專利名稱：一種治療腫瘤的藥物組合物的質(zhì)量控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物組合物的質(zhì)量控制方法，特別涉及一種治療腫瘤的藥物組合物的質(zhì)量控制方法。

背景技術(shù)：
中藥質(zhì)量控制是現(xiàn)代化進(jìn)程中亟待解決的關(guān)鍵問題之一。申請?zhí)枮?2153335.0的發(fā)明專利公開了一種治療腫瘤的藥物組合物及其制備方法，該藥物組合物是由如下原料藥制成的黃芪200-400重量份；人參60-130重量份；苦參素6-13重量份。本發(fā)明藥物組合物具有益氣扶正，增強肌體免疫功能，適用于原發(fā)性肝癌、肺癌、直腸癌、惡性淋巴瘤、婦科惡性腫瘤；各種原因引起的白細(xì)胞低下及減少癥，慢性乙型肝炎的治療。申請?zhí)枮?00510090766.4的發(fā)明專利公開了其質(zhì)量控制方法中的成品和中間體的指紋圖譜研究，但其中并沒有涉及其原料藥材人參、黃芪指紋圖譜、人參鑒別、黃芪含量測定，因此有必要進(jìn)一步提高該藥物組合物的質(zhì)量控制方法。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種治療腫瘤的藥物組合物的質(zhì)量控制方法。
本發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn) 本發(fā)明藥物組合物是由如下原料制成的 黃芪200-400重量份、人參60-130重量份、苦參素6-13重量份； 優(yōu)選黃芪250重量份、人參120重量份、苦參素8重量份；黃芪350重量份、人參70重量份、苦參素12重量份；或黃芪300重量份、人參100重量份、苦參素10重量份。本發(fā)明所述的藥物組合物是按照常規(guī)方法加入常規(guī)輔料制成的片劑、膠囊劑、散劑、軟膠囊劑、滴丸、蜜丸、丸劑、顆粒劑、蜜煉膏劑、緩釋制劑、速釋制劑、控釋制劑、口服液體制劑或注射制劑。
本發(fā)明藥物組合物中間體的制備方法 稱取以上三味原料藥，人參用70-80％的乙醇，回流提取2～3次，每次1～3小時，合并提取液，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.20的清膏，測定溫度為65℃，備用；黃芪加水煎煮2～3次，每次1～3小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.20的清膏，測定溫度為65℃，與人參清膏合并，加乙醇使含醇量達(dá)60～80％，用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，靜置，去上清液，回收乙醇，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.15的清膏，測定溫度為65℃；再加乙醇使含醇量達(dá)70～90％，用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，靜置，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，加注射用水到400體積份(按ml/g的比例)，用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，加活性炭適量，攪勻，煮沸15分鐘，濾過，濾液備用；另取苦參素溶解，用稀鹽酸調(diào)PH值至6～7，100℃滅菌30分鐘，冷藏，抽濾，與脫炭后的藥液合并，混勻，即得中間體。
本發(fā)明藥物組合物的制備方法為 稱取以上三味原料藥，人參用70-80％的乙醇，回流提取2～3次，每次1～3小時，合并提取液，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.20的清膏，測定溫度為65℃，備用；黃芪加水煎煮2～3次，每次1～3小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.20的清膏，測定溫度為65℃，與人參清膏合并，加乙醇使含醇量達(dá)60～80％，用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，靜置12小時，取上清液，回收乙醇，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.15的清膏，測定溫度為65℃；再加乙醇使含醇量達(dá)70～90％，用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，靜置12小時，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，加注射用水到400體積份(按ml/g的比例)，用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，100℃滅菌30分鐘，冷藏，抽濾；用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，加活性炭適量，攪勻，煮沸15分鐘，濾過，濾液備用；另取苦參素溶解，用稀鹽酸調(diào)PH值至6～7，100℃滅菌30分鐘，冷藏，抽濾，與脫炭后的藥液合并，混勻，加注射用水至1000體積份(按ml/g的比例)，濾過，灌裝，即得。
本發(fā)明藥物組合物優(yōu)選如下方法制備 稱取以上三味原料藥，人參用75％的乙醇，回流提取3次，每次2小時，合并提取液，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.20的清膏，測定溫度為65℃，備用；黃芪加水煎煮2次，每次2小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.20的清膏，測定溫度為65℃，與人參清膏合并，加乙醇使含醇量達(dá)75％，用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，靜置12小時，取上清液，回收乙醇，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.15的清膏，測定溫度為65℃；再加乙醇使含醇量達(dá)85％，用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，靜置，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，加注射用水到400體積份(按ml/g的比例)，用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，100℃滅菌30分鐘，冷藏，抽濾。用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，加活性炭適量，攪勻，煮沸15分鐘，濾過，濾液備用；另取苦參素溶解，用稀鹽酸調(diào)PH值至6～7，100℃滅菌30分鐘，冷藏，抽濾，與脫炭后的藥液合并，混勻，加注射用水至1000體積份(按ml/g的比例)，濾過，灌裝，即得。
本發(fā)明藥物組合物的質(zhì)量控制方法含有如下鑒別、含量測定和/或指紋圖譜檢測方法中的一種或幾種 鑒別取本發(fā)明藥物組合物制劑10～30體積份，于水浴上蒸干，殘渣加甲醇3～8體積份使溶解，作為供試品溶液；另取人參對照藥材0.5～1.5重量份，加三氯甲烷30～50體積份，加熱回流1小時，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，加水0.3～0.8體積份攪拌濕潤，加水飽和正丁醇5～15體積份，超聲處理20～40分鐘，吸取上清液加1～5倍量氨試液，搖勻，放置分層，取上清液蒸干，殘渣加甲醇0.5～1.5體積份使溶解，作為對照藥材溶液；再取人參皂苷Re、Rg1對照品，分別加甲醇制成每1體積份含0.001～0.003重量份的對照品溶液；照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VIB)試驗，吸取上述四種溶液各0.0015～0.0025體積份，分別點于厚500μm同一硅膠重量份薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水＝10～20∶30～50∶17～27∶5～15在10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，涼干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點； 含量測定 A人參 照高效液相色譜法(《中國藥典2005年版一部》附錄VID)測定； 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水＝15～25∶75～85為流動相；檢測波長為203nm；理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計算應(yīng)不低于3000；對照品溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品，加甲醇制成每1體積份各含0.0002～0.0003重量份的混合溶液，搖勻，即得；供試品溶液的制備量取裝量差異項下的本發(fā)明藥物組合物制劑20～30體積份，置分液漏斗中，用三氯甲烷提取1～3次，每次10～30體積份，棄去三氯甲烷液，水液用水飽和正丁醇提取4～6次，每次10～30體積份，合并正丁醇液，用1％NaOH溶液洗滌2～4次，每次20～40體積份，棄去堿液，再用正丁醇飽和的水輕輕搖洗2～4次，每次20～40體積份，棄去水液，取正丁醇液蒸干；殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；測定法分別吸取對照品溶液與供試品溶液各0.005～0.0015體積份，注入液相色譜儀，測定，即得；本發(fā)明藥物組合物制劑按日用劑量計含人參皂苷Rg1(C42H72O14)和人參皂苷Re(C48H82O18)的總量不得少于0.00004重量份； B苦參素 照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VID)測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；1％磷酸溶液-乙腈＝90～95∶5～10，其中磷酸溶液用三乙胺調(diào)節(jié)PH值為2.5為流動相，檢測波長為220nm；理論板數(shù)按氧化苦參堿峰計算應(yīng)不低于2000，氧化苦參堿峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求；對照品溶液的制備精密稱取氧化苦參堿對照品適量，加流動相制成每1體積份中含0.0002～0.0003重量份的溶液，即得；供試品溶液制備量取本發(fā)明藥物組合物制劑2.0～3.0體積份，置100體積份量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得；測定法量取對照品溶液及供試品溶液各0.01～0.03體積份，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算；本發(fā)明藥物組合物制劑按日服用劑量計含苦參素以氧化苦參堿(C15H24N2O2)計，應(yīng)為0.009重量份～0.011重量份； C黃芪 