專利名稱：：一種血管內皮抑制素生物活性的檢測方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物制品活性檢測
技術領域：
，具體涉及血管內皮抑制素生物活性的檢測方法。
背景技術：
：血管生成抑制劑種類很多，其中針對血管內皮細胞增殖的血管生成抑制劑是重要的一類，它們以血管抑素(angiostatin)、血管內皮抑制素(endostatin)等為代表。血管內皮抑制素是膠原XV1I1羧基端的一段分子量大小為20kDa的酶切產(chǎn)物，具有抑制血管內皮細胞增殖、遷移和體內血管生成的活性，是目前已知最強的內源性血管形成抑制因子。目前血管內皮抑制素(endostatin)主要是利用DNA重組工程技術制備重組血管內皮抑制素，以原核或真核表達系統(tǒng)，將血管內皮抑制素基因經(jīng)克隆、表達和純化得到具有細胞增殖抑制活性形式的重組蛋白質?，F(xiàn)有技術中4全測endostatin的細胞增殖抑制活性的方法主要是才艮據(jù)endostatin可能的作用機制,采用endostatin抑制HUVEC、HDVEC、HMEC、ECV304等不同細^^增殖、遷移來檢測其細^^增殖抑制活性，^旦所選擇實驗材料及檢測結果差異非常大，其中很多檢測結果重復性差。另夕卜，從中國生物制品檢定所了解到，國內也有廠家采用endostatin抑制小鼠腫瘤生長來評價其生物學活性，但由于小鼠腫瘤大小差異非常大，因此體內測活方法缺少規(guī)律性，具有誤差大、重復性差且操作難度較大等缺點。以HMEC細胞遷移抑制法為例，重組人血管內皮抑制素(rhEndostatin)細胞增殖抑制活性檢測存在以下缺點(1)在實驗中沒有采用活性標準品進行誤差的校正，另外實驗中影響因素較多，造成實驗誤差較大，重復性差；(2)由于實驗中采用在顯微鏡下人工計數(shù)染色的遷移細胞的方法，所以在選擇計數(shù)的一見野，以及細胞的判定上受人為影響因素較大；(3)實驗結果的計算方法存在不科學的地方；(4)在規(guī)程附錄中提供的方法存在描述不清，并且多處與實際才喿作不一致的缺點。由于存在上述缺陷，HMEC細胞遷移抑制法在評價endostatin的生物學活性時不夠客觀，具有誤差大和重復性差的缺點。鑒于上述方法存在上述缺點，endostatin的細胞增殖抑制活性難以被統(tǒng)一地進行客觀評價，不能滿足生產(chǎn)大規(guī)模、多批次產(chǎn)品質量控制的需要，所以客觀上需要提供一種具有特異性強和重復性好的血管內皮抑制素活性;險測方法。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種新的檢測血管內皮抑制素(endostatin)細胞增殖抑制活性的方法，該檢測方法特異性強，重復性好，能客觀評價血管內皮抑制素的血管生成抑制的生物學活性。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，發(fā)明人經(jīng)過反復大量試驗，引進了血管內皮抑制素標準品用以校正不同批次血管內皮抑制素樣品的檢測誤差，利用血管內皮抑制素對人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)的增殖抑制作用，用微量酶反應比色法反映活細胞數(shù)量，客觀評價血管內皮抑制素的抑制或殺死HUVEC的效果，得到了一種特異性強、重復性好的4企測血管內皮抑制素細胞增殖抑制活性的新方法。為了實現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明的技術方案如下一種血管內皮抑制素生物活性的檢測方法，包括如下步驟a、人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC傳代培養(yǎng)至對數(shù)生長期，胰酶消化后均勻懸浮，向培養(yǎng)孔中接種相同體積的細胞懸液；b、將血管內皮抑制素標準品和待測樣品在步驟a所述的培養(yǎng)孔中分別進行相同濃度梯度的倍比稀釋，培養(yǎng)孔中細胞懸液繼續(xù)細胞培養(yǎng)；c、微量酶反應比色法測定培養(yǎng)孔中的0D值；d、將血管內皮抑制素標準品和待測樣品的倍比稀釋濃度分別與對應的0D值采用四參數(shù)origin擬合，分別得到血管內皮抑制素標準品和待測樣品抑制型S-形曲線，所述四參數(shù)為最大光吸收值、最小光吸收值、半效量濃度和斜率；e、按下式計算試驗結果樣品生物學活性(U/ml)=PrxDsxEs/(DrxEr),其中，Pr為標準品生物學活性；Ds為樣品稀釋倍數(shù)；Dr為標準品稀釋倍數(shù)；Es為樣品相當于標準品半效量的稀釋倍數(shù)；Er為標準品半效量的稀釋倍數(shù)。