專利名稱：一種用于生物靶細胞藥物敏感性試驗細胞的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種測定生物細胞反應(yīng)性方法，具體涉及一種用于生物耙細胞藥物 敏感性i微細胞的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
由于先天和后天因素，不同患者的細胞對藥物的敏感性存在個體差異性，導(dǎo)致 不同藥物用于不同患者后，其患者反應(yīng)性不同，包括對耙細胞的增值抑制作用，細 胞毒作用，細胞因子分泌作用等，檢測患者耙細IM不同藥物的敏感性，可以為患 者篩選出有效的治療藥物，可以增加治療療效和減少副作用，防止無效治療和對患 者身體和經(jīng)濟的損失，實現(xiàn)個體化治療。可是目前市場上尚沒有專門用于生物耙細 胞藥物敏感性i，細胞的培養(yǎng)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是針對不同患者對藥物敏感性不同的特點，樹共一種用于生物耙細胞 藥物敏感性i^^細胞的培養(yǎng)方法，解決盲目治療療效差、副作用大，對患者身體和 經(jīng)濟易造成不必要的損失的問題。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)
一種用于生物革卿胞藥物敏感性i微細胞的培養(yǎng)方法，由以下步^^M: (1) 外周血淋巴細胞制備，采取患者外周靜脈血3 5毫升，抗凝，用磷艦緩沖液等體積禾凝畢，將禾辦畢后的血液加在含有淋巴細胞分離液離心管內(nèi)的淋巴細胞分離液表面，
2000轉(zhuǎn)/分，離心20射中，吸出淋巴細胞于另一離心管，加入5 10mL磷酸鹽緩沖 液混勻，1500轉(zhuǎn)/分，離心15^H中，棄上清液，.再加入5 10mL磷,緩沖液混勻， 計辦，1000轉(zhuǎn)/分，離心10倂中，棄上清液，細鵬細胞培養(yǎng)液禾凝畢成1X 10fi/ 毫升細胞懸液，備用，組織細胞制備將新鮮手術(shù)組織用常規(guī)組織細胞分離方法， 分離為單細胞懸液，用細胞培養(yǎng)液稀釋成1X IOV毫升細胞懸液，備用；(2)含各 種待測藥物i歸基制備將各種待測藥物用細胞培#^配制成2倍臨床常規(guī)!頓劑 量峰值濃度的藥液，備用；(3)細胞培養(yǎng)將含各種待測藥物培養(yǎng)液加入96孑L土咅 養(yǎng)板，每孔100微升，每個藥加2孔，設(shè)空白對照孔，不含ftf可藥物的細胞培養(yǎng)液， 將制備好的患者細胞懸液加入±3#咅養(yǎng)孔中，每孔100微升，震蕩混勻，置37'C， 5°/￡02環(huán)境中保濕±咅養(yǎng)3-7天；(4)細胞t斜己將培養(yǎng)后的細胞收集到^;細胞儀 樣品管中，每一種藥物分別收集到一管中，加入2mL磷麟緩沖液混勻，1000轉(zhuǎn)/ 分，離心10倂中，棄上清液，細胞沉淀中加入100uL磷酸鹽緩沖液，混勻，再加 入熒光^"i己的各種的單克隆抗體室溫下，18 22°C，避光放置20 30辦中，加入 2mL磷Kk緩沖液混勻，1000轉(zhuǎn)/分，離心10^H中，棄上清液，加入0.3 0.5毫 升磷麟緩沖液，混勻，待測。流式細胞儀測定按照箭式細胞儀常規(guī)操作，檢測 特定耙細胞的百分率，計算各種藥物對耙細胞的增殖或抑制或細胞毒作用，細胞因 子，細胞培養(yǎng)上清液檢測，流式細胞儀測定分泌細胞因子含量，選擇出對患者最 有效的藥物。其中，可檢測的生物耙細胞包括總T細胞，總B細胞，輔助性T細 胞，抑制性T細胞，NK細胞，Y ST細胞，T調(diào)節(jié)性細胞，ot PT細胞，腫瘤細胞，腫瘤干細胞，IL-2， IL-4， IL~6, IL-10， INF- y ， TNF- a的細胞。