照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VID)測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水＝30～35∶65～70為流動相；蒸發(fā)光散射檢測器；理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計算應(yīng)不低于4000；對照品溶液的制備精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1體積份含0.0001～0.0003重量份的溶液，即得；供試品溶液的制備取本發(fā)明藥物組合物制劑80～120體積份，混勻，量取5～15體積份，于水浴上蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至5體積份量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得；測定法吸取對照品溶液0.005～0.015體積份、0.01～0.03體積份及供試品溶液0.01～0.03體積份，注入液相色譜儀，測定，即得；本發(fā)明藥物組合物制劑按日服用劑量計含黃芪以黃芪甲苷(C41H68O14)計，不得少于0.00004重量份。
指紋圖譜檢測 A本發(fā)明藥物組合物制劑成品指紋圖譜檢測方法包括如下步驟 照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VID) 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A，以80％乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0～5min 25％B，5～20min25％～39％B.20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min85％～25％B；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1體積份/min；參照物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品0.002～0.004重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得；供試品溶液的制備取本發(fā)明藥物組合物制劑作為供試品溶液；測定法取參照物溶液和供試品溶液各0.01～0.03體積份，注入高效液相色譜儀，記錄65min色譜；供試品指紋圖譜中與參照物人參皂苷Rg1相應(yīng)的峰為S峰，計算各共有峰相對保留時間；供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜(附圖1)有良好的相似性； 指紋圖譜應(yīng)有12個共有峰； 各序號特征峰的相對保留時間按分鐘計分別為1號峰為0.830、S峰為1.000、2號峰為1.100、3號峰為1.221、4號峰為1.294、5號峰為1.630、6號峰為1.738、7號峰為1.811、8號峰為1.848、9號峰為1.887、10號峰為2.015、11號峰為2.808； 各序號特征峰的峰面積比值分別為1號峰為0.105、S峰為1.000、2號峰為0.296、3號峰為2.244、4號峰為0.495、5號峰為0.131、6號峰為0.052、7號峰為0.031、8號峰為0.050、9號峰為0.055、10號峰為0.044、11號峰為0.019； 非共有峰面積不得過總峰面積的5％。
B本發(fā)明藥物組合物制劑中間體指紋圖譜檢測方法包括如下步驟 指紋圖譜照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VD)，結(jié)合指紋圖譜的要求進(jìn)行測定；色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A、80％乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0～5min 25％B\，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1體積份/min；參照物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品0.002～0.004重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得；供試品溶液的制備取1～3體積份中間體，用水稀釋至8～12體積份，作為供試品溶液；HPLC分析前用0.45μm水系濾膜過濾；測定法取參照物溶液和供試品溶液各0.01～0.03體積份，注入高效液相色譜儀，記錄65min色譜，以人參皂苷Rg1峰為參考峰(S)，計算各共有峰的相對保留時間；供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜(附圖2)有良好的相似性； 指紋圖譜應(yīng)有19個共有峰； 各序號特征峰的相對保留時間按分鐘計分別為1號峰為0.827、S峰為1.000、2號峰為1.100、3號峰為1.222、4號峰為1.296、5號峰為1.636、6號峰為1.744、7號峰為1.817、8號峰為1.855、9號峰為1.895、10號峰為2.024、11號峰為2.137、12號峰為2.375、13號峰為2.694、14號峰為2.837、15號峰為2.987、16號峰為3.382、17號峰為3.542、18號峰為3.643； 各序號特征峰的峰面積比值分別為1號峰為0.129、S峰為1.000、2號峰為0.209、3號峰為1.636、4號峰為0.542、5號峰為0.183、6號峰為0.158、7號峰為0.133、8號峰為0.099、9號峰為0.102、10號峰為0.050、11號峰為0.171、12號峰為0.185、13號峰為0.070、14號峰為0.059、15號峰為0.050、16號峰為0.060、17號峰為0.143、18號峰為0.063； 非共有峰面積不得過總峰面積的5％。
C人參藥材指紋圖譜檢測標(biāo)準(zhǔn) 指紋圖譜照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VD)；色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A，以80％乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1體積份/min；參照物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品0.002～0.004重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得；供試品溶液的制備藥材經(jīng)粉碎后過3號篩，取各批藥材粉末4～6重量份，精密稱定，置于250ml圓底燒瓶中，加40～60體積份75％乙醇，加熱回流30min，離心，取提取液，如此3～5次，合并提取液，旋蒸至干，用40～60體積份40％甲醇溶液溶解，離心，精密量取上清液1～3體積份，用40％甲醇溶液稀釋至8～12體積份，作為供試品溶液；HPLC分析前用0.45μm的有機系濾膜過濾；測定法取參照物溶液和供試品溶液各0.001～0.003體積份，注入高效液相色譜儀，記錄65min色譜；供試品指紋圖譜中與參照物相應(yīng)的峰為S峰，計算各共有峰相對保留時間；供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜(附圖3)有良好的相似性； 指紋圖譜應(yīng)有15個共有峰； 各序號特征峰的相對保留時間按分鐘計分別為1號峰為0.731、2號峰為0.824、S峰為1.000、3號峰為1.649、4號峰為1.699、5號峰為1.739、6號峰為1.828、7號峰為1.870、8號峰為1.925、9號峰為1.951、10號峰為2.000、11號峰為2.151、12號峰為3.031、13號峰為3.605、14號峰為3.875； 各序號特征峰的峰面積比值分別為1號峰為0.048、2號峰為0.108、S峰為1.000、3號峰為0.213、4號峰為0.078、5號峰為0.621、6號峰為0.409、7號峰為0.046、8號峰為0.243、9號峰為0.039、10號峰為0.027、11號峰為0.157、12號峰為0.027、13號峰為0.099、14號峰為0.257； 非共有峰面積不得過總峰面積的5％。
D黃芪藥材指紋圖譜檢測標(biāo)準(zhǔn) 指紋圖譜照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VD)；色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A，以80％乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1體積份/min；內(nèi)標(biāo)物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品0.002～0.004重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得；供試品溶液的制備黃芪切片經(jīng)粉碎后過3號篩，取黃芪粉末4～6重量份，加水40～60體積份，回流提取2～4小時，離心，取提取液，如此1～3次，合并提取液，濃縮至20～40體積份，加乙醇至含醇量為75％，4℃放置過夜，離心，上清液用75％乙醇定容至200～300體積份，取4～6體積份，加入0.4～0.6體積份內(nèi)標(biāo)物溶液，作為供試品溶液；HPLC分析前用0.45μm有機系濾膜過濾；測定法取內(nèi)標(biāo)物溶液和供試品溶液各0.01～0.03體積份，注入高效液相色譜儀，記錄65min色譜，分別以內(nèi)標(biāo)物人參皂苷Rg1峰(S1)和相對S1峰保留時間約為1.25的色譜峰為參考峰(S)，計算各共有峰的相對保留時間；供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜(附圖4)有良好的相似性；指紋圖譜應(yīng)有12個共有峰； 各序號特征峰的相對保留時間(1)按分鐘計分別為S1號峰為1.000、1號峰為1.063、S峰為1.226、2號峰為1.344、3號峰為1.777、4號峰為2.157、5號峰為2.247、6號峰為2.292、7號峰為2.382、8號峰為3.085、9號峰為3.540、10號峰為3.603；各序號特征峰的相對保留時間(2)按分鐘計分別為S1號峰為0.816、1號峰為0.867、S峰為1.000、2號峰為1.096、3號峰為1.449、4號峰為1.760、5號峰為1.833、6號峰為1.870、7號峰為1.943、8號峰為2.516、9號峰為2.888、10號峰為2.939；各序號特征峰的峰面積比值分別為1號峰為0.385、S峰為1.000、2號峰為1.975、3號峰為0.090、4號峰為0.402、5號峰為0.049、6號峰為0.693、7號峰為1.064、8號峰為0.155、9號峰為0.043、10號峰為0.054； 非共有峰面積不得過總峰面積的10％。