其中，所述培養(yǎng)具體為在37。C,5%0)2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其中，步驟a中所述人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC傳代培養(yǎng)至對數(shù)生長期，具體為人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC傳代至第2-6代，并培養(yǎng)至對數(shù)生長期。其中，步驟b中所述培養(yǎng)孔中細胞懸液繼續(xù)細胞培養(yǎng)，具體為培養(yǎng)孔中細胞懸液繼續(xù)細胞培養(yǎng)3-5天。其中，步驟a中所述向培養(yǎng)孔中接種相同體積的細胞懸液，具體為向培養(yǎng)孔中接種160-180ja1細胞密度為750-5000個/ml的細胞懸液。其中，步驟b中所述相同濃度梯度的倍比稀釋，具體為按終濃度為1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8ng/ml進4亍稀釋。其中，所述步驟d中所述^t量酶反應比色法測定培養(yǎng)孔中的OD值具體為采用MTT法或MTS法測定培養(yǎng)孔中的OD值，可使用酶聯(lián)免疫檢測儀測定培養(yǎng)孔中細胞OD值，檢測OD值的波長為490nm或570nm。其中，所述血管內皮抑制素標準品采用重組人血管內皮抑制素凍干制劑，該凍干制劑為山東先聲麥得津生物制藥有限公司生產(chǎn)，詳見實施例1。其中，所述血管內皮抑制素生物活性為細胞增殖抑制活性。本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明的血管內皮抑制素生物活性的檢測方法是分別利用相同濃度梯度的倍比稀釋后的血管內皮抑制素標準品和樣品抑制HUVEC細胞增殖，并采用微量酶反應比色法測定血管內皮抑制素對HUVEC細胞的增殖抑制活性，進而分析血管內皮抑制素對血管生成抑制的生物活性。本方法引進了血管內皮抑制素標準品用以校正不同批次血管內皮抑制素樣品的檢測誤差，使得血管內皮抑制素的細胞增殖抑制活性檢測結果具有特異性和重復性，能客觀反映并評價血管內皮抑制素的血管生成抑制的生物學活性，克服了現(xiàn)有血管內皮抑制素活性檢測方法的重復性差、方法難統(tǒng)一以及不能滿足生產(chǎn)大規(guī)模、多批次產(chǎn)品質量控制的缺陷。本方法能夠使得不同批次產(chǎn)品，甚至不同來源的血管內皮抑制素都具有生物學活性的可比性，該方法操作簡便，可控性好。本方法采用微量酶反應比色法檢測光吸收值0D，結果客觀，量效關系明顯，實驗誤差可以控制在相對標準差(RSD)在45.0%以內，檢測時受人為影響因素很少。本方法采用山東先聲麥得津生物制藥有限^^司生產(chǎn)的重組人血管內皮抑制素凍干制劑作為標準品，其制劑穩(wěn)定，生物活性能夠長期保持穩(wěn)定。本方法采用接種HUVEC第2-6代細胞，細胞穩(wěn)定，；險測結果更加穩(wěn)定可靠。圖1為實施例2中重組人血管內皮抑制素凍干標準品抑制第5代HUVEC生長的抑制型S-形曲線。圖2為實施例2中重組人血管內皮抑制素待檢樣品抑制第5代HUVEC生長的抑制型S-形曲線。具體實施方式下面結合實施例具體說明本發(fā)明。如無特殊說明，下文中所涉及的實驗用材料均可通過商業(yè)途徑獲得或按照常規(guī)方法制備。在下文的實施例中所使用的重組人血管內皮抑制素的氨基酸序列同中國發(fā)明專利(專利公開號為CN1324818A)公開的SEQIDNO:2，其表達與純化的方法也相同，具體見上述^Hf文獻的制備實施例。本方法引進了血管內皮抑制素標準品用以4交正不同批次血管內皮抑制素樣品的檢測誤差，并采用微量酶反應比色法測定血管內皮抑制素對HUVEC細胞的增殖抑制活性，進而分析血管內皮抑制素對血管生成抑制的生物活性。其中微量酶反應比色法可以是四曱基偶氮唑鹽法(MTT法)或MTS法。