿的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測食品中的罌粟殼生物堿的方法，屬于液相色譜分析
技術領域：
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背景技術：
：罌粟殼，為罌粟科植物罌粟(Pa。aversomnlferumL)的干燥果殼，含有罌粟堿、嗎啡、可待因、地巴因、那可汀等多種生物堿。罌粟殼具有斂肺、澀腸、止痛功效。吸食罌粟果殼及制品.可造成吸食者在心理、生理上產(chǎn)生很強的依賴性。罌粟殼的對機體作用似嗎啡，長期食用危害與吸食海洛因相似。因此國家將其列入麻醉藥品予以管制，禁止非法供應、運輸和使用。但社會上存在一些非法經(jīng)營者，為了招欖顧客，在調味料中添加罌粟殼,消費者食用后有異香之感，在不知不覺中上癮、中毒。這種異常感覺正是罌粟殼中的嗎啡等生物堿刺激神經(jīng)的一種反應，并非食物的味道。因此，加強相關食品的監(jiān)督檢測非常必要。文獻報道對食品中罌粟殼生物堿有薄層法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、免疫測定法(IMA)等。薄層法靈敏度lMg，高效液相色譜法(HPLC)炅敏度l.lng但兩種方法檢測干擾嚴重；免疫測定法靈敏度高，但特異性差。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種炅敏度高、精密度并且操作簡單的超聲-微波協(xié)同萃取—高效液相法，檢測目標為罌粟殼中含有的嗎啡、可待因和罌粟堿，以確定被檢測食品中是否含有罌粟殼生物堿。本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的這種超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測食品中的罌粟殼生物堿的方法，其特征在于包括如下步驟A、萃取取2mL待測樣品，加75%乙醇，酒石酸調pH至4，放進超聲一微波協(xié)同萃取儀70。C，萃取15分鐘；B、過濾萃取后的樣品過濾，殘渣用PH4.0的75冗酸性乙醇洗滌2-3次，冷卻后用脫脂棉過濾，再用75%酸性乙醇洗滌1次，水浴揮發(fā)乙醇成糖漿狀，自然冷卻后用脫脂棉過濾，殘渣用10%的酒石酸溶液洗滌3-4次；C、分離合并濾液于分液漏斗中，用30nl和20mL石油醚脫脂兩次，水層用氨水調。H至9.0-9.5,再用比例為3:l的三氯甲烷異丙醇混合液30ml、30ml和20ml萃取3次，每次靜置15m1n,合并萃取液，用無水硫酸鈉脫水后水浴揮發(fā)有機溶剤，加甲醇定容至5ml離心管中，進液相前用0.45"m的濾膜過濾，供色譜分析；D、液相色譜分析檢測目標為罌粟殼中含有的嗎啡、可待因和罌粟堿，液相色譜條件為柱溫30。C，流速lml/m1n;最大吸收波長:嗎啡210nm，可待因213nm,罌粟堿253nm;流動相水相:0.005mol/L磷酸二氫鈉和0.00005mol/L磷酸氫二鈉緩沖溶液;有機相乙腈；D-1、標準曲線制備分別以嗎啡、磷酸可待因和鹽酸罌粟堿為對照品在上述色譜條件下稀釋進樣，得出嗎啡，可待因，罌粟堿的特征峰,以峰面積為縱坐標，標準樣品濃度為橫坐標繪制標準曲線；D-2、樣品檢測取步驟C處理好的樣品分別與嗎啡、磷酸可待因和鹽酸罌粟堿對照品相同的條件進樣，得出檢測樣品的譜圖及標準曲線，從而確定樣品中是否含有罌粟殼生物堿及含量。所述超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測食品中的罌粟殼生物堿的方法，步驟D-1中嗎啡標準曲線制備包括對嗎啡的色譜圖峰形進行優(yōu)化，在標準品濃度為0.5-10vg/mL梯度為:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>將嗎啡標準品稀釋為0.5、1、2、4、6、8、10〃g/mL，在上述色譜條件下，平行測定每個標準樣品3次，繪制標準樣品濃度與峰面積的關系曲線，得回歸方程y:42.92x-3.9387，相關系數(shù)R2=0.999934。