本發(fā)明藥物組合物的質(zhì)量控制方法優(yōu)選如下鑒別、含量測定和/或指紋圖譜檢測方法中的一種或幾種 鑒別 取本發(fā)明藥物組合物制劑20體積份，于水浴上蒸干，殘渣加甲醇5體積份使溶解，作為供試品溶液；另取人參對照藥材1重量份，加三氯甲烷40體積份，加熱回流1小時，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，加水0.5體積份攪拌濕潤，加水飽和正丁醇10體積份，超聲處理30分鐘，吸取上清液加3倍量氨試液，搖勻，放置分層，取上清液蒸干，殘渣加甲醇1體積份使溶解，作為對照藥材溶液；再取人參皂苷Re、Rg1對照品，分別加甲醇制成每1體積份含0.002重量份的對照品溶液；照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VIB)試驗，吸取上述四種溶液各0.0018體積份，分別點于厚500μm同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水＝15∶40∶22∶10在10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，涼干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點； 含量測定 A人參照高效液相色譜法(《中國藥典2005年版一部》附錄VID)測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水＝19∶81為流動相；檢測波長為203nm；理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計算應(yīng)不低于3000；對照品溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品，加甲醇制成每1體積份各含0.00025重量份的混合溶液，搖勻，即得；供試品溶液的制備量取裝量差異項下的本發(fā)明藥物組合物制劑25體積份，置分液漏斗中，用三氯甲烷提取2次，每次20體積份，棄去三氯甲烷液，水液用水飽和正丁醇提取5次，每次20體積份，合并正丁醇液，用1％NaOH溶液洗滌3次，每次30體積份，棄去堿液，再用正丁醇飽和的水輕輕搖洗3次，每次30體積份，棄去水液，取正丁醇液蒸干；殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；測定法分別吸取對照品溶液與供試品溶液各0.01體積份，注入液相色譜儀，測定，即得；本發(fā)明藥物組合物制劑按日服用劑量計含人參皂苷Rg1(C42H72O14)和人參皂苷Re(C48H82O18)的總量不得少于0.00004重量份； B苦參素照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VID)測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；1％磷酸溶液-乙腈＝93∶7為流動相，其中磷酸溶液用三乙胺調(diào)節(jié)PH值為2.5，檢測波長為220nm；理論板數(shù)按氧化苦參堿峰計算應(yīng)不低于2000，氧化苦參堿峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求； 對照品溶液的制備稱取氧化苦參堿對照品適量，加流動相制成每1體積份中含0.00025重量份的溶液，即得；供試品溶液制備量取本發(fā)明藥物組合物制劑按日服用劑量計2.5體積份，置100ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得；測定法量取對照品溶液及供試品溶液各0.020體積份，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算；本發(fā)明藥物組合物制劑按日服用劑量計含苦參素以氧化苦參堿(C15H24N2O2)計，應(yīng)為0.009重量份～0.011重量份； C黃芪照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VID)測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水＝32∶68為流動相；蒸發(fā)光散射檢測器；理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計算應(yīng)不低于4000；對照品溶液的制備稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1體積份含0.0002重量份的溶液，即得；供試品溶液的制備取本發(fā)明藥物組合物制劑100體積份，混勻，精密量取10體積份，于水浴上蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得；測定法吸取對照品溶液0.01體積份、0.02體積份及供試品溶液0.02體積份，注入液相色譜儀，測定，即得；本發(fā)明藥物組合物制劑按日服用劑量計黃芪以黃芪甲苷(C41H68O14)計，不得少于0.00004重量份。
指紋圖譜檢測 A本發(fā)明藥物組合物制劑成品指紋圖譜檢測方法包括如下步驟 照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VID) 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A，以80％乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0～5min 25％B，5～20min25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min85％～25％B；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1體積份/min；參照物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得；供試品溶液的制備取本發(fā)明藥物組合物制劑作為供試品溶液；測定法取參照物溶液和供試品溶液各0.02體積份，注入高效液相色譜儀，記錄65min色譜；供試品指紋圖譜中與參照物人參皂苷Rg1相應(yīng)的峰為S峰，計算各共有峰相對保留時間；供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜(附圖1)有良好的相似性； 指紋圖譜應(yīng)有12個共有峰； 各序號特征峰的相對保留時間按分鐘計分別為1號峰為0.830、S峰為1.000、2號峰為1.100、3號峰為1.221、4號峰為1.294、5號峰為1.630、6號峰為1.738、7號峰為1.811、8號峰為1.848、9號峰為1.887、10號峰為2.015、11號峰為2.808；各序號特征峰的峰面積比值分別為1號峰為0.105、S峰為1.000、2號峰為0.296、3號峰為2.244、4號峰為0.495、5號峰為0.131、6號峰為0.052、7號峰為0.031、8號峰為0.050、9號峰為0.055、10號峰為0.044、11號峰為0.019； 非共有峰面積不得過總峰面積的5％。
B本發(fā)明藥物組合物制劑中間體指紋圖譜檢測方法包括如下步驟 指紋圖譜照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VD)，結(jié)合指紋圖譜的要求進(jìn)行測定；色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A、80％乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0～5min 25％B\，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1體積份/min；參照物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得；供試品溶液的制備取2體積份中間體，用水稀釋至10體積份，作為供試品溶液；HPLC分析前用0.45μm水系濾膜過濾；測定法取參照物溶液和供試品溶液各0.02體積份，注入高效液相色譜儀，記錄65min色譜，以人參皂苷Rg1峰為參考峰(S)，計算各共有峰的相對保留時間；供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜(附圖2)有良好的相似性； 指紋圖譜應(yīng)有19個共有峰； 各序號特征峰的相對保留時間按分鐘計分別為1號峰為0.827、S峰為1.000、2號峰為1.100、3號峰為1.222、4號峰為1.296、5號峰為1.636、6號峰為1.744、7號峰為1.817、8號峰為1.855、9號峰為1.895、10號峰為2.024、11號峰為2.137、12號峰為2.375、13號峰為2.694、14號峰為2.837、15號峰為2.987、16號峰為3.382、17號峰為3.542、18號峰為3.643； 各序號特征峰的峰面積比值分別為1號峰為0.129、S峰為1.000、2號峰為0.209、3號峰為1.636、4號峰為0.542、5號峰為0.183、6號峰為0.158、7號峰為0.133、8號峰為0.099、9號峰為0.102、10號峰為0.050、11號峰為0.171、12號峰為0.185、13號峰為0.070、14號峰為0.059、15號峰為0.050、16號峰為0.060、17號峰為0.143、18號峰為0.063； 非共有峰面積不得過總峰面積的5％。
