專利名稱：：評價或篩選毛生長調(diào)節(jié)劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用豬的毛囊評價或篩選毛生長調(diào)節(jié)劑的方法。技術(shù)背景一般地，關(guān)于毛，人們往往根據(jù)部位而希望促進毛生長或抑制毛生長。例如，不少人為因精神壓力和遺傳等而造成的毛發(fā)稀疏和毛發(fā)脫落感到苦惱。另外，還有人對所謂無用毛處理感到麻煩。關(guān)于毛，已知存在依賴于雄性激素的毛和不依賴于雄性激素的毛。例如，認為從前額部至頭頂部的脫發(fā)或該部分向后退的男性型脫發(fā)癥、以及胡須和腿毛、腋毛等的毛與雄性激素密切相關(guān)，而顳颥部毛、頭后部毛、眉毛、睫毛則受雄性激素影響小(非專利文獻1、非專利文獻2)。因此，從各個方面開發(fā)了用于調(diào)節(jié)毛的伸長的毛生長促進劑和毛生長抑制劑(專利文獻1和2)?；谀軌蜓杆偾液啽愕剡M行評價或篩選的觀點，近年來，在毛生長促進劑和毛生長抑制劑的探索中，采用人和小鼠"大鼠的毛囊的細胞培養(yǎng)和毛囊的器官培養(yǎng)法(非專利文獻35、專利文獻3和4)。采用人的毛囊的器官培養(yǎng)進行的篩選，雖然數(shù)據(jù)的可靠性高，可是人的毛囊本身不易得到，所以不適于進行大量的篩選。另外，采用小鼠，大鼠的毛囊的器官培養(yǎng)進行的篩選，雖然能夠經(jīng)常得到，可是由于使用實驗動物，基于愛護動物的觀點，也不適于進行大量篩選。專利文獻1日本特開2005—206536號公報專利文獻2日本特開2006—8657號公報專利文獻3日本特開平11—49647號公報專利文獻4日本特開2002—62289號公報非專利文獻1EblingFJ等人，臨床內(nèi)分泌代謝(ClinEndocrinolMetab.)，15巻，319—339(1986)非專利文獻2StennKS等人，生理學(xué)綜述(PhysiolRev.)，81巻，449—494(1993)非專利文獻3T.Jindo.等人，皮膚病學(xué)雜志(TheJournalofDermatology),Vol.20，756—762,1993.非專利文獻4宇塚誠和A奏T澤千加，日皮志，104(8),979—987,1994.非專利文獻5M.P.Philpott等人，細胞科學(xué)雜志(JournalofCellScience),97，463—471，1990.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及提供利用容易得到的動物的毛囊評價或篩選毛生長調(diào)節(jié)劑的方法。本發(fā)明的發(fā)明人研究了新的評價或篩選毛生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的體系后發(fā)現(xiàn)，當將豬的各部位的毛囊進行器官培養(yǎng)時，存在其生長受5ct-二氫睪丸酮(以下，簡寫為DHT)影響的毛囊和不受DHT影響的毛囊，通過使用這些毛囊，可以評價或篩選雄性激素依賴性或非依賴性毛的生長調(diào)節(jié)劑。艮口，本發(fā)明提供一種評價或篩選毛生長調(diào)節(jié)劑的方法，其特征在于在被檢物質(zhì)的存在下，將豬的毛囊進行器官培養(yǎng)，對促進或抑制該毛囊的生長的物質(zhì)進行評價或者選擇。本發(fā)明還提供一種評價或篩選雄性激素依賴性毛生長調(diào)節(jié)劑的方法，其特征在于在被檢物質(zhì)的存在下，將豬的腹部或背部的毛囊進行器官培養(yǎng)，對促進或抑制該毛囊的生長的物質(zhì)進行評價或者選擇。