本發(fā)明與現(xiàn)有技斜目比具有以下有益效果不同患者細胞功能異?？赡苡刹煌?的細胞，細M群，亞亞群異常引起，M本發(fā)明可以精確為細胞功能異常的患者 選擇出最有效的治療藥物，顯著提高治療療效和M^無效治療，M^、患者身體的傷 害和經(jīng)濟的損失，為國家和患者節(jié)約大量醫(yī)療成本。另外可以用于刑古^用藥方 案的效果，體外篩選新的藥物，研究藥物的作用機理，研究和制定新的治療方案， 研克新的藥物等。同時，由于藥物敏感性檢測在治療傳染病，自身免疫性鵬，腫 瘤等有較大的應(yīng)用范圍，所以臨床應(yīng)用可以產(chǎn)頓著的經(jīng)濟^^。
具體實施例方式
一種用于生物革巴細胞藥物敏感性檢測的方法，由以下步^^且成(l)外周血淋 巴細胞制備，采取患者外周靜脈血4毫升，抗凝，用磷麟緩沖液靴積稀釋，將
稀釋后的血勵口在含有淋巴細胞分離液離心管內(nèi)的淋巴細胞分離液表面，2000轉(zhuǎn)/ 分，離心20么H中，吸出淋巴細胞于另一離心管，加入8niL磷麟緩沖液混勻，1500 轉(zhuǎn)/分，離心15併中，棄上清液，再加入8mL磷鵬緩沖液混勻，計辦，1000轉(zhuǎn) /分，離心10倂中，棄上清液，細胞用細胞i咅養(yǎng)液禾凝華成lX10V新細脫懸液， 備用。組織細胞制備將茅賴羊手術(shù)組織用常規(guī)組織細胞分離方法，分離為單細胞懸 液，用細胞培養(yǎng)液禾糖成1X IOY毫升細胞懸液，備用；(2)含各種待測藥物培養(yǎng)
基制備將各種待測藥物用細胞培養(yǎng)液配制成2傲臨床常規(guī)^頓齊U量峰值濃度的藥
液，備用；(3)細胞培泰將含各種待測藥物培養(yǎng)液加入96孑L培鎌，每孔IOO 微升，^h藥加2 L設(shè)空白對照孔，不含招可藥物的細胞培養(yǎng)液，將制備好的患者細胞懸液加入上述培銜L中，每孔100微升，震蕩混勻，置37°C， 02環(huán)境中
保濕培養(yǎng)5天；(4)細胞新己將培養(yǎng)后的細胞收集到、 細胞儀樣品管中，每
一種藥物分別收集至'J一管中，加入2mL磷酸鹽緩沖液混勻，1000轉(zhuǎn)/分，離心10分 沐棄上清液，細胞沉淀中加入100 u L磷酸鹽緩沖液，混勻，再加入熒光^i己的各 種的單克隆抗體室溫下，20°C，避^^爐25^H中，加入2mL磷麟緩沖液混勻， 1000轉(zhuǎn)/分，離心10^H中，棄上清液，加入0.4毫升磷麟緩沖液，混勻，待測。 流式細胞儀測定按照》試細胞儀常規(guī)操作，檢測特定耙細胞的百分率，計算各種 藥物對耙細胞的增殖或抑制或細胞毒作用，細胞因子采用細胞培養(yǎng)上清液檢測，流 式細胞儀測定分泌細胞因:？ ，選擇出對患者最有效的藥物。其中，可檢測的生 物耙細胞包括總T細胞，總B細胞，輔助性T細胞，抑制性T細胞，NK細胞， Y ST細胞，T調(diào)節(jié)性細胞，a 細胞，腫瘤細胞，腫瘤干細胞，分泌 IL-2, IL-4， IL-6， IL-IO， INF- Y ， TNF- a的細胞。
權(quán)利要求