C人參藥材指紋圖譜檢測標(biāo)準(zhǔn) 指紋圖譜照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VD)；色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A，以80％乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1體積份/min；參照物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得；供試品溶液的制備藥材經(jīng)粉碎后過3號篩，取各批藥材粉末5重量份，精密稱定，置于250ml圓底燒瓶中，加50體積份75％乙醇，加熱回流30min，離心，取提取液，如此4次，合并提取液，旋蒸至干，用50體積份40％甲醇溶液溶解，離心，精密量取上清液2體積份，用40％甲醇溶液稀釋至10體積份，作為供試品溶液；HPLC分析前用0.45μm的有機系濾膜過濾；測定法取參照物溶液和供試品溶液各0.002體積份，注入高效液相色譜儀，記錄65min色譜；供試品指紋圖譜中與參照物相應(yīng)的峰為S峰，計算各共有峰相對保留時間；供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜(附圖3)有良好的相似性； 指紋圖譜應(yīng)有15個共有峰； 各序號特征峰的相對保留時間按分鐘計分別為1號峰為0.731、2號峰為0.824、S峰為1.000、3號峰為1.649、4號峰為1.699、5號峰為1.739、6號峰為1.828、7號峰為1.870、8號峰為1.925、9號峰為1.951、10號峰為2.000、11號峰為2.151、12號峰為3.031、13號峰為3.605、14號峰為3.875； 各序號特征峰的峰面積比值分別為1號峰為0.048、2號峰為0.108、S峰為1.000、3號峰為0.213、4號峰為0.078、5號峰為0.621、6號峰為0.409、7號峰為0.046、8號峰為0.243、9號峰為0.039、10號峰為0.027、11號峰為0.157、12號峰為0.027、13號峰為0.099、14號峰為0.257； 非共有峰面積不得過總峰面積的5％。
D黃芪藥材指紋圖譜檢測標(biāo)準(zhǔn) 指紋圖譜照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VD)；色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A，以80％乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1體積份/min；內(nèi)標(biāo)物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得；供試品溶液的制備黃芪切片經(jīng)粉碎后過3號篩，取黃芪粉末5重量份，加水50體積份，回流提取3小時，離心，取提取液，如此2次，合并提取液，濃縮至30體積份，加乙醇至含醇量為75％，4℃放置過夜，離心，上清液用75％乙醇定容至250體積份，取5體積份，加入0.5體積份內(nèi)標(biāo)物溶液，作為供試品溶液；HPLC分析前用0.45μm有機系濾膜過濾；測定法取內(nèi)標(biāo)物溶液和供試品溶液各0.02體積份，注入高效液相色譜儀，記錄65min色譜，分別以內(nèi)標(biāo)物人參皂苷Rg1峰(S1)和相對S1峰保留時間約為1.25的色譜峰為參考峰(S)，計算各共有峰的相對保留時間；供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜(附圖4)有良好的相似性； 指紋圖譜應(yīng)有12個共有峰； 各序號特征峰的相對保留時間(1)按分鐘計分別為S1號峰為1.000、1號峰為1.063、S峰為1.226、2號峰為1.344、3號峰為1.777、4號峰為2.157、5號峰為2.247、6號峰為2.292、7號峰為2.382、8號峰為3.085、9號峰為3.540、10號峰為3.603；各序號特征峰的相對保留時間(2)按分鐘計分別為S1號峰為0.816、1號峰為0.867、S峰為1.000、2號峰為1.096、3號峰為1.449、4號峰為1.760、5號峰為1.833、6號峰為1.870、7號峰為1.943、8號峰為2.516、9號峰為2.888、10號峰為2.939；各序號特征峰的峰面積比值分別為1號峰為0.385、S峰為1.000、2號峰為1.975、3號峰為0.090、4號峰為0.402、5號峰為0.049、6號峰為0.693、7號峰為1.064、8號峰為0.155、9號峰為0.043、10號峰為0.054； 非共有峰面積不得過總峰面積的10％。
本發(fā)明所述的重量份與體積份的比例為克/毫升。本發(fā)明藥物組合物質(zhì)量控制方法可以應(yīng)用于組合物的各種劑型，如片劑、膠囊、口服液、滴丸、噴霧劑、顆粒劑等臨床可接受的劑型，由于不同劑型的制劑其中所含的相當(dāng)生藥量是相同的，因此各個劑型在進(jìn)行質(zhì)量控制時，所選用樣品量可統(tǒng)一折算為相當(dāng)生藥量。
本發(fā)明藥物組合物制劑的質(zhì)量控制方法，包括人參鑒別，人參、苦參素的含量測定以及本發(fā)明藥物組合物制劑成品和中間體的指紋圖譜等方法，共同構(gòu)成了本發(fā)明藥物組合物的質(zhì)量控制體系，在過程中采用特定的方法處理供試液，或者采用特定的填充劑、流動相等，使最終得到的結(jié)果數(shù)據(jù)更確切，有效地控制了本發(fā)明藥物組合物制劑的質(zhì)量。



圖1本發(fā)明藥物組合物制劑成品指紋對照圖譜； 圖2本發(fā)明藥物組合物制劑中間體指紋對照圖譜； 圖3人參藥材指紋對照圖譜； 圖4黃芪藥材指紋對照圖譜。
下述實驗例和實施例用于進(jìn)一步說明但不限于本發(fā)明。
實驗例1人參含量測定實驗 1.儀器與試藥儀器高效液相色譜儀2010A(日本島津)、數(shù)據(jù)處理機CLASS-VP(日本島津)、紫外-可見分光光度計UV-2550(日本島津)、電子天平Mettler AL 204-IC(瑞士)。
試藥人參皂苷Rg1對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，批號110703-200322，供含量測定用；人參皂苷Re對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，批號110754-200320，供含量測定用；乙腈，甲醇為色譜純，水為超純水。
2.色譜條件色譜柱Zorbax Extend C18十八烷基硅烷鍵合硅膠；5μm 4.6mm×250mm；柱溫40℃；流動相乙腈-水(19∶81)；流速0.8ml/min；檢測波長203nm；理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計算應(yīng)不低于3000。
對照品溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re適量，加甲醇制成每1ml含人參皂苷Rg10.2524mg、人參皂苷Re 0.3052mg的混合溶液，即得。(以下實驗所用對照品濃度同此)供試品溶液的制備精密量取裝量差異項下的本品25ml，置分液漏斗中，用三氯甲烷提取2次，每次20ml，棄去三氯甲烷液，水液用水飽和正丁醇提取5次，每次20ml，合并正丁醇液，用1％NaOH溶液洗滌3次，每次30ml，棄去堿液，再用正丁醇飽和的水輕輕搖洗3次，每次30ml，棄去水液，取正丁醇液蒸干。殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
3.精密度試驗同一供試品溶液，照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，測得峰面積積分值，結(jié)果見表1。
表1精密度試驗結(jié)果
4.重現(xiàn)性試驗取同一批樣品依法獨立測定6次，計算含量。見表2。
表2重現(xiàn)性試驗結(jié)果
結(jié)果表明，本法重現(xiàn)性良好，精密度較高。
5.樣品測定結(jié)果 依法測定3批樣品，結(jié)果見表3。
表3本發(fā)明注射液含量測定結(jié)果
實驗例2黃芪含量測定實驗 儀器日本島津2010C型高效液相色譜儀，美國奧泰2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器；浙江大學(xué)N-2000色譜工作站。
色譜條件色譜柱Vp-ODS柱(4.60×250mm，5μm)，柱溫35℃；流動相乙腈-水(32∶68)，流速1.0ml/min，蒸發(fā)光散射檢測器。在此色譜條件下，供試品色譜中，在與對照品色譜相同的保留時間處有色譜峰(保留時間35分鐘)，與其它組分能達(dá)到基線分離，R＞1.5。
試藥本發(fā)明注射液(規(guī)格10ml/支)長白山制藥股份有限公司提供。黃芪甲苷對照品，供含量測定用，批號110781-200512，中國藥品生物制品檢定所提供。乙腈，色譜純，美國Fisher；其它試劑均為分析純。
1、線性關(guān)系的考察精密稱取黃芪甲苷對照品，依法測定，結(jié)果見表4。以黃芪甲苷進(jìn)樣量的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，黃芪甲苷在0.97～4.85μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y＝5.3465+1.7266X，相關(guān)系數(shù)r＝0.99989。
表4線性關(guān)系考察結(jié)果
2、精密度的測定取本發(fā)明藥物組合制劑，按含量測定項下方法制備供試品溶液，精密吸取20μl，重復(fù)測定5次，測定黃芪甲苷的峰面積值，結(jié)果見表5。
表5精密度試驗結(jié)果
3、樣品含量測定及含量限度的確定按[含量測定]項下方法操作，制備供試品溶液。照高效液相色譜法(《中國藥典》2005年版一部附錄VID)測定四批本發(fā)明藥物組合制劑中黃芪甲苷的含量，結(jié)果見表6。
表6樣品的含量測定結(jié)果
根據(jù)上述測定結(jié)果，四批樣品平均含量為0.676mg/支，考慮黃芪產(chǎn)地、加工及生產(chǎn)等因素的影響，為有效保證制劑質(zhì)量，限定本品每1ml含黃芪以黃芪甲苷(C41H68O14)計，不得少于0.04mg。
實驗例3本發(fā)明藥物組合物制劑成品指紋圖譜研究 1、供試品的制備 本發(fā)明藥物組合物制劑成品冰箱中4℃保存，批號分別為060709、060710、060711、060712、060713、060714、060715、060716、060717、060718。成品直接作為供試品。
2、參照物的選擇和制備 成品主要考察其批間一致性，以及與中間體的相關(guān)性。參考中間體指紋圖譜的建立，選擇人參皂苷Rg1為參考峰，結(jié)果證明此方法準(zhǔn)確可行。
3、檢測方法 3.1、儀器與試劑 儀器Angilent高效液相色譜儀(Angilent 1100系列，帶VWD檢測器和色譜工作站)；天津特納色譜柱色譜柱Kromasil C18 100A 5μm(4.6mm×250mm)；試藥甲醇(色譜純，天津康科德科技有限公司)、乙腈(色譜純，美國Honeywell B&J公司)、人參皂苷Rg1對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110703-200424)。
3.2色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 在確定人參色譜條件時已經(jīng)證明，其條件完全適用于康艾成品指紋圖譜的建立。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；采用二元梯度洗脫，流動相A為水，B為80％乙腈溶液，梯度洗脫程序如下25％B(0～5min)，25％～39％B(5～20min)，39％～49％B(20～35min)，49％～85％B(35～55min)，85％B(55～65min)，85％～25％B(65～72min)；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1ml/min。
3.3專屬性試驗 按照處方量比例取苦參素制成水針，在上述色譜條件下注入液相色譜儀，結(jié)果苦參素的吸收峰不干擾指紋圖譜的測定。
3.4精密度試驗 以批號為060716的成品為供試品，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各共有色譜峰保留時間和積分面積。結(jié)果表明儀器等整個檢測系統(tǒng)的精密度良好。數(shù)據(jù)見表7、8 表7精密度試驗結(jié)果(相對保留時間)
表8精密度試驗結(jié)果(峰面積比值)
3.5穩(wěn)定性試驗 取批號為060716的成品為供試品，1d內(nèi)于不同時間取樣5次，依法測定。結(jié)果表明低溫保存下的成品穩(wěn)定性較好，常溫下1d之內(nèi)也能保持較好的穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)見表9、10。
表9穩(wěn)定性試驗結(jié)果(相對保留時間)
表10穩(wěn)定性試驗結(jié)果(峰面積比值)
從試驗結(jié)果可知，非共有峰占總峰面積比＜5％，符合要求。
實驗例4本發(fā)明藥物組合物制劑中間體指紋圖譜研究 1供試品的制備 本發(fā)明藥物組合物制劑中間體冰箱中4℃保存，編號分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。樣品用水稀釋5倍后過0.45μm水系濾膜后注入高效液相色譜儀中進(jìn)行分析。
2參照物的制備 制備方法與人參藥材的參照物溶液制備方法相同。
3檢測方法 3.1儀器與試劑 儀器Angilent高效液相色譜儀(Agilent1100系列，帶VWD檢測器和色譜工作站)；天津特納色譜柱Kromasil 100A C18 5μm(4.6mm×250mm)；試藥甲醇(色譜純，天津康科德科技有限公司)、乙腈(色譜純，美國Honeywell B&J公司)、人參皂苷Rg1對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110703-200424)。
3.2色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 采用測定人參藥材指紋圖譜的色譜條件，其條件完全適用于本發(fā)明注射液中間體指紋圖譜的建立。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；采用二元梯度洗脫，流動相A為水，B為80％乙腈溶液，梯度洗脫程序如下25％B(0～5min)，25％～39％B(5～20min)，39％～49％B(20～35min)，49％～85％B(35～55min)，85％B(55～65min)，85％～25％B(65～72min)；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1ml/min。
3.3精密度試驗 取編號為3的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各共有峰保留時間和積分面積。以人參皂苷Rg1的峰為參照峰，換算出各共有峰的相對保留時間和峰面積比值。數(shù)據(jù)見表11、12。
表11精密度試驗結(jié)果(相對保留時間)
表12精密度實驗結(jié)果(峰面積比值)
結(jié)果表明儀器等整個檢測系統(tǒng)的精密度良好。
3.4穩(wěn)定性試驗 取編號為3的供試品溶液，1d內(nèi)于不同時間取樣5次，依法測定。數(shù)據(jù)見表13、14。
表13穩(wěn)定性試驗結(jié)果(相對保留時間)
表14穩(wěn)定性試驗結(jié)果(峰面積比值)
結(jié)果表明低溫保存下的本發(fā)明藥物組合物制劑中間體的制備樣品穩(wěn)定性較好，常溫下1d之內(nèi)也能保持較好的穩(wěn)定性。
實驗例5人參藥材指紋圖譜研究實驗 1.來源 人參為五加科植物人參Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根。藥材共十批，產(chǎn)地均為吉林省蛟河市，分別編號為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。
2、供試品的制備 人參的主要活性成分為人參皂苷，易溶于水、甲醇、乙醇，參考文獻(xiàn)，取人參粗粉，加10倍量75％乙醇，回流提取4次，每次30min。HPLC分析結(jié)果證明，該提取方法簡便且重現(xiàn)性好，與中間體及成品指紋圖譜間的相關(guān)性良好。
3.參照物的制備 人參藥材經(jīng)上述方法提取后，經(jīng)HPLC分析出現(xiàn)多個色譜峰，人參皂苷Rg1為主要成分之一，其積分面積在指紋圖譜中所占的比例較大且相對穩(wěn)定，因此選定人參皂苷Rg1作為參照物。其制備方法為將人參皂苷Rg1溶解于甲醇溶液進(jìn)行分析，結(jié)果證明該制備方法可行。
4.檢測方法 4.1儀器與試劑 儀器Angilent高效液相色譜儀(Angilent 1100系列，帶VWD檢測器和色譜工作站)；天津特納色譜柱Kromasil 100A C18 5μm(4.6mm×250mm)；試藥甲醇(色譜純，天津康科德科技有限公司)、乙腈(色譜純，美國Honeywell B&J公司)、人參皂苷Rg1對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110703-200424)。
4.2精密度試驗 取編號為4的藥材的制備樣品為供試品，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各共有色譜峰保留時間和峰面積，見表15、16。
表15精密度試驗結(jié)果(相對保留時間)
表16精密度試驗結(jié)果(峰面積比值)
4.3穩(wěn)定性試驗 取編號為4的藥材的制備樣品為供試品，1d內(nèi)于不同時間取樣5次，依法測定，見表17。
表17穩(wěn)定性試驗結(jié)果(相對保留時間)
實驗結(jié)果表明，該質(zhì)量控制方法的精密度和穩(wěn)定性較好。
下述實施例均能實現(xiàn)上述實驗例的效果。

具體實施例方式 實施例1本發(fā)明注射液的制備 稱取黃芪250g、人參120g、苦參素8g三味原料藥，人參用75％的乙醇，回流提取3次，每次2小時，合并提取液，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.20的清膏，測定溫度為65℃，備用；黃芪加水煎煮2次，每次2小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.20的清膏，測定溫度為65℃，與人參清膏合并，加乙醇使含醇量達(dá)75％，用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，靜置12小時，取上清液，回收乙醇，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.15的清膏，測定溫度為65℃；再加乙醇使含醇量達(dá)85％，用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，靜置，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，加注射用水到400ml，用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，100℃滅菌30分鐘，冷藏，抽濾。用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，加活性炭適量，攪勻，煮沸15分鐘，濾過，濾液備用；另取苦參素溶解，用稀鹽酸調(diào)PH值至6～7，100℃滅菌30分鐘，冷藏，抽濾，與脫炭后的藥液合并，混勻，加注射用水至1000ml，濾過，灌裝，即得。
實施例2本發(fā)明注射液中間體的制備 稱取黃芪350重量份、人參70重量份、苦參素12重量份三味原料藥，人參用75％的乙醇，回流提取3次，每次2小時，合并提取液，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.20的清膏，測定溫度為65℃，備用；黃芪加水煎煮2次，每次2小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.20的清膏，測定溫度為65℃，與人參清膏合并，加乙醇使含醇量達(dá)75％，用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，靜置12小時，取上清液，回收乙醇，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.15的清膏，測定溫度為65℃；再加乙醇使含醇量達(dá)85％，用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，靜置，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，加注射用水到400體積份(按ml/g的比例)，用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，100℃滅菌30分鐘，冷藏，抽濾。用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，加活性炭適量，攪勻，煮沸15分鐘，濾過，濾液備用；另取苦參素溶解，用稀鹽酸調(diào)PH值至6～7，100℃滅菌30分鐘，冷藏，抽濾，與脫炭后的藥液合并，混勻，得中間體。