所述超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測食品中的罌粟殼生物堿的方法，其特征在于步驟D-1中磷酸可待因標準曲線制備包括對磷酸可待因的色譜圖峰形進行優(yōu)化，在濃度為0.2-10ug/rrl梯度為<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>將可待因標準品稀釋為0.2、0.4、0.6、0.8、2、4、6、8、10〃g/nt,在上述色譜條件下，平行測定每個標準樣品3次，繪制標準樣品濃度與峰面積的關系曲線，得回歸方程y=31.606x-1.6496,相關系數(shù)R2=0.999940。所述的超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測食品中的罌粟殼生物堿的方法，步驟D-1中鹽酸罌粟堿標準曲線制備包括對罌粟堿的色譜圖峰形進行優(yōu)化，在濃度為0.2-10ug/mL梯度為<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>將罌粟堿標準品稀釋為0.2、0.4、0.6、0.8、2、4、6、8、10〃g/mL,在上述色譜條件下，平行測定每個標準樣品3次，繪制標準樣品濃度與峰面積的關系曲線，得回歸方程y=19.903x-1.1284，相關系數(shù)R2=0.999954。所述超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測食品中的罌粟殼生物堿的方法,步驟D-2樣品檢測包括取步驟c處理好的樣品分別與嗎啡、磷酸可待因和鹽酸罌粟堿對照品相同的條件進樣，得出檢測樣品的譜圖及標準曲線，每次進樣量10^L。本發(fā)明與現(xiàn)有檢測技術相比，其優(yōu)點和積極效果表現(xiàn)在由于超聲-微波協(xié)同萃取充分利用了超聲波振動的空化作用(同吋具有萃取和機械攪拌作用)以及微波的高能作用，使樣品介質內各點受到的作用一致,降低目標物與樣品基體的結合力，加速目標物從固相進入溶剤的過程，使樣品中罌粟成分提取徹底。本發(fā)明用超聲-微波協(xié)同萃取一高效液相法檢測食品中的罌粟殼生物堿其炅敏度能達到0.1ng/L，實驗干擾小。并且操作簡單，耗吋短，具有回收率高、精密度高等優(yōu)點，在食品中罌粟殼生物堿的檢測方面有很好的應用前景。圖1是嗎啡、磷酸可待因、鹽酸罌粟堿標準曲線圖圖2是嗎啡標準品的色譜圖圖3是磷酸可待因標準品的色譜圖圖4是鹽酸罌粟堿標準品的色譜圖圖5是測試樣品中嗎啡的色譜圖圖6是測試樣品中可待因的色譜圖圖7是測試樣品中罌粟堿的色譜圖具體實施例方式1、樣品處理，模擬樣品為添加罌粟殼的牛肉湯1-1、萃取取2mL待測樣品，加75%乙醇，酒石酸調pH至4，放進超聲一微波協(xié)同萃取儀70。C，萃取15分鐘；l-2、過濾萃取后的樣品過濾，殘渣用州4.0的75%酸性乙醇洗滌2-3次，冷卻后用脫脂棉過濾，再用75%酸性乙醇洗滌1次，水浴揮發(fā)乙醇成糖漿狀，自然冷卻后用脫脂棉過濾，殘渣用10%的酒石酸溶液洗滌3-4次；1-3、分離合并濾液于分液漏斗中，用30mL和20mL石油醚脫脂兩次，水層用氨水調PH至9.0-9.5,再用比例為3:l的三氯甲烷異丙醇混合液30m]、30m，和20ml萃取3次，每次靜置15m1n，合并萃取液，用無水硫酸鈉脫水后水浴揮發(fā)有機溶剤，加甲醇定容至5ml離心管中，進液相前用0.45/^m的濾膜過濾，供色譜分析；2、液相色譜分析檢測目標為罌粟殼中含有的嗎啡、可待因和罌粟堿，液相色譜條件:柱溫30。C'流速lml/m1n;最大吸收波長:嗎啡210nm，可待因213nm,罌粟堿253nm;流動相水相0.005mol/L磷酸二氳鈉和0.00005mol/L磷酸氳二鈉緩沖溶液；有機相乙腈；2-1、標準曲線制備分別以嗎啡、磷酸可待因和鹽酸罌粟堿為對照品在上述色譜條件下稀釋進樣，得出嗎啡，可待因和罌粟堿的特征峰，以峰面積為縱坐標，標準樣品濃度為橫坐標繪制標準曲線；2-1-1、嗎啡標準曲線對嗎啡的色譜圖峰形進行優(yōu)化，在標準品濃度為0.5-10/^g/mL梯度為<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>將可待因標準品稀釋為0.2、0.4、0.6、0.8、2、4、6、8、10"g/nt,在上述色譜條件下，平行測定每個標準樣品3次，繪制標準樣品濃度與峰面積的關系曲線，得回歸方程y:31.606x-1.6496，相關系數(shù)R2=0.999940。