MTT法的原理是活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的噻唑蘭還原為難溶于水的藍紫色Formazan結晶并沉積在細胞中，結晶物被二曱基亞砜溶解，用酶聯(lián)免疫檢測4義在490nm(或570nm)處測定光吸收值，可以反映活細胞數(shù)量和細胞代謝活性。MTS法與MTT法原理相同。MTS是一種新合成的四唑類化合物，能被活細胞線粒體中的多種脫氫酶還原成各自有色的曱纘結晶。與MTT法比較，MTS比色法產(chǎn)物顏色更深，光吸收值范圍更寬，測量值更準確；產(chǎn)物為水溶性，不需要促溶；產(chǎn)物穩(wěn)定，室溫存放18h后光吸收值無明顯改變。MTS法更加敏感準確，快速安全。實施例1重組人血管內皮抑制素標準品的制備使用30mMpH5.5±0.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖體系對純化后的重組人血管內皮抑制素蛋白溶液進行超濾透析，配制成90.9ml濃度為9.9mg/ml的重組人血管內皮抑制素溶液，加入20%甘露醇60ml,補加1.5MpH5.5左右的醋酸一醋酸鈉纟差沖液4.20ml,加入注射水至300ml。經(jīng)0.22jum微孔濾膜除菌過濾，分裝于西林瓶中，液面高度距離瓶底l-1.5cm高，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內，制品溫度下降至-40°C，保持3-4小時，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-2(TC，保持8小時，繼續(xù)加熱升高溫度至25。C，保持6小時，至真空度變化不大時，真空壓塞后取出，軋蓋。制劑規(guī)格重組人血管內皮抑制素10mg/支。實施例2樣品;險測2.1^檢測步驟2.1.1細胞培養(yǎng)HUVEC細胞購自Sciencell公司，相應培養(yǎng)基也購自該公司。按照說明書向ECM培養(yǎng)基中添加FBS(中文名稱胎牛血清)、ECGS(提取自牛腦垂體的包含多種促內皮細胞生長的因子的混合物)、P/0Solution(青霉素和鏈霉素混合液)，于37°C，5%002的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HUVEC細胞并傳代至第5代，待細胞狀態(tài)良好并進入對數(shù)生長期后準備接種。2.1.2接種細胞用0.25%胰酶消化，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用培養(yǎng)基重新混懸，顯微鏡下用血細胞計數(shù)板計數(shù)活細胞。調細胞密度為5000個/ml，每孔加入160jul細月包懸液。2.1.3加藥將重組人血管內皮抑制素標準品(10mg/支)加注射水充分溶解，然后用2ml緩沖液(30mMNaAc、4%甘露醇)預稀釋至5mg/ml,將重組人血管內皮抑制素待檢樣品直接用上述緩沖液預稀釋至5mg/ml，按培養(yǎng)孔中重組人血管內皮抑制素終濃度為1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8jjg/ml，向每個有細胞懸液的培養(yǎng)孔中加入40ja1藥物體積，每個藥物濃度做2個平4亍孔，然后，在37°C5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96hr。2.1.4檢測加入5mg/mlMTT工作液，每孑L20]u1,置37°C5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4hr,用耳又樣器輕輕吸去細月包上清后，每孔加入DMSO200inl。放置5min,使用酶標儀490nm波長下測定OD值?；蛘?，使用MTS代替MTT進行枱r測-20。C保存的MTS在室溫下融化，每孔加入20plMTS,培養(yǎng)4hr，直接;險測OD值。檢測結果如下表所示表1重組人血管內皮抑制素標準品和待枱r樣品的活性MTT檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>Al:最大光吸收值，A2:最小光吸收值，x。(或EC5。)半效量濃度，P斜率2.2結果分析按照2005年中國藥典(第三部)，試驗數(shù)據(jù)采用origin軟件四參數(shù)回歸計算法進行處理。