本發(fā)明還提供一種評價或篩選男性型脫毛癥用毛生長促進劑的方法，其特征在于在被檢物質(zhì)的存在下，將豬的腹部的毛囊進行器官培養(yǎng)，對促進該毛囊的生長的物質(zhì)進行評價或者選擇。本發(fā)明還提供一種評價或篩選雄性激素依賴性毛生長抑制劑的方法，其特征在于在被檢物質(zhì)的存在下，將豬的背部的毛囊進行器官培養(yǎng)，對抑制該毛囊的生長的物質(zhì)進行評價或者選擇。本發(fā)明還提供一種評價或篩選雄性激素非依賴性毛生長調(diào)節(jié)劑的方法，其特征在于在被檢物質(zhì)的存在下，將豬的側(cè)腹、腹股溝部、肩或臀部的毛囊進行器官培養(yǎng)，對促進或抑制該毛囊的生長的物質(zhì)進行評價或者選擇。根據(jù)本發(fā)明，因為能夠使用容易大量得到的肉用豬的毛囊，所以可以簡便且有效地評價或選擇具有毛生長促進效果或毛生長抑制效果的物質(zhì)。具體實施方式本發(fā)明的評價或篩選毛生長調(diào)節(jié)劑的方法是將豬的特定部位的毛囊進行器官培養(yǎng)并對促進或抑制其生長的物質(zhì)進行評價或者選擇的方法。如下述實施例所示，在作為雄性激素之一的DHT的存在下，將豬的各部位的毛囊進行器官培養(yǎng)，當用不添加DHT的相同部位的毛的伸長量比較該毛囊的生長時，發(fā)現(xiàn)腹部的毛的伸長量大幅度地減少，背部的毛的伸長量大幅度地增加，側(cè)腹、腹股溝部、肩或臀部的各毛的伸長量大致相等(實施例1)。即，在豬的毛囊的生長中發(fā)現(xiàn)根據(jù)豬的毛囊的來源部位，存在其生長受DHT影響的毛囊和不受DHT影響的毛囊。另一方面，關(guān)于人的毛發(fā)，很早以前就己知道從前額部至頭頂部的脫發(fā)或該部分向后退的男性型脫毛癥，其癥狀隨雄性激素而發(fā)展，已知抗雄性激素劑對此是有效的。另外，據(jù)報告，胡須和腿毛的生長受雄性激素促進(EblingFJ等人，ClinEndocrinolMetab.，15巻，319—339(1986))，并認為顳颥部毛、頭后部毛、眉毛、睫毛受雄性激素影響小(StennKS等人，PhysiolRev.，81巻，449—494(2001))。因此認為，豬的腹部的毛囊的生長，是雄性激素依賴性的且類似于被雄性激素抑制的毛的生長，例如人的從前額部至頭頂部的毛發(fā)等的生長；豬的背部的毛囊的生長，是雄性激素依賴性的且類似于被雄性激素促進的毛的生長，例如人的胡須、腿毛、胸毛、陰毛等的生長;豬的側(cè)腹的毛囊、腹股溝部的毛囊、肩的毛囊和臀部的毛囊的生長，類似于不受雄性激素影響的毛，例如人的顳颥部的毛、頭后部的毛、眉毛、睫毛等的生長。因而，認為可以以豬的特定部位的毛囊的生長為指標來評價或篩選雄性激素依賴性毛生長調(diào)節(jié)劑、男性型脫毛癥用毛生長促進劑、雄性激素依賴性毛生長抑制劑以及雄性激素非依賴性毛生長調(diào)節(jié)劑等的毛生長調(diào)節(jié)劑。具體地，可以通過例如以下的工序(1)(3)來進行本發(fā)明的評價或篩選。(1)使豬的特定部位的毛囊接觸被檢物質(zhì)的工序；(2)將該毛囊進行器官培養(yǎng)并測定其生長并且將該生長與未接觸被檢物質(zhì)的毛囊的生長進行比較的工序；(3)基于(2)的結(jié)果將促進或抑制毛囊的生長的被檢物質(zhì)作為毛生長調(diào)節(jié)劑進行評價或選擇的工序。所謂豬的毛囊，是指取自豬的皮膚的圍繞毛根全體的組織，具體地指包含毛干、毛乳頭、毛母細胞、毛根等的與毛的伸長相關(guān)的器官的全體組織。本發(fā)明中，在這種毛囊中，使用處于生長期的毛囊(生長期毛囊)。這里，對于成為毛囊采取對象的豬，只要是有毛的豬，可以使用任何品種。然而，一般地，可以使用為達肉用目的而雜交得到的豬的品種。