實施例3本發(fā)明藥物組合物制劑質(zhì)量控制方法 鑒別 取本發(fā)明藥物組合物制劑20體積份，于水浴上蒸干，殘渣加甲醇5體積份使溶解，作為供試品溶液；另取人參對照藥材1重量份，加三氯甲烷40體積份，加熱回流1小時，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，加水0.5體積份攪拌濕潤，加水飽和正丁醇10體積份，超聲處理30分鐘，吸取上清液加3倍量氨試液，搖勻，放置分層，取上清液蒸干，殘渣加甲醇1體積份使溶解，作為對照藥材溶液；再取人參皂苷Re、Rg1對照品，分別加甲醇制成每1體積份含0.002重量份的對照品溶液；照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VIB)試驗，吸取上述四種溶液各0.0018體積份，分別點于厚500μm同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水＝15∶40∶22∶10在10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，涼干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點； 含量測定 A人參照高效液相色譜法(《中國藥典2005年版一部》附錄VID)測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水＝19∶81為流動相；檢測波長為203nm；理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計算應(yīng)不低于3000；對照品溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品，加甲醇制成每1體積份各含0.00025重量份的混合溶液，搖勻，即得；供試品溶液的制備量取裝量差異項下的本發(fā)明藥物組合物制劑25體積份，置分液漏斗中，用三氯甲烷提取2次，每次20體積份，棄去三氯甲烷液，水液用水飽和正丁醇提取5次，每次20體積份，合并正丁醇液，用1％NaOH溶液洗滌3次，每次30體積份，棄去堿液，再用正丁醇飽和的水輕輕搖洗3次，每次30體積份，棄去水液，取正丁醇液蒸干；殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；測定法分別吸取對照品溶液與供試品溶液各0.01體積份，注入液相色譜儀，測定，即得；本發(fā)明藥物組合物制劑按日服用劑量計含人參皂苷Rg1(C42H72O14)和人參皂苷Re(C48H82O18)的總量不得少于0.00004重量份； B苦參素照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VID)測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；1％磷酸溶液-乙腈＝93∶7為流動相，其中磷酸溶液用三乙胺調(diào)節(jié)PH值為2.5，檢測波長為220nm；理論板數(shù)按氧化苦參堿峰計算應(yīng)不低于2000，氧化苦參堿峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求；對照品溶液的制備稱取氧化苦參堿對照品適量，加流動相制成每1體積份中含0.00025重量份的溶液，即得；供試品溶液制備量取本發(fā)明藥物組合物制劑按日服用劑量計2.5體積份，置100ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得；測定法量取對照品溶液及供試品溶液各0.020體積份，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算；本發(fā)明藥物組合物制劑按日服用劑量計含苦參素以氧化苦參堿(C15H24N2O2)計，應(yīng)為0.009重量份～0.011重量份； C黃芪照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VID)測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水＝32∶68為流動相；蒸發(fā)光散射檢測器；理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計算應(yīng)不低于4000；對照品溶液的制備稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1體積份含0.0002重量份的溶液，即得；供試品溶液的制備取本發(fā)明藥物組合物制劑100體積份，混勻，精密量取10體積份，于水浴上蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得；測定法吸取對照品溶液0.01體積份、0.02體積份及供試品溶液0.02體積份，注入液相色譜儀，測定，即得；本發(fā)明藥物組合物制劑按日服用劑量計黃芪以黃芪甲苷(C41H68O14)計，不得少于0.00004重量份。
指紋圖譜檢測 A本發(fā)明藥物組合物制劑成品指紋圖譜檢測方法包括如下步驟 照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VID) 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A，以80％乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0～5min 25％B，5～20min25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min85％～25％B；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1體積份/min；參照物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得；供試品溶液的制備取本發(fā)明藥物組合物制劑作為供試品溶液；測定法取參照物溶液和供試品溶液各0.02體積份，注入高效液相色譜儀，記錄65min色譜；供試品指紋圖譜中與參照物人參皂苷Rg1相應(yīng)的峰為S峰，計算各共有峰相對保留時間；供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜(附圖1)有良好的相似性；指紋圖譜應(yīng)有12個共有峰； 各序號特征峰的相對保留時間按分鐘計分別為1號峰為0.830、S峰為1.000、2號峰為1.100、3號峰為1.221、4號峰為1.294、5號峰為1.630、6號峰為1.738、7號峰為1.811、8號峰為1.848、9號峰為1.887、10號峰為2.015、11號峰為2.808；各序號特征峰的峰面積比值分別為1號峰為0.105、S峰為1.000、2號峰為0.296、3號峰為2.244、4號峰為0.495、5號峰為0.131、6號峰為0.052、7號峰為0.031、8號峰為0.050、9號峰為0.055、10號峰為0.044、11號峰為0.019；非共有峰面積不得過總峰面積的5％。
B本發(fā)明藥物組合物制劑中間體指紋圖譜檢測方法包括如下步驟 指紋圖譜照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VD)，結(jié)合指紋圖譜的要求進(jìn)行測定；色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A、80％乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0～5min 25％B\，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1體積份/min；參照物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得；供試品溶液的制備取2體積份中間體，用水稀釋至10體積份，作為供試品溶液；HPLC分析前用0.45μm水系濾膜過濾；測定法取參照物溶液和供試品溶液各0.02體積份，注入高效液相色譜儀，記錄65min色譜，以人參皂苷Rg1峰為參考峰(S)，計算各共有峰的相對保留時間；供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜(附圖2)有良好的相似性； 指紋圖譜應(yīng)有19個共有峰； 各序號特征峰的相對保留時間按分鐘計分別為1號峰為0.827、S峰為1.000、2號峰為1.100、3號峰為1.222、4號峰為1.296、5號峰為1.636、6號峰為1.744、7號峰為1.817、8號峰為1.855、9號峰為1.895、10號峰為2.024、11號峰為2.137、12號峰為2.375、13號峰為2.694、14號峰為2.837、15號峰為2.987、16號峰為3.382、17號峰為3.542、18號峰為3.643； 各序號特征峰的峰面積比值分別為1號峰為0.129、S峰為1.000、2號峰為0.209、3號峰為1.636、4號峰為0.542、5號峰為0.183、6號峰為0.158、7號峰為0.133、8號峰為0.099、9號峰為0.102、10號峰為0.050、11號峰為0.171、12號峰為0.185、13號峰為0.070、14號峰為0.059、15號峰為0.050、16號峰為0.060、17號峰為0.143、18號峰為0.063； 非共有峰面積不得過總峰面積的5％。
C人參藥材指紋圖譜檢測標(biāo)準(zhǔn) 指紋圖譜照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄V D)；色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A，以80％乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1體積份/min；參照物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得；供試品溶液的制備藥材經(jīng)粉碎后過3號篩，取各批藥材粉末5重量份，精密稱定，置于250ml圓底燒瓶中，加50體積份75％乙醇，加熱回流30min，離心，取提取液，如此4次，合并提取液，旋蒸至干，用50體積份40％甲醇溶液溶解，離心，精密量取上清液2體積份，用40％甲醇溶液稀釋至10體積份，作為供試品溶液；HPLC分析前用0.45μm的有機系濾膜過濾；測定法取參照物溶液和供試品溶液各0.002體積份，注入高效液相色譜儀，記錄65min色譜；供試品指紋圖譜中與參照物相應(yīng)的峰為S峰，計算各共有峰相對保留時間；供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜(附圖3)有良好的相似性； 指紋圖譜應(yīng)有15個共有峰； 各序號特征峰的相對保留時間按分鐘計分別為1號峰為0.731、2號峰為0.824、S峰為1.000、3號峰為1.649、4號峰為1.699、5號峰為1.739、6號峰為1.828、7號峰為1.870、8號峰為1.925、9號峰為1.951、10號峰為2.000、11號峰為2.151、12號峰為3.031、13號峰為3.605、14號峰為3.875； 各序號特征峰的峰面積比值分別為1號峰為0.048、2號峰為0.108、S峰為1.000、3號峰為0.213、4號峰為0.078、5號峰為0.621、6號峰為0.409、7號峰為0.046、8號峰為0.243、9號峰為0.039、10號峰為0.027、11號峰為0.157、12號峰為0.027、13號峰為0.099、14號峰為0.257； 非共有峰面積不得過總峰面積的5％。
