專利名稱：穩(wěn)定熒光標(biāo)記細(xì)胞核的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及半導(dǎo)體材料量子點(diǎn)和細(xì)胞熒光標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體而 言，本發(fā)明提供了聯(lián)合使用半導(dǎo)體納米材料量子點(diǎn)和細(xì)胞核有機(jī)熒光 染料DAPI或PI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行穩(wěn)定熒光標(biāo)記的方法，及含有上述量子 點(diǎn)和DAPI或PI的用于細(xì)胞核穩(wěn)定熒光標(biāo)記的試劑盒。
背景技術(shù)：
，.
在傳統(tǒng)的細(xì)胞核熒光標(biāo)記技術(shù)中，多采用有機(jī)熒光染料4、6-二 脒基-2-苯基p引咮(4'， 6-diamidino-2-phenyl indole, DAPI， C6H15N5 2HC1 ， 分子量為 350. 25 )和碘化丙咬(3， 8-Diamino-5-(3-d i e t hy1me t hy1 am i no) propyl)-6-pheny1 phenan t hr i d i n i um diiodide， PI， C27H34NJ2，分子量為668. 4 )進(jìn)行細(xì)胞核標(biāo)記。DAPI 和PI都可透過(guò)細(xì)胞膜與細(xì)胞核中的染色體DNA強(qiáng)力結(jié)合，通常在熒光 顯微鏡下，經(jīng)紫外光(364nm波長(zhǎng))激發(fā)后使經(jīng)過(guò)DAPI染色的細(xì)胞核 呈現(xiàn)亮藍(lán)色熒光，經(jīng)紅色熒光(550nm波長(zhǎng))激發(fā)后使經(jīng)過(guò)PI染色的 細(xì)胞核呈現(xiàn)亮紅色熒光，在細(xì)胞生物學(xué)研究中用于觀察細(xì)胞核的定位、 結(jié)構(gòu)和形態(tài)改變。
隨著材料科學(xué)的日益發(fā)展，無(wú)機(jī)染料熒光半導(dǎo)體納米顆粒量子點(diǎn) (Quantum dots ， QDs )其獨(dú)特的光學(xué)特性在20世紀(jì)70年代就引起 物理學(xué)家、化學(xué)家、電子工程學(xué)家的廣泛關(guān)注。量子點(diǎn)是由II-VI族元 素(如CdSe、 CdS等)或III- V族元素(如InP、 InAS)組成的尺寸小 于lOOnm的半導(dǎo)體納米微晶體。1997年以來(lái)，隨著量子點(diǎn)制備技術(shù)的 不斷改進(jìn)，量子點(diǎn)逐漸用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究。與有機(jī)熒光染料相 比，在激發(fā)光波長(zhǎng)范圍量子點(diǎn)具有更好的光穩(wěn)定性，熒光度強(qiáng)，激發(fā) 光譜寬，發(fā)射光譜窄并且對(duì)稱分布、不易被光解或漂白，它的發(fā)光強(qiáng)度比有機(jī)熒光染料分子至少?gòu)?qiáng)20倍，光化學(xué)穩(wěn)定性提高100 ~ 200倍 [Chan WCW， Maxwell DJ， Gao XH， et al. Luminescent quantum dots for multiplexed biological detection and imaging"]. Curr Opin Biotechnol， 2002; 13(1): 40-46.Jaiswal JK， Mattoussi H， Mauro JM， et al. Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates [J]. Nat Biotechnol, 2003; 21(1): 47-51]。這些特性決定了量子點(diǎn)是用于生物檢測(cè)與成像技術(shù)的令人滿意的 多元才示^己凈勿[Gao XH and Nie SM. Quantum dot—encoded mesoporous beads with high brightness and uniformity: Rapid readout using flow cytometry [J]. Analytical Chemistry 2004; 76(8): 2楊-2410. Gao XH and Nie SM. Doping mesoporous materials with multicolor quantum dots [J]. Journal Of Physical Chemistry B 2003; 107 (42): 11575—11578.Han MY. et al. Quantum-dot-tagged microbeads for mulUplexed opticalcoding ofbiomolecules [J]. Nature Biotechnology 2001; 19 (7): 631-635]。生物學(xué)常用的量子點(diǎn)包括 一個(gè)硒化鎘(CdSe)核心和一個(gè)被相應(yīng)配基包被的溶于水的外殼(如 硫化鋅，ZnS)構(gòu)成。這種內(nèi)核與外殼結(jié)構(gòu)鈍化了 CdSe核心的表面， 使之產(chǎn)生很高的光激發(fā)量子點(diǎn)產(chǎn)量，并保持光穩(wěn)定性[Dabbousi BO. et al. (CdSe) ZnS core-shellquantum dots:Synthesis and characterization of a size series of highly luminescent nanocrystal1ites[J]. Journal of Physical Chemistry B 1997; 101 (46): 9463-9475]。不同粒徑的量子點(diǎn)，可以產(chǎn)生不同顏色的熒光。 經(jīng)激發(fā)光照射后，不同大小量子點(diǎn)材料可產(chǎn)生不同顏色的焚光[Smith AM， Dave S， Nie S， et al. Multicolor quantum dots for molecular diagnostics of cancer [J].Expert Rev Mol Diagn， 2006; 6 (2): 231-244]。