作為肉用而被改良的豬，例如，可以列舉將英國的約克夏州地區(qū)使用本地品種與中國品種、那不勒斯品種(Neapolitanbreed)和萊斯特品種(Lesterbreed)等交配得到的有白色毛的約克夏品種(有大中小的3種類型)；將英國的伯克郡(Berkshire)和威爾夏郡(Wilshire)地區(qū)的本地品種與暹羅品種(Siamesebreed)、中國品種和那不勒斯品種等雜交得到的有黑色毛的巴克夏品種；將丹麥的本地品種與大約克夏品種交配得到的有白色毛的蘭德瑞斯(landrace)品種；原產(chǎn)美國的馬薩諸塞州和肯塔基州的有黑色毛的漢普夏品種；在美國由原產(chǎn)歐洲的紅色系的豬與在新澤西州經(jīng)改良后的紅色系的豬交配得到的杜羅克(D腦c)品種等。作為在日本被血統(tǒng)維持的注冊品種，有中約克夏品種co、巴克夏品種(B)、蘭德瑞斯品種(L)、大約克夏品種(W)、漢普夏品種(H)、杜羅克品種(D)這6個品種。作為一般的肉用豬，除了純種的巴克夏品種的黑豬之外，還有很多為將這些品種彼此組合而得到的雜種。例如，可舉出將蘭德瑞斯品種(L)的血統(tǒng)的豬"栃木L"與大約克夏品種(W)交配得到的"LW雌豬"再與杜羅克品種(D)交配而產(chǎn)下的"栃木LaLa豬";將北京黑豬品種與巴克夏品種與杜羅克品種雜交得到的"TokyoX"等。其中，優(yōu)選使用易判斷生長期毛的約克夏品種、蘭德瑞斯品種等的有白色毛的品種及其雜種。使用肉用豬時，可以從取得了肉后的豬的皮膚上取得毛囊，不會僅為取得毛囊而傷害動物，因此是優(yōu)選的。作為使用部位，可以列舉腹部、背部、側(cè)腹、腹股溝部、肩或臀部等，可以根據(jù)評價目的進行選擇。即對于男性型脫毛癥用毛生長促進劑的評價或篩選，優(yōu)選使用腹部的毛囊；對于胡須和臂毛，腿毛等的雄性激素依賴性毛的生長調(diào)節(jié)(毛生長促進或毛生長抑制)劑的評價或篩選，優(yōu)選使用背部的毛囊;對于雄性激素非依賴性毛的生長調(diào)節(jié)(毛生長促進或毛生長抑制)劑的評價或篩選，優(yōu)選使用側(cè)腹的毛囊、腹股溝部的毛囊、肩的毛囊或臀部的毛囊?？梢圆捎孟率龇椒ㄟM行毛囊的采取，即切取對應(yīng)于評價目的的部位的豬皮，在無菌的條件下，切除脂肪組織后，分離毛囊。可以采用例如預(yù)先添加被檢物質(zhì)于培養(yǎng)液中使其達到規(guī)定的濃度之后在培養(yǎng)液內(nèi)載置毛囊的方法，或者，添加被檢物質(zhì)于載置有毛囊的培養(yǎng)液中使其達到規(guī)定的濃度的方法，來進行毛囊與被檢物質(zhì)的接觸?？梢圆捎眯∈蟮暮毜拿业钠鞴倥囵B(yǎng)(非專利文獻4)等的公知的毛囊的器官培養(yǎng)方法，來進行毛囊的器官培養(yǎng)。例如可以通過在滲透有培養(yǎng)液的滅菌網(wǎng)等的盤上，載置所采取的毛囊，在37。C的溫度下，在含有C02的空氣氣相下，進行通常為256日、優(yōu)選為421曰的培養(yǎng)。作為培養(yǎng)液，例如，可以列舉RPMI1640培養(yǎng)基、William'sMediumE培養(yǎng)基、DMEM/HamF12(1:l)培養(yǎng)基等?？梢赃m當添加瓊脂和明膠。另外，根據(jù)需要，還可添加抗生素、氨基酸、血清、生長因子、活體提取物等。毛囊的生長的測定，例如，可以列舉利用圖像解析或在顯微鏡下用測微計測定毛的伸長量和粗細的增減的方法，測定器官培養(yǎng)后的毛囊中的細胞增殖活性或增殖細胞數(shù)量的方法，測定與毛囊的生長的強度成反比地多見于毛囊中的凋亡細胞的方法等。在毛囊的生長的測定中，采用圖像解析或在顯微鏡下用測微計測定毛的伸長量和粗細的增減的方法時，例如，可以列舉測定由毛球部基底部至毛干頂端的長度，然后測量從培養(yǎng)開始時起的毛的伸長量；或者通過比較毛尖和毛根附近的伸長的毛干的粗細而測定粗細的增減的方法等。