D黃芪藥材指紋圖譜檢測標(biāo)準(zhǔn) 指紋圖譜照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VD)；色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A，以80％乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～35min39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1體積份/min；內(nèi)標(biāo)物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得；供試品溶液的制備黃芪切片經(jīng)粉碎后過3號篩，取黃芪粉末5重量份，加水50體積份，回流提取3小時，離心，取提取液，如此2次，合并提取液，濃縮至30體積份，加乙醇至含醇量為75％，4℃放置過夜，離心，上清液用75％乙醇定容至250體積份，取5體積份，加入0.5體積份內(nèi)標(biāo)物溶液，作為供試品溶液；HPLC分析前用0.45μm有機系濾膜過濾；測定法取內(nèi)標(biāo)物溶液和供試品溶液各0.02體積份，注入高效液相色譜儀，記錄65min色譜，分別以內(nèi)標(biāo)物人參皂苷Rg1峰(S1)和相對S1峰保留時間約為1.25的色譜峰為參考峰(S)，計算各共有峰的相對保留時間；供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜(附圖4)有良好的相似性； 指紋圖譜應(yīng)有12個共有峰； 各序號特征峰的相對保留時間(1)按分鐘計分別為S1號峰為1.000、1號峰為1.063、S峰為1.226、2號峰為1.344、3號峰為1.777、4號峰為2.157、5號峰為2.247、6號峰為2.292、7號峰為2.382、8號峰為3.085、9號峰為3.540、10號峰為3.603；各序號特征峰的相對保留時間(2)按分鐘計分別為S1號峰為0.816、1號峰為0.867、S峰為1.000、2號峰為1.096、3號峰為1.449、4號峰為1.760、5號峰為1.833、6號峰為1.870、7號峰為1.943、8號峰為2.516、9號峰為2.888、10號峰為2.939；各序號特征峰的峰面積比值分別為1號峰為0.385、S峰為1.000、2號峰為1.975、3號峰為0.090、4號峰為0.402、5號峰為0.049、6號峰為0.693、7號峰為1.064、8號峰為0.155、9號峰為0.043、10號峰為0.054； 非共有峰面積不得過總峰面積的10％。
實施例4本發(fā)明藥物組合物制劑成品的指紋圖譜檢測標(biāo)準(zhǔn) 照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VID) 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A，以80％乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1體積份/min；參照物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得；供試品溶液的制備取本發(fā)明藥物組合物制劑作為供試品溶液；測定法取參照物溶液和供試品溶液各0.02體積份，注入高效液相色譜儀，記錄65min色譜；供試品指紋圖譜中與參照物人參皂苷Rg1相應(yīng)的峰為S峰，計算各共有峰相對保留時間；供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜(附圖1)有良好的相似性； 指紋圖譜應(yīng)有12個共有峰； 各序號特征峰的相對保留時間按分鐘計分別為1號峰為0.830、S峰為1.000、2號峰為1.100、3號峰為1.221、4號峰為1.294、5號峰為1.630、6號峰為1.738、7號峰為1.811、8號峰為1.848、9號峰為1.887、10號峰為2.015、11號峰為2.808；各序號特征峰的峰面積比值分別為1號峰為0.105、S峰為1.000、2號峰為0.296、3號峰為2.244、4號峰為0.495、5號峰為0.131、6號峰為0.052、7號峰為0.031、8號峰為0.050、9號峰為0.055、10號峰為0.044、11號峰為0.019； 非共有峰面積不得過總峰面積的5％。
實施例5本發(fā)明藥物組合物制劑中間體指紋圖譜檢測標(biāo)準(zhǔn) 指紋圖譜照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VD)，結(jié)合指紋圖譜的要求進(jìn)行測定；色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A、80％乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0～5min 25％B\，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1體積份/min；參照物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得；供試品溶液的制備取2體積份中間體，用水稀釋至10體積份，作為供試品溶液；HPLC分析前用0.45μm水系濾膜過濾；測定法取參照物溶液和供試品溶液各0.02體積份，注入高效液相色譜儀，記錄65min色譜，以人參皂苷Rg1峰為參考峰(S)，計算各共有峰的相對保留時間；供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜(附圖2)有良好的相似性； 指紋圖譜應(yīng)有19個共有峰； 各序號特征峰的相對保留時間按分鐘計分別為1號峰為0.827、S峰為1.000、2號峰為1.100、3號峰為1.222、4號峰為1.296、5號峰為1.636、6號峰為1.744、7號峰為1.817、8號峰為1.855、9號峰為1.895、10號峰為2.024、11號峰為2.137、12號峰為2.375、13號峰為2.694、14號峰為2.837、15號峰為2.987、16號峰為3.382、17號峰為3.542、18號峰為3.643； 各序號特征峰的峰面積比值分別為1號峰為0.129、S峰為1.000、2號峰為0.209、3號峰為1.636、4號峰為0.542、5號峰為0.183、6號峰為0.158、7號峰為0.133、8號峰為0.099、9號峰為0.102、10號峰為0.050、11號峰為0.171、12號峰為0.185、13號峰為0.070、14號峰為0.059、15號峰為0.050、16號峰為0.060、17號峰為0.143、18號峰為0.063； 非共有峰面積不得過總峰面積的5％。
實施例6人參藥材指紋圖譜檢測標(biāo)準(zhǔn) 指紋圖譜照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VD)；色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A，以80％乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1體積份/min；參照物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得；供試品溶液的制備藥材經(jīng)粉碎后過3號篩，取各批藥材粉末5重量份，精密稱定，置于250ml圓底燒瓶中，加50體積份75％乙醇，加熱回流30min，離心，取提取液，如此4次，合并提取液，旋蒸至干，用50體積份40％甲醇溶液溶解，離心，精密量取上清液2體積份，用40％甲醇溶液稀釋至10體積份，作為供試品溶液；HPLC分析前用0.45μm的有機系濾膜過濾；測定法取參照物溶液和供試品溶液各0.002體積份，注入高效液相色譜儀，記錄65min色譜；供試品指紋圖譜中與參照物相應(yīng)的峰為S峰，計算各共有峰相對保留時間；供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜(附圖3)有良好的相似性； 指紋圖譜應(yīng)有15個共有峰； 各序號特征峰的相對保留時間按分鐘計分別為1號峰為0.731、2號峰為0.824、S峰為1.000、3號峰為1.649、4號峰為1.699、5號峰為1.739、6號峰為1.828、7號峰為1.870、8號峰為1.925、9號峰為1.951、10號峰為2.000、11號峰為2.151、12號峰為3.031、13號峰為3.605、14號峰為3.875； 各序號特征峰的峰面積比值分別為1號峰為0.048、2號峰為0.108、S峰為1.000、3號峰為0.213、4號峰為0.078、5號峰為0.621、6號峰為0.409、7號峰為0.046、8號峰為0.243、9號峰為0.039、10號峰為0.027、11號峰為0.157、12號峰為0.027、13號峰為0.099、14號峰為0.257； 非共有峰面積不得過總峰面積的5％。
實施例7黃芪藥材指紋圖譜檢測標(biāo)準(zhǔn) 指紋圖譜照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VD)；色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A，以80％乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1體積份/min；內(nèi)標(biāo)物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得；供試品溶液的制備黃芪切片經(jīng)粉碎后過3號篩，取黃芪粉末5重量份，加水50體積份，回流提取3小時，離心，取提取液，如此2次，合并提取液，濃縮至30體積份，加乙醇至含醇量為75％，4℃放置過夜，離心，上清液用75％乙醇定容至250體積份，取5體積份，加入0.5體積份內(nèi)標(biāo)物溶液，作為供試品溶液；HPLC分析前用0.45μm有機系濾膜過濾；測定法取內(nèi)標(biāo)物溶液和供試品溶液各0.02體積份，注入高效液相色譜儀，記錄65min色譜，分別以內(nèi)標(biāo)物人參皂苷Rg1峰(S1)和相對S1峰保留時間約為1.25的色譜峰為參考峰(S)，計算各共有峰的相對保留時間；供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜(附圖4)有良好的相似性； 指紋圖譜應(yīng)有12個共有峰； 各序號特征峰的相對保留時間(1)按分鐘計分別為S1號峰為1.000、1號峰為1.063、S峰為1.226、2號峰為1.344、3號峰為1.777、4號峰為2.157、5號峰為2.247、6號峰為2.292、7號峰為2.382、8號峰為3.085、9號峰為3.540、10號峰為3.603；各序號特征峰的相對保留時間(2)按分鐘計分別為S1號峰為0.816、1號峰為0.867、S峰為1.000、2號峰為1.096、3號峰為1.449、4號峰為1.760、5號峰為1.833、6號峰為1.870、7號峰為1.943、8號峰為2.516、9號峰為2.888、10號峰為2.939；各序號特征峰的峰面積比值分別為1號峰為0.385、S峰為1.000、2號峰為1.975、3號峰為0.090、4號峰為0.402、5號峰為0.049、6號峰為0.693、7號峰為1.064、8號峰為0.155、9號峰為0.043、10號峰為0.054； 非共有峰面積不得過總峰面積的10％。