由于量子限制效應(yīng)，材料的能級(jí)由大小決定，量子點(diǎn) 的激發(fā)光也如此。通過(guò)改變納米顆粒的大小和化學(xué)組成，量子點(diǎn)的發(fā) 射光波長(zhǎng)范圍可涵蓋從紫外到紅外區(qū)間[Bailey, RE and Nie SM. Alloyed semiconductor quantum dots:Tuning the opticalproperties without changing the particle size[J]. Journal of The American Chemical Society 2003; 125(23): 7100-7106]。量 子點(diǎn)的激發(fā)光譜范圍很寬，在單一激發(fā)光波長(zhǎng)下可見(jiàn)不同顏色的量子 點(diǎn)。不同大小的量子點(diǎn)，各自以不同波長(zhǎng)為中心發(fā)射出一個(gè)很窄的居 中對(duì)稱峰。近年研究發(fā)現(xiàn)，將量子與細(xì)胞特殊分子的靶向物質(zhì)，如抗 體、鏈親和素-生物素系統(tǒng)結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)特殊分子的標(biāo)記及 其長(zhǎng)時(shí)間示蹤成像[Lidke DS， Nagy P， Heintzmann R, et al. Quantum dot ligands provide new insights into erbB/HER receptor-mediated signal transduction [J]. Nat Biotechnol, 2004; 22 (2):198-203. So MK，Xu CJ，Loening AM，et al. Self-i 1 luminat ing quantum dot conjugates for in vivo imaging [J〗. Nat Biotechnol, 2006; 24 (3) : 339- 343. Wang Q， Xu Y, Zhao X， et al. A facile one—step in situ functionalization of quantum dots with preserved photoluminescence for bioconjugation. J Am Chem Soc. 2007, 129 (20): 6380-6381]。但是，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)在聯(lián) 合應(yīng)用量子點(diǎn)與DAPI或者PI的基礎(chǔ)上，直接運(yùn)用量子點(diǎn)獨(dú)特光學(xué)性 質(zhì)，不經(jīng)特殊靶向分子介導(dǎo)的細(xì)胞核穩(wěn)定多色長(zhǎng)期示蹤的標(biāo)記技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
要解決的技術(shù)問(wèn)題
在細(xì)胞生物學(xué)研究中，用于細(xì)胞核熒光標(biāo)記的有機(jī)熒光染料，如 DAPI、 PI等， 一方面，這些有機(jī)熒光染料的主要缺點(diǎn)是光穩(wěn)定性差， 所發(fā)出的熒光在激發(fā)光持續(xù)照射下迅速發(fā)生光漂白(通常持續(xù)照射3 分鐘后熒光信號(hào)很快消失)，很難長(zhǎng)時(shí)間保持細(xì)胞核的焚光標(biāo)記狀態(tài) [Wu XY， Liu HJ， Liu JQ， et al, Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots [J]. Nat Biotechnol, 2003; 21(1): 41-46]。另一方面，當(dāng)觀察細(xì)胞核與細(xì)胞中多種分子或細(xì)胞器的相互 定位關(guān)系時(shí)，涉及多重?zé)晒鈽?biāo)記，需要在同一位置從不同熒光通道中記錄不同分子的定位信息，細(xì)胞核經(jīng)過(guò)持續(xù)熒光照射后熒光定位信號(hào)
迅速衰減。例如，聯(lián)用DAPI標(biāo)記細(xì)胞核、用交聯(lián)了 FITC的抗細(xì)胞角 蛋白抗體(FITC-cytokeratin)聯(lián)合示蹤胞漿角蛋白時(shí)，在顯微鏡下 反復(fù)對(duì)比觀察同一細(xì)胞的細(xì)胞核和不同細(xì)胞器熒光定位時(shí)，焚光信號(hào)， 尤其是被PAPI染為藍(lán)色的細(xì)胞核熒光信號(hào)衰減十分迅速，很難全部記 錄定位信息和對(duì)細(xì)胞核長(zhǎng)時(shí)間示蹤。因此，需要開(kāi)發(fā)長(zhǎng)期穩(wěn)定熒光標(biāo) 記細(xì)胞核的示蹤方法和產(chǎn)品。 一方面，常規(guī)的細(xì)胞核焚光染料，如DAPI 和PI，只能使細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色或紅色熒光，而蛋白質(zhì)對(duì)不同焚光染料 具有特殊偏好性，當(dāng)觀察細(xì)胞中多種分子的熒光多重定位信息時(shí)，需
要研發(fā)具有多種熒光顏色的細(xì)胞核標(biāo)記物質(zhì)，以便實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞核的選 擇性多色熒光標(biāo)記。
另一方面，單純利用量子點(diǎn)獨(dú)特的光學(xué)優(yōu)勢(shì)尚不能實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞核 的選擇性定位。利用量子點(diǎn)獨(dú)特的光學(xué)特性實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞核選擇性標(biāo)記 還需要先將量子點(diǎn)與核定位的導(dǎo)向分子，如抗體、鏈親和素-生物素 系統(tǒng)或細(xì)胞核定位信號(hào)(nuclear localization signals, NLS )等 分子交聯(lián)才能對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行定位標(biāo)記，導(dǎo)致采用量子點(diǎn)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行 熒光標(biāo)記步驟繁瑣，效率低下。