上述情況下，促進或抑制毛囊的生長的物質(zhì)的評價可以如下所述，即使毛囊接觸被檢物質(zhì)，進行器官培養(yǎng)，將測定得到的毛的伸長量或粗細與未接觸被檢物質(zhì)的毛的伸長量或粗細(對照標準)進行比較，求得當規(guī)定對照標準為100時的伸長率(％)或粗細的變化率(％)，基于該結(jié)果進行評價。而且，值越高，評價被檢物質(zhì)越促進毛的生長；或者值越低，評價被檢物質(zhì)越抑制毛的生長。另外，測定毛囊中的細胞的增殖活性、呼吸活性或增殖細胞數(shù)量時，例如，可以列舉在器官培養(yǎng)的培養(yǎng)基內(nèi)添加溴脫氧尿苷并根據(jù)導(dǎo)入DNA中的溴脫氧尿苷的量測定DNA合成能從而測定細胞增殖活性的方法；或者，使用AlamarBlue檢測和MTT檢觀U(用線粒體的NADH還原作為基質(zhì)添加的四唑鹽并測定其生成物的吸光度和趨勢的方法)等測定細胞的呼吸活性的方法；或者，通過作為增殖細胞標記的Ki67和PCNA(增殖細胞核抗原，ProliferationCellNuclearAntigen)的抗體進行的染色來測定增殖細胞數(shù)量的方法等。上述情況中，促進或抑制毛囊的生長的物質(zhì)的評價可以是，使毛囊接觸被檢物質(zhì)，進行器官培養(yǎng)，將如上所述測定的增殖活性或增殖細胞數(shù)量與未接觸被檢物質(zhì)的毛囊的增殖活性或增殖細胞數(shù)量(對照標準)進行比較，求得當規(guī)定對照標準為100時的增殖活性比率(％)或增殖細胞數(shù)量比率(％)，基于該結(jié)果進行評價。而且，計算所得的值越高，評價被檢物質(zhì)越促進毛的生長；或者，計算所得的值越低，評價被檢物質(zhì)越抑制毛的生長。另外，測定毛囊中的凋亡細胞時，例如，可以列舉測定細胞凋亡進行時的片段DNA量的方法；或者，根據(jù)TUNEL法等測定凋亡細胞數(shù)量的方法等。上述情況中，促進或抑制毛囊的生長的物質(zhì)的評價可以是使毛囊接觸被檢物質(zhì)，進行器官培養(yǎng)，將如上所述測定的片段DNA量或凋亡細胞數(shù)量與未接觸被檢物質(zhì)的毛囊的片段DNA量或凋亡細胞數(shù)量(對照標準)進行比較，求得當規(guī)定對照標準為IOO時的片段DNA量比率(％)或凋亡細胞數(shù)量比率(％)，基于該結(jié)果進行評價。而且，所得的值越低，評價被檢物質(zhì)越促進毛的生長；或者，所得的值越高，評價被檢物質(zhì)越抑制毛的生長。實施例實施例1(1)毛囊的分離作為豬皮，使用從在日本作為肉用豬飼養(yǎng)的有白色毛的雜種的豬得到的皮膚，按適當尺寸分切，切除多余的脂肪，在無菌的環(huán)境下，在雙氯苯雙胍乙烷液(將5%雙氯苯雙胍乙垸液(住友制藥公司制造)用水稀釋成520倍)中，浸泡5分10分，進行消毒，接著，用D—PBS進行數(shù)次清洗。接著，在實體顯微鏡下，用小鑷子和手術(shù)刀(FEATHERNo10)，從已處理了的豬皮上分離毛囊，將其集中于培養(yǎng)基中。作為培養(yǎng)基，使用RPMI1640培養(yǎng)基(Gibcocat.No.11835—030)、William'sMediumE培養(yǎng)基(Gibcocat.No.12551—032)和DMEM/HamF12(1:l)培養(yǎng)基(Gibcocat.No.11039—021)。(2)DHT對豬的毛囊器官培養(yǎng)的影響按照(l)的方法，從豬的背部、側(cè)腹、腹部、腹股溝部、臀部、肩得到豬的毛囊。將分離得到的毛囊放入24孔培養(yǎng)板中，每孔放入1根。