標準品的色譜圖見圖3,其中可待因特征峰為6.17，峰面枳19.9。實驗中按信噪比略大于3來廿算，得最低檢測限為:0.1vg/mL。2-1-3、鹽酸罌粟堿標準曲線對罌粟堿的色譜圖峰形進行優(yōu)化，在濃度為0.2-10ug/mL梯度為<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>將罌粟堿標準品稀釋為0,2、0.4、0.6、0.8、2、4、6、8、10〃g/mL，在上述色譜條件下，平行測定每個標準樣品3次，繪制標準樣品濃度與峰面積的關系曲線，得回歸方程y:19.903x-1.1284,相關系數(shù)R2=0.999954。標準品的色譜圖見圖4，其中罌粟堿特征峰為5.205，峰面積1.98。實驗中按信噪比略大于3來廿算，得最低檢測限為0.1v2—2、樣品沖僉測:2-2-1、樣品中嗎啡的檢測;取1-3處理好的樣品分別與2-1-1對照品相同的條件進樣，進樣量10"L,得出檢測樣品的色譜圖如圖5，與標準圖譜及標準曲線比較，其中嗎啡特征峰5.495，從而確定樣品中含有罌粟殼生物堿及含量。2-2-2、樣品中可待因的檢測；取1-3處理好的樣品分別與2-1-2對照品相同的條件進樣，進樣量10"L，得出檢測樣品的色譜圖如圖6，與標準圖譜及標準曲線比較，其中可待因特征峰6.179，從而確定樣品中含有罌粟殼生物堿及含量。2-2-3、樣品中罌粟堿的檢測；取1-3處理好的樣品分別與2-1-3對照品相同的條件迸樣，進樣量10/zL,得出檢測樣品的色譜圖如圖7，與標準圖譜及標準曲線比較，其中罌粟堿特征峰5.225，從而確定樣品中含有罌粟殼生物堿及含量。所述超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測食品中的罌粟殼生物堿的方法，步驟D-1中嗎啡標準曲線制備包括3、方法精密度考察精密吸取嗎啡、磷酸可待因、鹽酸罌粟堿的標準品1C^L進行HPLC檢測，連續(xù)進樣6次,測得RSD值分別為:0.070%、0.037%、0.029%。表l超聲一微波協(xié)同萃取測定生物堿含量的精密度<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>4、方法的準確度考察加標回收率向已加入罌粟殼的肉湯加入嗎啡、磷酸可待因、鹽酸罌粟堿標準品各25;ug，經(jīng)提取后定容至5mL，進樣，計算器回收率。結果嗎啡的平均回收率為97.87%,磷酸可待因的平均回收率為96.80%,鹽酸罌粟堿的平均回收率為94.47%。重現(xiàn)性對6份同樣的樣品各取2mL用同樣的方法進行提取，用HPLC進行檢測。RSD值分別為:0.040%、0.209%、0.665%。表2超聲一微波協(xié)同萃取測定生物堿含量的準確度<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>5、最低檢測限考察嗎啡、可待因、罌粟堿的最低檢測限分別為0.1ng/L、0.08ng/L、0.1ng/L。本發(fā)明列舉的實施例旨在更進一步地闡明超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測食品中的罌粟殼生物堿的方法和應用方向，而不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。權利要求1、超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測食品中的罌粟殼生物堿的方法，其特征在于包括如下步驟A、萃取:取2mL待測樣品，加75％乙醇，酒石酸調pH至4，放進超聲—微波協(xié)同萃取儀70℃，萃取15分鐘；B、過濾:萃取后的樣品過濾，殘渣用pH4.0的75％酸性乙醇洗滌2-3次，冷卻后用脫脂棉過濾，再用75％酸性乙醇洗滌1次，水浴揮發(fā)乙醇成糖漿狀，自然冷卻后用脫脂棉過濾，殘渣用10％的酒石酸溶液洗滌3-4次；C、分離:合并濾液于分液漏斗中，用30mL和20mL石油醚脫脂兩次，水層用氨水調pH至9.0-9.5，再用比例為3∶1的三氯甲烷∶異丙醇混合液30ml、30ml和20ml萃取3次，每次靜置15min，合并萃取液，用無水硫酸鈉脫水后水浴揮發(fā)有機溶劑，加甲醇定容至5ml離心管中，進液相前用0.45μm的濾膜過濾，供色譜分析；D、液相色譜分析:檢測目標為罌粟殼中含有的嗎啡、可待因和罌粟堿，液相色譜條件:柱溫30℃，流速1ml/min；最大吸收波長:嗎啡210nm，可待因213nm，罌粟堿253nm；流動相:水相:0.005mol/L磷酸二氫鈉和0.00005mol/L磷酸氫二鈉緩沖溶液；有機相:乙腈；D-1、標準曲線制備:分別以嗎啡、磷酸可待因和鹽酸罌粟堿為對照品在上述色譜條件下稀釋進樣，得出嗎啡，可待因和罌粟堿的特征峰，以峰面積為縱坐標，標準樣品濃度為橫坐標繪制標準曲線；D-2、樣品檢測:取步驟C處理好的樣品分別與嗎啡、磷酸可待因和鹽酸罌粟堿對照品相同的條件進樣，得出檢測樣品的譜圖及標準曲線，從而確定樣品中是否含有罌粟殼生物堿及含量。2、根據(jù)權利要求1所述超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測食品中的罌粟殼生物堿的方法，其特征在于步驟D-1中嗎啡標準曲線制備包括對嗎啡的色譜圖峰形進行優(yōu)化，在標準品濃度為0.5-10;ug/mL梯度為<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>將嗎啡標準品稀釋為0.5、1、2、4、6、8、10〃g/mL,在上述色譜條件下，平行測定每個標準樣品3次，繪制標準樣品濃度與峰面枳的關系曲線，得回歸方程y二42.92x-3.9387，相關系數(shù)R2=0.999934。3、根據(jù)杈利要求1所述超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測食品中的罌粟殼生物堿的方法，其特征在于步驟D-1中磷酸可待因標準曲線制備包括對磷酸可待因的色譜圖峰形進行優(yōu)化，在濃度為0.2-10ug/mL梯度為<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>4.根據(jù)權利要求1所述的超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測食品中的罌粟殼生物堿的方法,其特征在于D-1中鹽酸罌粟堿標準曲線制備包括:對罌粟堿的色譜圖峰形進行優(yōu)化,在濃度為0.2-10ug/mL梯度為:<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>將罌粟堿標準品稀釋為0.2、0.4、0.6、0.8、2、4、6、8、10//g/mL，在上述色譜條件下，平行測定每個標準樣品3次，繪制標準樣品濃度與峰面積的關系曲線，得回歸方程y:19.903x-1.1284，相關系數(shù)R2=0.999954。5、根據(jù)權利要求l、2、3和4所述超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測食品中的罌粟殼生物堿的方法，其特征在于步驟D-2樣品檢測包括取步驟C處理好的樣品分別與嗎啡、磷酸可待因和鹽酸罌粟堿對照品相同的條件進樣，得出檢測樣品的譜圖及標準曲線，每次進樣量10;uL。全文摘要本發(fā)明提供一種超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測食品中的罌粟殼生物堿的方法，待測樣品經(jīng)過超聲—微波協(xié)同萃??；過濾；分離；液相色譜分析；分別以嗎啡、磷酸可待因和鹽酸罌粟堿為對照品，得出嗎啡，可待因，罌粟堿的特征峰，以峰面積為縱坐標，標準樣品濃度為橫坐標繪制標準曲線；取處理好的樣品分別與嗎啡、磷酸可待因、鹽酸罌粟堿對照品相同的條件進樣，得出檢測樣品的譜圖及標準曲線，從而確定樣品中是否含有罌粟殼生物堿及含量。由于超聲-微波協(xié)同萃取充分利用了超聲波振動的空化作用，降低目標物與樣品基體的結合力，使樣品中罌粟成分提取徹底。本發(fā)明的靈敏度能達到0.1ng/L，實驗干擾小并且操作簡單，耗時短，具有回收率高、精密度高等優(yōu)點，在食品中罌粟殼生物堿的檢測方面有很好的應用前景。文檔編號G01N30/02GK101393176SQ200810079608公開日2009年3月25日申請日期2008年10月23日優(yōu)先權日2008年10月23日發(fā)明者馮麗娟,劉崢顥,吳廣臣,夏立婭,龐艷蘋,李小亭,王庭欣,趙志磊申請人:河北大學