所采用的技術(shù)方案
為克服使用常規(guī)有機(jī)熒光染料DAPI或PI和無(wú)機(jī)染料量子點(diǎn)在細(xì) 胞核染色中的上述缺陷，本發(fā)明進(jìn)行了多方面研究，結(jié)果出人意料地 發(fā)現(xiàn)，當(dāng)聯(lián)合使用DAPI或PI與量子點(diǎn)對(duì)生物樣品細(xì)胞核進(jìn)行熒光標(biāo) 記時(shí)，粒徑范圍在5 - 2 0 nm之間的表面經(jīng)羧基化修飾的量子點(diǎn)與DAP I 或PI聯(lián)合施用到生物樣品，經(jīng)過(guò)波長(zhǎng)340-380nm的紫外光照射激發(fā)， 結(jié)果與染色體DNA結(jié)合的DAPI或PI和量子點(diǎn)表面發(fā)生不可逆的化學(xué) 結(jié)合反應(yīng)，量子點(diǎn)不可逆地與細(xì)胞核染色體DNA結(jié)合，在焚光顯微鏡 下標(biāo)記樣本用400-700nm波長(zhǎng)激發(fā)照射時(shí)細(xì)胞核呈現(xiàn)穩(wěn)定的熒光，從 而實(shí)現(xiàn)了對(duì)生物樣品的細(xì)胞核穩(wěn)定的選擇性示蹤標(biāo)記。
更具體地，本發(fā)明提供了下述生物樣品的細(xì)胞核的焚光標(biāo)記方法 1)施用粒徑范圍5-20 run的羧基化量子點(diǎn)到生物樣品，使之為3-80 nM量子點(diǎn)/l()5個(gè)細(xì)胞；
2) 使量子點(diǎn)與生物樣品共孵育；
3) 再施用有機(jī)熒光染料到生物樣品；
4) 對(duì)生物樣品進(jìn)行340-380nm的紫外激發(fā)光照射，使之發(fā)生與 染色體DNA不可逆地結(jié)合，然后轉(zhuǎn)到波長(zhǎng)400-700rnn的激發(fā)光下觀察。
任選地，在本發(fā)明的方法中，步驟1)中的生物樣品是細(xì)胞；或 者步驟l)中的生物樣品，105個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)于直徑3. 5cm的培養(yǎng)皿中； 或者步驟l)中生物樣品來(lái)自哺乳動(dòng)物；或者步驟l)中的生物樣品來(lái) 自人。
任選地，在本發(fā)明的方法中，步驟2)中的孵育條件為I、標(biāo)記 活細(xì)胞細(xì)胞核時(shí)量子點(diǎn)與細(xì)胞在37'C共孵育10-24小時(shí)，使用含10 %胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液的緩沖體系；II、標(biāo)記固定于玻片上細(xì)胞的 細(xì)胞核時(shí)量子點(diǎn)與細(xì)胞在室溫下共孵育1小時(shí)，使用2。/。BSA的緩沖 體系。
任選地，在本發(fā)明的方法中，上述步驟1)中的量子點(diǎn)的施用可 以在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，或者細(xì)胞固定后施用。
任選地，在上述步驟2、 3之間和/或步驟3、 4之間還包括洗滌 步驟。
任選地，其中步驟3中的有機(jī)熒光染料是DAPI或者PI，當(dāng)是DAPI 的情況下，使用的濃度為5-20 nM DAPI/1()5個(gè)細(xì)胞，當(dāng)是PI的情況 下，使用的濃度為10-20 nM PI/1()5個(gè)細(xì)胞。
任選地，其中步驟3中的有機(jī)熒光染料是DAPI或者PI，也包括 溴化乙錠(Ethidium Bromide, EB)及其4汙生物、丫咬橙(Acridine orange， AO) 、 Hoechst 33258和Hoechst 33342等常用有機(jī)熒光染料。
任選地，在上述步驟4中的紫外激發(fā)光的波長(zhǎng)范圍在10-400nm， 進(jìn)一步優(yōu)選254-380nm，更優(yōu)選340 - 380nm。
任選地，在上述步驟4中將生物樣品置于焚光顯微鏡下。
任選地，在上述步驟4之后將生物樣品保藏在常溫、4。C或者-70 。C環(huán)境下。此外，在本發(fā)明的方法中采用的羧基化量子點(diǎn)的粒徑范圍優(yōu)選5 -20nm，進(jìn)一步優(yōu)選5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20認(rèn)。
所述的熒光標(biāo)記對(duì)象包括細(xì)胞、組織和動(dòng)物的細(xì)胞核染色體DM。 適用本發(fā)明的方法、試劑盒和方法的適當(dāng)?shù)募?xì)胞類型包括胚胎時(shí)期內(nèi) 胚層、中胚層和外胚層分化的所有類型的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，其包 括但不限于唇癌、口腔癌、鼻咽癌、喉癌、甲狀腺癌、食管癌、胃 癌、腸癌、肝癌、膽囊癌、胰腺癌、肺癌、皮膚癌、乳腺癌、外陰癌、 陰道癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、輸卵管癌、陰莖癌、前列腺 癌、睪丸癌、腎癌、膀胱癌、尿道癌、眼瞼癌、結(jié)膜癌和淚腺癌，以 及實(shí)驗(yàn)室常規(guī)采用的體外培養(yǎng)細(xì)胞系C0S-7細(xì)胞、CHO細(xì)胞、NIH3T3 細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、10T1/2細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、EC0156 細(xì)胞、PL45細(xì)胞等。優(yōu)選NIH3T3細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、10T1/2 細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、EC0156細(xì)胞、PL45細(xì)胞，進(jìn)一步優(yōu)選HepG2細(xì)胞、 10T1/2細(xì)胞、PL45細(xì)胞和EC0156細(xì)胞，還優(yōu)選10T1/2細(xì)胞、PL45 細(xì)胞和EC0156細(xì)胞，最優(yōu)選EC0156細(xì)胞；適用本發(fā)明的細(xì)胞可以是 死細(xì)胞，也可以是活細(xì)胞，優(yōu)選在免疫組化的過(guò)程中使用的細(xì)胞。