在每孔內(nèi)加入培養(yǎng)基William'sMediumE培養(yǎng)基(Gibcocat.No.12551—032)400jiL。使用按1。/。的比例添加有青霉素/鏈霉素(Gibcocat.No.15140—122)溶液的培養(yǎng)基。使用上述William'sMediumE培養(yǎng)基，調(diào)制成使DHT(SigmacatNo.A—8380)在培養(yǎng)基中的最終濃度為10ng/mL。在37'C、5%002的環(huán)境下，在恒溫箱中，進行6日培養(yǎng)。每隔1日、或2日置換1次培養(yǎng)基。將培養(yǎng)6日后的毛的伸長量與對照標準比較。作為對照標準，使用不添加DHT的William'sMediumE培養(yǎng)基，規(guī)定器官培養(yǎng)后的毛的伸長量為100%。再者，毛的伸長量的測定為規(guī)定培養(yǎng)開始日為第0日，在第0日和第6日，利用CCD攝像機(pixeramodel.No.PVC100C),拍攝實際狀態(tài)的顯微鏡圖像，根據(jù)該圖像，測定由毛球部基底部至毛干頂端的長度變化。[表1]<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>*器官培養(yǎng)第6日，規(guī)定對照標準為100%。通過表1顯示，即使是豬的毛囊，其生長也受DHT的影響；還顯示根據(jù)部位，DHT的影響程度不同。腹部的毛囊，其生長受DHT抑制。因此，該毛囊的伸長促進劑，可以成為對男性型脫毛癥有效的毛生長促進劑。另外，背部的毛囊，其生長被DHT促進。因此，該毛囊的伸長抑制劑，可以成為雄性激素依賴性且被雄性激素促進生長的毛的毛生長抑制劑。其它部位的毛囊，受DHT的影響小。因此，該毛囊的伸長促進劑或伸長抑制劑，可以成為不經(jīng)由雄性激素作用而起作用的毛的毛生長促進劑或毛生長抑制劑。實施例2毛生長調(diào)節(jié)劑的評價(1)t-黃烷酮和TGF-卩2按照與實施例1同樣的操作，得到豬的臀部的毛囊。作為培養(yǎng)基，使用RPMI1640(Gibcocat.No.11835—030)培養(yǎng)基。使用在RPMI1640培養(yǎng)基內(nèi)按1。/。的比例添加有青霉素/鏈霉素(Gibcocat.No.15140—122)溶液的培養(yǎng)基。使用上述RPMI1640培養(yǎng)基，調(diào)制作為不屬于醫(yī)藥品的毛生長促進劑的有效成分即在大鼠的胡須的毛囊的器官培養(yǎng)中被確認具有毛生長促進作用的t-黃烷酮(反式-3,4'-二甲基-3-羥基黃垸酮(堀田等人，香味雜志(FragranceJournal),第31巻第2期，33—40(2003)))，使培養(yǎng)基中的最終濃度為liaM(關(guān)于合成方法，參考日本特開2000—198779)。而且，關(guān)于在人的毛囊的器官培養(yǎng)中被確認具有毛生長抑制作用的TGF-卩2(R&DSystem,Inc.,型號102—B2—001/CF)(Philpott等人，JCellSci，97巻，463—47(19卯)；Soma等人，JInvestDermatol，118巻，993—997(2002))，也調(diào)制成10ng/mL。在37。C、5。/。C02的恒溫箱中，進行8日培養(yǎng)。每隔1日、或2日置換1次培養(yǎng)基，測定培養(yǎng)8日后的毛的伸長量與對照標準比較。采用與實施例1同樣的方法評價毛囊的生長量。作為對照標準，使用不添加被檢物質(zhì)的RPMI1640培養(yǎng)基，規(guī)定器官培養(yǎng)后的毛的伸長量為100%。