并按下式計算試驗結果樣品生物學活性(U/ml)-PrxDsxEs/(DrxEr)Pr為標準品生物學活性，U/ml;Ds為樣品稀釋倍數(shù)；Dr為標準品稀釋倍數(shù)；Es為樣品相當于標準品半效量的稀釋倍數(shù)；Er為標準品半效量的稀釋倍數(shù)。比活性=樣品生物學活性/樣品濃度在本實施方案中，標準品標識生物學活性Pr為160000U/10mg/支，加注射水2ml溶解為5mg/ml，即為80000U/ml，按倍比3希釋的最高濃度1000ug/ml計Ds為5倍，Dr為5倍，Es為樣品的l/x。，Er為標準品的1/x。，待測樣品濃度為5mg/ml。因此可進行如下計算U/ml)=80000x5x(1/90.88)/〔5x(1/101.25)〕=89128.5U/ml待測樣品比活性=89128.5/5=17825.7U/mg根據(jù)表1檢測結果，將梯度稀釋濃度與對應的0D值采用四參數(shù)origin擬合，得到圖l和圖2所示的重組人血管內皮抑制素標準品和樣品的抑制型S-形曲線。所述四參數(shù)為最大光吸收值Al、最小光吸收值A2、半效量濃度ECs。或X。和斜率P。圖1中用origin擬合四參數(shù)的結果為Al:0.26696、A2:0.09745、X0:101.2527、p:2.25982。圖2中用origin擬合四參數(shù)的結果為:Al:0.27856、A2:0.06372、X0:90.88479、p:1.39611。根據(jù)圖1可以看出，重組人血管內皮抑制素標準品抑制HUVEC第5代增殖作用最低有效濃度62.5ug/ml或以上。本方法可以方便的檢測不同批次的重組人血管內皮抑制素的細胞增殖抑制活性，使不同批次甚至不同來源的血管內皮抑制素都具有生物學活性的可比性，能反應出每批生物學活性的高低(如下表2)。采用上述方法;險測加熱失活處理后的^"品，如將樣品在沸水進行加熱0.5小時，檢測不出其生物學活性。表2不同批次重組人血管內皮抑制素樣品檢測結果比活性活性原'液4比號(U/mg)成品糸匕號(U/ml)119606.4174271.8219017.8299800.4320349.03121964416161.6497725.1517552.2584041.7616494.8699992.6實施例3檢測方法的重復性評價檢測方法的重復性評價采用批內重復性和批間重復性進行評價。批內重復性是指一個樣品在同一天同一塊96孔板平行試驗5次結果；批間重復性是指一個樣品在不同天試驗5次結果。結果顯示，重組人血管內皮抑制素樣品半效量濃度(EC5。)的批內相對標準差(RSD)為37.8%(見表3),重組人血管內皮抑制素半效量濃度(EC5)的批間相對標準差(RSD)為45.0%(見表4)。批內和批間重組人血管內皮抑制素樣品重復性4交好，誤差控制在45.0%以下。表3重組人血管內皮抑制素樣品生物活性批內重復性4全測批內重復實-瞼OD值C(ug/ml)12345平均ODSDRSD腦00.060.0680扁50.0690.0720.0670.0057.45000.0530.0580.05550.060.0630.0580.0046.92500.06550.06550.06650.07150.08050扁0扁8.61250.09550.09550.1020.0980.0950.0970.0033.162.50.1220.1150.1230.10450.1050.1140.0097.932.250.1240.130.13050.13150.1220.1280.0043.115.6250.1290.13950.1280.1460.1360.1360.0075.17.80.16850.190.17650.19150.2160.1890.0189.5Al0.127050.138410.128490.160880.151150.1410.01510.6A20.056350.060720.059190.060410.062940.0600.0023.3EC50(ug/ml)134.054399.71971140.9690961.4116262.9699399.82537.74437.8P3.247662.144573.697691.271191.094332.2911.16150.7表注Al:最大光吸收值，A2:最小光吸收值，EC5。(或x。)半效量濃度，P斜率。