適用本發(fā)明的方法和試劑盒的組織包括各種動(dòng)物來(lái)源的組織，所 述動(dòng)物可以是兩棲類、哺乳類等的動(dòng)物，例如斑馬魚(yú)、非洲爪蟾、 小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、狗、猴子等；優(yōu)選小鼠、大鼠、豚鼠、兔 子；還優(yōu)選小鼠、大鼠；最優(yōu)選小鼠。
本發(fā)明還提供了如下的試劑盒，其中包括(l)標(biāo)記液，所述標(biāo) 記液中含有DAPI或PI和量子點(diǎn)，其中量子點(diǎn)是被表面羧基化的，其 粒徑范圍為5-20nm。所用的量子點(diǎn)的包裝為可以配制成工作濃度為 5-80nM量子點(diǎn)/105個(gè)細(xì)胞的母液形式(如濃度為4 p M )，而且其中 的量子點(diǎn)可以配制在用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基緩沖液中，還可以配制在 生理鹽水緩沖液或者適合標(biāo)記細(xì)胞核的其它本領(lǐng)域公知的緩沖液中， 工作溫度為37°C，也可以在室溫。其中DAPI的包裝成可以配制成工 作濃度5-20nM /105個(gè)細(xì)胞的母液(如濃度為6 mM)或者粉末狀態(tài)；PI包裝成可以配制成工作濃度10-20nM/l()5個(gè)細(xì)胞的母液(如濃度為 lmM)或者粉末狀態(tài)。所述試劑盒還包括細(xì)胞標(biāo)記、免疫組化等常規(guī)使 用的(2)固定液，(3)封片液等，此外，所述試劑盒還可以包括(4) 說(shuō)明書(shū)。所述說(shuō)明書(shū)具體闡述了試劑盒中所含試劑外，還具體闡述了 如何通過(guò)前述方法實(shí)施所述的焚光標(biāo)記。
有益效果
通過(guò)實(shí)驗(yàn)l^證，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明與現(xiàn)有傳統(tǒng)有機(jī)熒光標(biāo)記細(xì)胞 核的技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果
1. 成像穩(wěn)定，在相同的激發(fā)光連續(xù)照射下，本發(fā)明熒光標(biāo)記的 細(xì)胞核具有很強(qiáng)的抗光淬滅能力，其熒光半衰期(1-3天)是DAPI 和PI為代表的傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料熒光淬滅時(shí)間(2-5分^t)的1000 - 3000倍。
2. 標(biāo)記簡(jiǎn)便、快捷。
3. 熒光標(biāo)記信號(hào)保存時(shí)間長(zhǎng)，本發(fā)明熒光標(biāo)記的細(xì)胞核在4'C 避光條件下保存超過(guò)1-3年，優(yōu)選至少60 - 90天，熒光定位信息仍 然存在，而傳統(tǒng)有機(jī)熒光DAPI或PI標(biāo)記的細(xì)胞核熒光信號(hào)僅能保存 10-20天，最長(zhǎng)一個(gè)月后熒光定位信息完全淬滅。本發(fā)明熒光標(biāo)記的 細(xì)胞核在-20。C或-8(TC避光條件下保存時(shí)間更長(zhǎng)。
4. 適用廣泛，經(jīng)過(guò)多種實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明的標(biāo)記方法和試劑盒， 量子點(diǎn)的攝入對(duì)于多種固定的細(xì)胞和培養(yǎng)的活細(xì)胞而言是通用的，進(jìn) 而所述方法和試劑盒可以進(jìn)一步應(yīng)用到流式細(xì)胞儀和組織染色，例如 免疫組織化學(xué)等中。
5. 成本低廉、方法簡(jiǎn)單，操作方便，實(shí)用性強(qiáng)，本發(fā)明與目前 國(guó)內(nèi)外的量子點(diǎn)熒光標(biāo)記技術(shù)方法相比，不必先將量子點(diǎn)與抗體、鏈 親和素-生物素系統(tǒng)或細(xì)胞核定位信號(hào)(NLS )等細(xì)胞核定位導(dǎo)向分子 連接，而直接采用游離的量子點(diǎn)標(biāo)記，節(jié)省了中間步驟。
6. 通過(guò)選擇不同粒徑的量子點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞核的多色熒光 標(biāo)記，如藍(lán)色、綠色、黃色、紅色、桔紅色等。


圖l是用本發(fā)明的方法對(duì)固定的食管癌細(xì)胞系EC0156細(xì)胞的量子 點(diǎn)熒光標(biāo)記細(xì)胞核的成像結(jié)果。按照本發(fā)明的實(shí)施例1固定細(xì)胞標(biāo)記 方法和條件，通過(guò)熒光顯微鏡下觀察得到了清晰的食管癌細(xì)胞EC0156 細(xì)胞核的標(biāo)記成像(a-c， g-i)。 a、 g是未經(jīng)紫外激發(fā)的綠色熒光成 像；b、 h為有機(jī)熒光染料DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核區(qū)域；c、 i為紫外激發(fā) 后，細(xì)胞核被量子點(diǎn)標(biāo)記為綠色。按照本發(fā)明的實(shí)施例2培養(yǎng)的活細(xì) 胞量子點(diǎn)與PI標(biāo)記方法和條件，通過(guò)熒光顯微鏡，得到了清晰的食管 癌細(xì)胞EC0156細(xì)胞核的標(biāo)記成像U-f， j-l) 。 d、 j是未經(jīng)紫外激 發(fā)的綠色熒光成像，e、 k為有機(jī)熒光染料PI標(biāo)記的細(xì)胞核區(qū)域，f、 l為紫外激發(fā)后，細(xì)胞核被量子點(diǎn)標(biāo)記為綠色。