[表2]被檢物質(zhì)規(guī)定對照標準為100時的毛伸長率(％)t-黃烷酮(lpM)145TGF-卩2(10ng/mL)59器官培養(yǎng)第8日，RPMI1640培養(yǎng)基與對照標準相比，看到了t-黃垸酮具有毛伸長率達145%的毛伸長促進效果，而在TGF-(32方面看到具有毛伸長率為59%的毛伸長抑制效果。(2)環(huán)孢子素A按照與實施例1同樣的操作，得到豬的臀部的毛囊。作為培養(yǎng)基，使用William'sE培養(yǎng)基(Sigmacat.No.W1878)培養(yǎng)基。使用在William'sE培養(yǎng)基內(nèi)按1。/。的比例添加有青霉素/鏈霉素(Gibcocat.No.15140—122)溶液的培養(yǎng)基。使用上述William'sE培養(yǎng)基，調(diào)制在人毛囊的器官培養(yǎng)中被確認具有毛生長促進作用的環(huán)孢子素A(CsA)(Sigmacat.No.C-1832)(Taylor等人，JInvestDermatol,100巻，237—239(1993))，使培養(yǎng)基中的最終濃度為100ng/mL、1000ng/mL。在37。C、5%C02的恒溫箱中，進行7日培養(yǎng)。每隔1日、或2日置換1次培養(yǎng)基，測定培養(yǎng)7日后的毛的伸長量，并與對照標準比較。采用與實施例1同樣的方法評價毛囊的生長量。作為對照標準，使用不添加被檢物質(zhì)的William'sE培養(yǎng)基，規(guī)定器官培養(yǎng)后的毛的伸長量為100%。[表3]<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>與對照標準相比，看到了CsA(100ng/mL)具有毛伸長率達到116%的毛伸長促進效果，而在CsA(1000ng/mL)方面看到具有毛伸長率達到120%的毛伸長促進效果。(3)總結(jié)因此，顯示可以以豬臀部的毛的伸長量為指標來評價毛生長調(diào)節(jié)劑。權(quán)利要求1.一種評價或篩選毛生長調(diào)節(jié)劑的方法，其特征在于在被檢物質(zhì)的存在下，將豬的毛囊進行器官培養(yǎng)，對促進或抑制該毛囊的生長的物質(zhì)進行評價或者選擇。2.—種評價或篩選雄性激素依賴性毛生長調(diào)節(jié)劑的方法，其特征在于在被檢物質(zhì)的存在下，將豬的腹部或背部的毛囊進行器官培養(yǎng)，對促進或抑制該毛囊的生長的物質(zhì)進行評價或者選擇。3.—種評價或篩選用于男性型脫毛癥的毛生長促進劑的方法，其特征在于在被檢物質(zhì)的存在下，將豬的腹部的毛囊進行器官培養(yǎng)，對促進該毛囊的生長的物質(zhì)進行評價或者選擇。4.一種評價或篩選用于雄性激素依賴性毛的毛生長抑制劑的方法，其特征在于在被檢物質(zhì)的存在下，將豬的背部的毛囊進行器官培養(yǎng)，對抑制該毛囊的生長的物質(zhì)進行評價或者選擇。5.—種評價或篩選雄性激素非依賴性毛生長調(diào)節(jié)劑的方法，其特征在于在被檢物質(zhì)的存在下，將豬的側(cè)腹、腹股溝部、肩或臀部的毛囊進行器官培養(yǎng)，對促進或抑制該毛囊的生長的物質(zhì)進行評價或者選擇。全文摘要本發(fā)明提供一種利用了容易得到的動物的評價或篩選毛生長調(diào)節(jié)劑的方法。該評價或篩選毛生長調(diào)節(jié)劑的方法的特征在于在被檢物質(zhì)的存在下，對豬的毛囊進行器官培養(yǎng)，評價或者選擇促進或抑制該毛囊的生長量的物質(zhì)。文檔編號G01N33/15GK101251528SQ200810080430公開日2008年8月27日申請日期2008年2月18日優(yōu)先權(quán)日2007年2月22日發(fā)明者伊藤紀子,布施千繪,森脇繁,笹嶋美知代申請人:花王株式會社