1、一種用于生物靶細胞藥物敏感性試驗細胞的培養(yǎng)方法，其特征是由以下步驟組成(1)外周血淋巴細胞制備，采取患者外周靜脈血3～5毫升，抗凝，用磷酸鹽緩沖液等體積稀釋，將稀釋后的血液加在含有淋巴細胞分離液離心管內(nèi)的淋巴細胞分離液表面，2000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，吸出淋巴細胞于另一離心管，加入5～10mL磷酸鹽緩沖液混勻，1500轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘，棄上清液，再加入5～10mL磷酸鹽緩沖液混勻，計數(shù)后，1000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，棄上清液，細胞用細胞培養(yǎng)液稀釋成1×106/毫升細胞懸液，備用；組織細胞制備將新鮮手術(shù)組織用常規(guī)組織細胞分離方法，分離為單細胞懸液，用細胞培養(yǎng)液稀釋成1×106/毫升細胞懸液，備用；(2)含各種待測藥物培養(yǎng)基制備將各種待測藥物用細胞培養(yǎng)液配制成2倍臨床常規(guī)使用劑量峰值濃度的藥液，備用；(3)細胞培養(yǎng)將含各種待測藥物培養(yǎng)液加入96孔培養(yǎng)板，每孔100微升，每個藥加2孔，設(shè)空白對照孔，不含任何藥物的細胞培養(yǎng)液，將制備好的患者細胞懸液加入上述培養(yǎng)孔中，每孔100微升，震蕩混勻，置37℃，5％CO2環(huán)境中保濕培養(yǎng)3-7天；(4)細胞標記將培養(yǎng)后的細胞收集到流式細胞儀樣品管中，每一種藥物分別收集到一管中，加入2mL磷酸鹽緩沖液混勻，1000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，棄上清液，細胞沉淀中加入100μL磷酸鹽緩沖液，混勻，再加入熒光標記的各種的單克隆抗體室溫下，18～22℃，避光放置20～30分鐘，加入2mL磷酸鹽緩沖液混勻，1000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，棄上清液，加入0.3～0.5毫升磷酸鹽緩沖液，混勻，待測；流式細胞儀測定按照流式細胞儀常規(guī)操作，檢測特定靶細胞的百分率，計算各種藥物對靶細胞的增殖或抑制或細胞毒作用，細胞因子采用細胞培養(yǎng)上清液檢測，流式細胞儀測定分泌細胞因子含量，選擇出對患者最有效的藥物；其中，可檢測的生物靶細胞包括總T細胞，總B細胞，輔助性T細胞，抑制性T細胞，NK細胞，γδT細胞，T調(diào)節(jié)性細胞，αβT細胞，腫瘤細胞，腫瘤干細胞，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，INF-γ，TNF-α的細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于生物靶細胞藥物敏感性試驗細胞的培養(yǎng)方法，通過外周血淋巴細胞制備，組織細胞制備，細胞培養(yǎng)，細胞標記等步驟，將培養(yǎng)后的細胞收集到流式細胞儀樣品管中，通過流式細胞儀測定特定靶細胞的百分率，計算出各種藥物對靶細胞的作用，選擇出對患者最有效的藥物?？蓹z測的生物靶細胞包括總T細胞，總B細胞，輔助性T細胞，抑制性T細胞，NK細胞，γδT細胞，T調(diào)節(jié)性細胞，αβT細胞，腫瘤細胞，腫瘤干細胞，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，INF-γ，TNF-α的細胞。通過本發(fā)明可以精確為細胞功能異常者選擇出最有效的治療藥物，顯著提高治療療效和減少無效治療，減少患者身體的傷害和經(jīng)濟的損失，為國家和患者節(jié)約大量醫(yī)療成本。
文檔編號G01N21/64GK101407789SQ200810079830
公開日2009年4月15日 申請日期2008年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月14日
發(fā)明者(請求不公開姓名) 申請人:張 雯