圖2是用本發(fā)明的方法對(duì)不同細(xì)胞系細(xì)胞核進(jìn)行熒光標(biāo)記得到的 成像結(jié)果。為了進(jìn)一步證明本技術(shù)細(xì)胞核熒光標(biāo)記的通用性，選用了 不同的細(xì)胞系，包括人胰腺癌細(xì)胞PL45、人食管癌細(xì)胞EC0156和小 鼠成纖維細(xì)胞10T1/2,按照本發(fā)明的實(shí)施例3的固定于玻片上細(xì)胞的 細(xì)胞核標(biāo)記方法和條件，通過(guò)熒光顯微鏡，得到了三種細(xì)胞系分別經(jīng) DAPI或PI與綠色量子點(diǎn)結(jié)合后的清晰細(xì)胞核熒光標(biāo)記成像。左側(cè)是 未經(jīng)紫外激發(fā)的綠色熒光成像(a、 d、 g、 j、 m、 p)，中間為有機(jī)熒 光染料DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核(b、 h、 n)和PI標(biāo)記的細(xì)胞核(e、 k、 q)， 右側(cè)為紫外激發(fā)后，細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)明亮的綠色量子點(diǎn)標(biāo)記(c、 f、 i、 1、 o、 r)。
圖3為本發(fā)明量子點(diǎn)快速標(biāo)記細(xì)胞核的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。按照上述本發(fā) 明的活細(xì)胞標(biāo)記方法和條件，標(biāo)記好的細(xì)胞，在焚光顯孩吏鏡下，經(jīng)紫 外激發(fā)5秒，10秒，15秒和120秒后，分別獲取一張綠色熒光圖像， 可見(jiàn)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞核內(nèi)熒光強(qiáng)度的遞增情況。
具體實(shí)施方式
本申請(qǐng)所要求保護(hù)的范圍并不局限于所述的實(shí)施例。
實(shí)施例1:不同量子點(diǎn)標(biāo)記固定于玻片上細(xì)胞的胞核
為了選擇合適的量子點(diǎn)聯(lián)合有機(jī)焚光染料標(biāo)記細(xì)胞核，申請(qǐng)人選
擇產(chǎn)自北京涌源亮點(diǎn)納米科技有限公司和本領(lǐng)域熟知的美國(guó)Invitrogen公司的綠色的量子點(diǎn)(分別命名為QD1和QD2 )驗(yàn)證所述方法是否能夠標(biāo)記細(xì)胞核，聯(lián)合使用有機(jī)熒光染料DAPI或PI和量子點(diǎn)對(duì)固定的人食管癌細(xì)胞系EC0156細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞核標(biāo)記。具體如下
聯(lián)合使用DAPI步驟如下
1. 人食管癌細(xì)胞系EC0156細(xì)胞[Wang， Q. ; Xu， Y. ; Zhao， X.;Chang， Y.; Uu， Y.; J"ng， L.; Sharma， J.; Seo， D" Yan， H. AFacile 0ne-Step in situ Functiona1ization of Quantum Dots withPreserved Photoluminescence f or Bioconjugat ion J. Am. Chem. Soc.2007， 129， 6380-6381]培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco BRL公司，Grand Island, NY, USA)中，于37°C,含5 % C02條件下培養(yǎng)。每?jī)商旄鼡Q培養(yǎng)液，每3 5天傳代一次。
2. 細(xì)胞培養(yǎng)玻片的處理，將20mm x 20mm蓋玻片用水洗凈，放入石克酸-重鉻酸鉀液(濃疏酸lQQml，重鉻酸鉀lQQg，蒸鎦水lQQOml)浸泡1天，自來(lái)水沖洗30次，蒸餾水洗滌10次，浸泡入100%乙醇中，備用。
3. 細(xì)胞爬片制備，將蓋玻片平鋪于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，0.01%多聚賴氨酸400ul處理蓋玻片30分鐘。用0. 125%胰蛋白酶(美國(guó)Amresco公司，Solon， Ohio, USA)消化細(xì)胞，按2 x lo5細(xì)胞/孔接種，于37。C，含5%0)2條件下培養(yǎng)。
4. 細(xì)胞經(jīng)1 x PBS溶液(137mMNaCl， 2.7mMKCl， 10mMNa2HPO"2 mM KH2P04, pH7. 4 )洗滌2次，每次2-5分鐘。
5. 細(xì)胞經(jīng)4。/。多聚曱醛-PBS固定液固定30分鐘，每張蓋玻片
2ml。
6. 用1 xPBS溶液洗滌細(xì)胞3次，每次2-5分鐘。7. 滴加0.06% (體積/體積)Triton X-100溶液lml,室溫處理細(xì)胞10分鐘。
8. 用1 x PBS溶液洗滌細(xì)胞3次，每次2-5分鐘。
9. 用含2。/qBSA(美國(guó)Sigma/>司，Saint Louis, Missouri, USA)的1 x PBS溶液，室溫封閉30分鐘。
10. 將處理好的細(xì)胞分成兩組。分別滴加綠色量子點(diǎn)QD1 (北京涌源亮點(diǎn)納米科技有限公司產(chǎn)品，批號(hào)CB-G520 )或QD2 (美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品，批號(hào)Q22031MP， Carlsbad, CA， USA)至終濃度為16nM，使量子點(diǎn)與固定于玻片上的細(xì)胞室溫孵育1小時(shí)。
11. 用lxPBS溶液洗滌細(xì)胞3次，每次2-5分鐘。
12. 滴力口 DAPI (美國(guó)Sigma/>司，Saint Louis, Missouri, USA)甘油緩沖液(DAPI 2ug/ral， 50%甘油)，用蓋玻片封片。