表4重組人血管內皮抑制素樣品生物活性批間重復性檢測<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表注Al:最大光吸收值，A2:最小光吸收值，EC5。(或x。)半效量濃度，P斜率。權利要求1、一種血管內皮抑制素生物活性的檢測方法，包括如下步驟a、人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC傳代培養(yǎng)至對數(shù)生長期，胰酶消化后均勻懸浮，向培養(yǎng)孔中接種相同體積的細胞懸液；b、將血管內皮抑制素標準品和待測樣品在步驟a所述的培養(yǎng)孔中分別進行相同濃度梯度的倍比稀釋，培養(yǎng)孔中細胞懸液繼續(xù)細胞培養(yǎng)；c、微量酶反應比色法測定培養(yǎng)孔中的OD值；d、將血管內皮抑制素標準品和待測樣品的倍比稀釋濃度分別與對應的OD值采用四參數(shù)origin擬合，分別得到血管內皮抑制素標準品和待測樣品抑制型S-形曲線，所述四參數(shù)為最大光吸收值、最小光吸收值、半效量濃度和斜率；e、按下式計算試驗結果樣品生物學活性(U/ml)＝Pr×Ds×Es/(Dr×Er)，其中，Pr為標準品生物學活性；Ds為樣品稀釋倍數(shù)；Dr為標準品稀釋倍數(shù)；Es為樣品相當于標準品半效量的稀釋倍數(shù)；Er為標準品半效量的稀釋倍數(shù)。2、權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述培養(yǎng)具體為在37。C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3、權利要求1所述的4企測方法，其特征在于步驟a中所述人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC傳代培養(yǎng)至對數(shù)生長期，具體為人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC傳代至第2-6代，并培養(yǎng)至對數(shù)生長期。4、權利要求1所述的^r測方法，其特征在于步驟b中所述培養(yǎng)孔中細胞懸液繼續(xù)細胞培養(yǎng)，具體為培養(yǎng)孔中細胞懸液繼續(xù)細胞培養(yǎng)3-5天。5、權利要求1所述的檢測方法，其特征在于步驟a中所述向培養(yǎng)孔中接種相同體積的細胞懸液，具體為向培養(yǎng)孔中接種160-180p1細胞密度為750-5000個/ml的細胞懸液。6、權利要求1所述的檢測方法，其特征在于步驟b中所述相同濃度梯度的倍比稀釋，具體為按終濃度為1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8jag/ml進行稀釋。7、權利要求1所述的檢測方法，其特征在于步驟c中所述微量酶反應比色法測定培養(yǎng)孔中的0D值，具體為采用MTT法或MTS法測定培養(yǎng)孔中的細胞0D值。8、權利要求7所述的檢測方法，其特征在于所述測定培養(yǎng)孔中的細胞OD值，具體為49Onm或57Onm波長測定培養(yǎng)孔中的細胞OD值。9、權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述血管內皮抑制素標準品采用重組人血管內皮抑制素凍干制劑。10、權利要求1所述的4全測方法，其特征在于所述生物活性為細胞增殖抑制活性。全文摘要本發(fā)明公開了一種血管內皮抑制素生物活性的檢測方法，該方法分別利用相同濃度梯度的倍比稀釋后的血管內皮抑制素標準品和樣品抑制HUVEC細胞增殖，并采用微量酶反應比色法測定血管內皮抑制素對HUVEC細胞的增殖抑制活性，進而分析血管內皮抑制素對血管生成抑制的生物活性。該方法采用血管內皮抑制素標準品校正不同批次血管內皮抑制素樣品的檢測誤差，使得血管內皮抑制素的細胞增殖抑制活性檢測結果具有特異性和重復性，克服了現(xiàn)有血管內皮抑制素活性檢測方法的重復性差、方法難統(tǒng)一以及不能滿足大規(guī)模生產(chǎn)、多批次產(chǎn)品質量控制的缺陷。文檔編號G01N21/25GK101256139SQ200810087590公開日2008年9月3日申請日期2008年4月18日優(yōu)先權日2008年4月18日發(fā)明者武劉,靜姜,王鴻梅,陳倩潔申請人:山東先聲麥得津生物制藥有限公司