13. 分別經(jīng)波長(zhǎng)488nm激發(fā)光照射、紫外光(380nm波長(zhǎng))照射激發(fā)量子點(diǎn)與DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核不可逆地結(jié)合，然后轉(zhuǎn)綠色熒光激發(fā)光488nm波長(zhǎng)照射下，觀察細(xì)胞核成4象。
聯(lián)合使用PI步驟步驟1-11同上。
12. 滴力口 PI (美國(guó)Sigma公司，Saint Louis, Missouri, USA)甘油緩沖液(PI 10ug/ml， 50%甘油)，用蓋玻片封片。
13. 分別經(jīng)波長(zhǎng)488nm激發(fā)光照射、550認(rèn)激發(fā)光照射觀察PI標(biāo)記的細(xì)胞核后、以紫外380nm照射激發(fā)量子點(diǎn)與PI標(biāo)記的細(xì)胞核不可逆的結(jié)合，然后轉(zhuǎn)綠色熒光激發(fā)光488nm波長(zhǎng)照射下，觀察細(xì)胞核成像。
結(jié)果具體可以參見(jiàn)圖1，從圖1中可以發(fā)現(xiàn)綠色量子點(diǎn)QD1和QD2在488nm激發(fā)光照射下主要存在于胞漿，標(biāo)記細(xì)胞經(jīng)紫外照射(380nm)激發(fā)后改用波長(zhǎng)488nm激發(fā)的綠色熒光照射，可見(jiàn)細(xì)胞核被綠色量子點(diǎn)標(biāo)記為亮綠色。
14. 除了分別使用6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、17、 18、 19和20nm的量子點(diǎn)QD1和QD2替換上述5認(rèn)的量子點(diǎn)之外，在與實(shí)施例l的l-13相同的條件下重復(fù)試驗(yàn)，得到了與上面相似的結(jié)果。
變更QD1和QD2的濃度為10、 15、 20、 25、 30、 40、 50、 70、 80nM，在與實(shí)施例1的1 - 14相同的條件下重復(fù)試驗(yàn)，得到了與上面相似的結(jié)果。
實(shí)施例2:聯(lián)合使用DAPI或PI和綠色量子點(diǎn)進(jìn)行活細(xì)胞的胞核
標(biāo)記
為了驗(yàn)證所述方法中量子點(diǎn)是否能與培養(yǎng)的活細(xì)胞共孵育，聯(lián)合使用有機(jī)熒光染料DAPI或PI和量子點(diǎn)對(duì)體外培養(yǎng)的食管癌EC0156細(xì)l包的細(xì)力包核標(biāo)i己。具體如下
聯(lián)合使用PI標(biāo)記步驟
1. 人食管癌細(xì)胞EC0156培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco BRL/〉司，Grand Island, NY， USA)中，于37。C,含
5。/oC0 2條件下培養(yǎng)，每隔兩天更換培養(yǎng)液，每3~5天傳代一次。
2. 細(xì)胞培養(yǎng)玻片的處理，將20mrax 20mm蓋玻片用水洗凈，放入硫酸-重鉻酸鉀液(濃石克酸lQQm1,重鉻酸鉀100g，蒸餾水lGGOml)浸泡1天，自來(lái)水沖洗30次，蒸餾水洗滌10次，浸泡入100%乙醇中，備用。
3. 細(xì)胞爬片制備，將蓋玻片平鋪于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，Q. 01%多聚賴氨酸400ul處理蓋玻片30分鐘。用0. 125%胰蛋白酶(美國(guó)Amresco公司，Solon， Ohio, USA)消化細(xì)胞，按2 x 105細(xì)胞/孑L接種，于37。C，含5%0)2條件下培養(yǎng)。
4. 24小時(shí)后，棄培養(yǎng)上清，加入含16nM的綠色量子點(diǎn)QD1 (北京涌源亮點(diǎn)納米科技有限公司產(chǎn)品，批號(hào)CB-G520 )的完全培養(yǎng)液，共孵育24小時(shí)。
5. 用1 x PBS溶液洗滌細(xì)胞2次，每次2-5分鐘。
6. 細(xì)胞經(jīng)40/。多聚甲醛-PBS固定液固定30分鐘，每張蓋玻片
2ml。
7. 用1 x PBS溶液洗滌細(xì)胞3次，每次2-5分鐘。8. 滴力口 PI (美國(guó)Sigma/>司，Saint Louis， Missouri, USA)甘油緩沖液(PI 10ug/ml， 50%甘油)，用蓋玻片封片。
9. 分別經(jīng)波長(zhǎng)488nm激發(fā)光照射、550nm激發(fā)光照射觀察PI標(biāo)記的細(xì)胞核后、以紫外380nm照射激發(fā)量子點(diǎn)與PI標(biāo)記的細(xì)胞核不可逆的結(jié)合，然后轉(zhuǎn)綠色熒光激發(fā)光488nm波長(zhǎng)照射下，觀察細(xì)胞核成像。
聯(lián)合使用DAPI標(biāo)記步驟步驟1-7同上。
8. 滴力口 DAPI (美國(guó)Sigma 7>司，Saint Louis， Missouri, USA)甘油緩沖液(DAPI 2ug/ml， 50%甘油)，用蓋玻片封片。
9. 分別經(jīng)波長(zhǎng)488nm激發(fā)光照射、紫外光(380nm波長(zhǎng))照射激發(fā)量子點(diǎn)與DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核不可逆地結(jié)合，然后轉(zhuǎn)綠色熒光激發(fā)光488nm波長(zhǎng)照射下，觀察細(xì)胞核成像。
結(jié)果具體可以參見(jiàn)圖1 (d-f， ，從圖1 (i， 1)中可以發(fā)
現(xiàn)經(jīng)過(guò)本發(fā)明的方法標(biāo)記的細(xì)胞核顯示出很強(qiáng)的綠色熒光，由此證明本發(fā)明的標(biāo)記方法能夠特異性對(duì)培養(yǎng)的活細(xì)胞核進(jìn)行穩(wěn)定的熒光標(biāo)記。
實(shí)施例3:聯(lián)合使用DAPI或PI和綠色量子點(diǎn)標(biāo)記固定于玻片上的多種細(xì)胞的細(xì)胞核
為了驗(yàn)證所述方法是否能夠標(biāo)記固定于玻片上細(xì)胞的細(xì)胞核，聯(lián)合使用DAPI或PI和綠色量子點(diǎn)分別對(duì)食管癌EC0156細(xì)胞、胰腺癌PL45細(xì)胞和小鼠成纖維細(xì)胞10T1/2進(jìn)行細(xì)胞核標(biāo)記。具體如下
聯(lián)合使用DAPI步驟
1. 人食管癌細(xì)胞EC0156，人胰腺癌細(xì)胞PL45和小鼠成纖維細(xì)胞10T1/2培養(yǎng)于含100/。胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco BRL公司，Grand Island, NY， USA)中，于37。C，含5%(:02條件下培養(yǎng)，每隔兩天更換培養(yǎng)液，每3 5天傳代一次。
2. 細(xì)胞培養(yǎng)玻片的處理，將20mmx 20mm蓋玻片用水洗凈，放入硫酸-重鉻酸鉀液(濃硫酸lQQml，重鉻酸鉀lQQg，蒸餾水10G0ml)浸泡1天，自來(lái)水沖洗30次，蒸餾水洗滌10次，浸泡入100%乙醇中，備用。
3. 細(xì)胞爬片制備，將蓋玻片平鋪于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，0.01%多聚賴氨酸400ul處理蓋玻片30分鐘。用0. 125%胰蛋白酶(美國(guó)Amresco公司，Solon, Ohio, USA)消化細(xì)胞，按2 x 105細(xì)胞/孔接種，于37。C，含5%(:02條件下培養(yǎng)。
4. 細(xì)胞經(jīng)1 x PBS溶液(137mMNaCl， 2.7mMKCl， 1 OmM Na2HP04，2 mM KH2P04， pH7. 4 )洗滌2次，每次2-5分鐘。
5. 細(xì)胞經(jīng)4。/。多聚甲醛-PBS固定液固定30分鐘，每張蓋玻片
2tnl。
6. 用1 x PBS溶液洗滌細(xì)胞3次，每次2-5分鐘。
7. 滴加0. 06% (體積/體積)Triton X-100溶液lml，室溫孵育細(xì)胞IO分鐘。
8. 用1 x PBS溶液洗滌細(xì)胞3次，每次2-5分鐘。
9. 用含2% BSA(美國(guó)Sigma公司，Saint Louis, Missouri, USA)的lxPBS溶液，室溫封閉30分鐘。
10. 將處理好的細(xì)胞滴加終濃度為16nM的綠色量子點(diǎn)QD1 lOOul，室溫與細(xì)胞共孵育1小時(shí)。
11. 用1 xPBS溶液洗滌細(xì)胞3次，每次2-5分鐘。
12. 滴力口 DAPI (美國(guó)Sigma 7>司，Saint Louis, Missouri, USA)甘油緩沖液(DAPI 2ug/ml， 50%甘油)，用蓋玻片封片。
13. 分別經(jīng)波長(zhǎng)488nm激發(fā)光照射、波長(zhǎng)380nm的紫外光照射激發(fā)量子點(diǎn)，使之與DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核不可逆地結(jié)合，然后轉(zhuǎn)綠色熒光激發(fā)光488nm波長(zhǎng)照射下，觀察細(xì)胞核成像。
聯(lián)合使用PI步驟步驟l-ll同上。
12. 滴力口 PI (美國(guó)Sigma 7>司，Saint Louis， Missouri, USA)甘油緩沖液(PI lOug/ml, 50%甘油)，用蓋玻片封片。
13. 分別經(jīng)波長(zhǎng)488nm激發(fā)光照射、550rnn激發(fā)光照射觀察PI標(biāo)記的細(xì)胞核后、以紫外380nm照射激發(fā)量子點(diǎn)與PI標(biāo)記的細(xì)胞核不可 逆的結(jié)合，然后轉(zhuǎn)綠色熒光激發(fā)光488nm波長(zhǎng)照射下，觀察細(xì)胞核成 像。
結(jié)果具體可以參見(jiàn)圖2，從圖2中發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)本發(fā)明的方法標(biāo)記 的細(xì)胞核顯示出很強(qiáng)的綠色熒光，而且對(duì)人食管癌細(xì)胞EC0156 (a-c 聯(lián)合使用DAPI; d-f聯(lián)合使用PI)、人胰腺癌細(xì)胞PL45 ( g-i聯(lián)合使 用DAPI; j-l聯(lián)合使用PI )和小鼠成纖維細(xì)胞10T1/2 ( m-o聯(lián)合使用 DAPI; p-r聯(lián)合使用PI )等三種細(xì)胞都取得了相似的結(jié)果，由此證明 本發(fā)明的標(biāo)記方法適用于各種固定于玻片上細(xì)胞(例如包括正常細(xì)胞 和腫瘤細(xì)胞)的細(xì)力包核標(biāo)記。所述方法能夠特異地對(duì)細(xì)力包核進(jìn)4于穩(wěn)定 的熒光標(biāo)記。
實(shí)施例4:聯(lián)合有機(jī)熒光核染料PAPI和量子點(diǎn)的細(xì)胞核標(biāo)記穩(wěn)定 性檢測(cè)為了檢測(cè)所述方法聯(lián)合有機(jī)熒光核染料PAPI/PI和量子點(diǎn)的 細(xì)胞核標(biāo)記穩(wěn)定性，選用食管癌EC0156細(xì)胞制作玻片上細(xì)胞爬片，經(jīng) 過(guò)固定，聯(lián)合使用DAPI或PI和綠色量子點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞核標(biāo)記。具體如 下
步驟1 ~ 9.同實(shí)施例三，把待標(biāo)記的EC0156細(xì)胞分成3組，組1 單純用DAPI或PI標(biāo)記(同實(shí)施例三.12 );組2單純用量子點(diǎn)孵育(同 實(shí)施例三.10、 11);組3量子點(diǎn)孵育后用DAPI或PI標(biāo)記(同實(shí)施例 三.IO-12);。在熒光顯微鏡觀察時(shí)，組l細(xì)胞用紫外激發(fā)后，并在 第l-5秒、10秒、30秒、5分鐘、15分鐘、30分鐘、8小時(shí)、24小 時(shí)、10天和30天分別獲取經(jīng)DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核藍(lán)色熒光圖像或PI 標(biāo)記的紅色細(xì)胞核熒光圖像；組2、 3細(xì)胞用紫外激發(fā)后，再用488nm 或550nm激發(fā)光照射，并在第1-5秒、10秒、30秒、5分鐘、15分鐘、 30分鐘、8小時(shí)、24小時(shí)、10天和30天分別獲取經(jīng)綠色量子的標(biāo)記 的細(xì)胞核綠色熒光圖像。標(biāo)記的細(xì)胞片保存在4'C。用分值表示熒光 強(qiáng)度的強(qiáng)弱，其中共分為l-5個(gè)等級(jí)，其中，l表示不可見(jiàn)；2表示可 見(jiàn)，但很弱；3表示可見(jiàn)，熒光較弱；4表示熒光較強(qiáng)，視野內(nèi)熒光明 亮，5表示很強(qiáng)，視野內(nèi)熒光很亮。常溫下標(biāo)記熒光的穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果如表1所示:
表l.聯(lián)合有機(jī)熒光核染料DAPI或PI和量子點(diǎn)的細(xì)胞核標(biāo)記穩(wěn)定性
l-510305153082410306090
秒秒秒W中樹(shù)轉(zhuǎn)小時(shí)小時(shí)天天天天
DAPI單獨(dú)標(biāo)記55555432211
PI單獨(dú)標(biāo)記555555543211
單獨(dú)量子點(diǎn)標(biāo)記111111111111
DAPI和量子點(diǎn)5555555544
聯(lián)合標(biāo)記
PI和量子點(diǎn)555544
聯(lián)合標(biāo)記
改變所用的標(biāo)記量子點(diǎn)的粒徑，將5nm變更為6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、或20認(rèn)也得到了相似的結(jié)果。通 過(guò)上述實(shí)驗(yàn)可知，本發(fā)明的方法對(duì)生物樣品細(xì)胞核的標(biāo)記具有很好的 穩(wěn)定性，在長(zhǎng)達(dá)6 0-9 0天的時(shí)間內(nèi)還能保持很強(qiáng)的熒光標(biāo)記信號(hào)。
權(quán)利要求
1. 穩(wěn)定熒光標(biāo)記細(xì)胞核的方法，所述方法包括下述步驟1)施用粒徑范圍5-20nm的羧基化量子點(diǎn)到生物樣品，使量子點(diǎn)為3-80nM量子點(diǎn)/105個(gè)細(xì)胞；2)使量子點(diǎn)與生物樣品共孵育；3)再施用有機(jī)熒光染料到生物樣品；4)對(duì)生物樣品進(jìn)行340-380nm的紫外激發(fā)光照射5-10秒后，在400-700nm波長(zhǎng)的激發(fā)光照射下觀察細(xì)胞核。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中在上述步驟2)、 3)之間和/或步驟 3)、 4)之間還包括洗滌步驟。
3. 權(quán)利要求l的方法，其中步驟l)中的生物樣品是細(xì)胞。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟1)中的生物樣品來(lái)自包括人 在內(nèi)的哺乳動(dòng)物。
5. 權(quán)利要求l的方法，其中步驟2)中的孵育條件為I、標(biāo)記 活細(xì)胞細(xì)胞核量子點(diǎn)與細(xì)胞在37X:共孵育10-24小時(shí)，使用含10 %胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液的緩沖體系；II、標(biāo)記固定于玻片上細(xì)胞的 細(xì)胞核時(shí)量子點(diǎn)與細(xì)胞在室溫下共孵育1小時(shí)，使用2。/。BSA的緩沖 體系。
6. 權(quán)利要求l的方法，其中步驟3)中的有機(jī)熒光染料是DAPI 或PI。
7. 權(quán)利要求l的方法，其中步驟3)中的有機(jī)熒光染料是DAPI 的情況下，使用的濃度為5-20 nM DAPI/1()5個(gè)細(xì)胞，是PI的情況下， 使用的濃度為10-20 nM PI/1()S個(gè)細(xì)胞。
8. 熒光標(biāo)記細(xì)胞核的試劑盒，其中含有粒徑范圍5-20 nm的羧 基化量子點(diǎn)、有機(jī)熒光染料和說(shuō)明書(shū)。
9. 權(quán)利要求8的熒光標(biāo)記細(xì)胞核的試劑盒，其中的有機(jī)熒光染料 是DAPI或PI。
全文摘要
本發(fā)明涉及穩(wěn)定熒光標(biāo)記細(xì)胞核的方法和試劑盒，具體而言，本發(fā)明提供了聯(lián)合使用半導(dǎo)體納米材料量子點(diǎn)和有機(jī)熒光染料DAPI或PI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行熒光標(biāo)記的方法，及含有上述量子點(diǎn)和DAPI或PI的用于細(xì)胞核穩(wěn)定熒光標(biāo)記的試劑盒，通過(guò)本發(fā)明的方法和試劑盒可簡(jiǎn)便易行、高效穩(wěn)定地對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行熒光標(biāo)記，為細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)間觀察研究提供了細(xì)胞核穩(wěn)定示蹤的實(shí)驗(yàn)方法，所述方法和試劑盒可以用于細(xì)胞或組織等的長(zhǎng)期示蹤。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101531993SQ20081008460
公開(kāi)日2009年9月16日 申請(qǐng)日期2008年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月12日
發(fā)明者喬媛媛, 平 何, 王強(qiáng)斌, 董喬梅, 楊 許, 趙曉航, 顥 顏 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所;中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院