權(quán)利要求
1、一種由原料藥黃芪200-400重量份、人參60-130重量份、苦參素6-13重量份制成的藥物組合物制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于該方法包括如下鑒別方法
鑒別取本發(fā)明藥物組合物制劑10～30體積份，于水浴上蒸干，殘渣加甲醇3～8體積份使溶解，作為供試品溶液；另取人參對照藥材0.5～1.5重量份，加三氯甲烷30～50體積份，加熱回流1小時，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，加水0.3～0.8體積份攪拌濕潤，加水飽和正丁醇5～15體積份，超聲處理20～40分鐘，吸取上清液加1～5倍量氨試液，搖勻，放置分層，取上清液蒸干，殘渣加甲醇0.5～1.5體積份使溶解，作為對照藥材溶液；再取人參皂苷Re、Rg1對照品，分別加甲醇制成每1體積份含0.001～0.003重量份的對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述四種溶液各0.0015～0.0025體積份，分別點于厚500μm同一硅膠重量份薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水＝10～20∶30～50∶17～27∶5～15在10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，涼干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點。
2、如權(quán)利要求1所述的藥物組合物制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于該方法包括如下鑒別方法
取本發(fā)明藥物組合物制劑20體積份，于水浴上蒸干，殘渣加甲醇5體積份使溶解，作為供試品溶液；另取人參對照藥材1重量份，加三氯甲烷40體積份，加熱回流1小時，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，加水0.5體積份攪拌濕潤，加水飽和正丁醇10體積份，超聲處理30分鐘，吸取上清液加3倍量氨試液，搖勻，放置分層，取上清液蒸干，殘渣加甲醇1體積份使溶解，作為對照藥材溶液；再取人參皂苷Re、Rg1對照品，分別加甲醇制成每1體積份含0.002重量份的對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述四種溶液各0.0018體積份，分別點于厚500μm同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水＝15∶40∶22∶10在10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，涼干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點。
3、如權(quán)利要求1所述的藥物組合物制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于該方法還包括如下含量測定中的一種或幾種
A人參
照高效液相色譜法測定；
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水＝15～25∶75～85為流動相；檢測波長為203nm；理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計算應(yīng)不低于3000；對照品溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品，加甲醇制成每1體積份各含0.0002～0.0003重量份的混合溶液，搖勻，即得；供試品溶液的制備量取裝量差異項下的本發(fā)明藥物組合物制劑20～30體積份，置分液漏斗中，用三氯甲烷提取1～3次，每次10～30體積份，棄去三氯甲烷液，水液用水飽和正丁醇提取4～6次，每次10～30體積份，合并正丁醇液，用1％NaOH溶液洗滌2～4次，每次20～40體積份，棄去堿液，再用正丁醇飽和的水輕輕搖洗2～4次，每次20～40體積份，棄去水液，取正丁醇液蒸干；殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；測定法分別吸取對照品溶液與供試品溶液各0.005～0.0015體積份，注入液相色譜儀，測定，即得；本發(fā)明藥物組合物制劑按日用劑量計含人參皂苷Rg1(C42H72O14)和人參皂苷Re(C48H82O18)的總量不得少于0.00004重量份；
B苦參素
照高效液相色譜法測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；1％磷酸溶液-乙腈＝90～95∶5～10，其中磷酸溶液用三乙胺調(diào)節(jié)PH值為2.5為流動相，檢測波長為220nm；理論板數(shù)按氧化苦參堿峰計算應(yīng)不低于2000，氧化苦參堿峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求；對照品溶液的制備精密稱取氧化苦參堿對照品適量，加流動相制成每1體積份中含0.0002～0.0003重量份的溶液，即得；供試品溶液制備量取本發(fā)明藥物組合物制劑2.0～3.0體積份，置100體積份量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得；測定法量取對照品溶液及供試品溶液各0.01～0.03體積份，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算；本發(fā)明藥物組合物制劑按日服用劑量計含苦參素以氧化苦參堿C15H24N2O2計，應(yīng)為0.009重量份～0.011重量份；
C黃芪
照高效液相色譜法測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水＝30～35∶65～70為流動相；蒸發(fā)光散射檢測器；理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計算應(yīng)不低于4000；對照品溶液的制備精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1體積份含0.0001～0.0003重量份的溶液，即得；供試品溶液的制備取本發(fā)明藥物組合物制劑80～120體積份，混勻，量取5～15體積份，于水浴上蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至5體積份量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得；測定法吸取對照品溶液0.005～0.015體積份、0.01～0.03體積份及供試品溶液0.01～0.03體積份，注入液相色譜儀，測定，即得；本發(fā)明藥物組合物制劑按日服用劑量計含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.00004重量份。
4、如權(quán)利要求3所述的藥物組合物制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于該方法還包括如下含量測定方法中的一種或幾種
A人參照高效液相色譜法測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水＝19∶81為流動相；檢測波長為203nm；理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計算應(yīng)不低于3000；對照品溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品，加甲醇制成每1體積份各含0.00025重量份的混合溶液，搖勻，即得；供試品溶液的制備量取裝量差異項下的本發(fā)明藥物組合物制劑25體積份，置分液漏斗中，用三氯甲烷提取2次，每次20體積份，棄去三氯甲烷液，水液用水飽和正丁醇提取5次，每次20體積份，合并正丁醇液，用1％NaOH溶液洗滌3次，每次30體積份，棄去堿液，再用正丁醇飽和的水輕輕搖洗3次，每次30體積份，棄去水液，取正丁醇液蒸干；殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；測定法分別吸取對照品溶液與供試品溶液各0.01體積份，注入液相色譜儀，測定，即得；本發(fā)明藥物組合物制劑按日服用劑量計含人參皂苷Rg1(C42H72O14)和人參皂苷Re(C48H82O18)的總量不得少于0.00004重量份；
B苦參素照高效液相色譜法測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；1％磷酸溶液-乙腈＝93∶7為流動相，其中磷酸溶液用三乙胺調(diào)節(jié)PH值為2.5，檢測波長為220nm；理論板數(shù)按氧化苦參堿峰計算應(yīng)不低于2000，氧化苦參堿峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求；
對照品溶液的制備稱取氧化苦參堿對照品適量，加流動相制成每1體積份中含0.00025重量份的溶液，即得；供試品溶液制備量取本發(fā)明藥物組合物制劑按日服用劑量計2.5體積份，置100ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得；測定法量取對照品溶液及供試品溶液各0.020體積份，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算；本發(fā)明藥物組合物制劑按日服用劑量計含苦參素以氧化苦參堿C15H24N2O2計，應(yīng)為0.009重量份～0.011重量份；
C黃芪照高效液相色譜法測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水＝32∶68為流動相；蒸發(fā)光散射檢測器；理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計算應(yīng)不低于4000；對照品溶液的制備稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1體積份含0.0002重量份的溶液，即得；供試品溶液的制備取本發(fā)明藥物組合物制劑100體積份，混勻，精密量取10體積份，于水浴上蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得；測定法吸取對照品溶液0.01體積份、0.02體積份及供試品溶液0.02體積份，注入液相色譜儀，測定，即得；本發(fā)明藥物組合物制劑按日服用劑量計黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.00004重量份。
5、一種由原料藥黃芪200-400重量份、人參60-130重量份、苦參素6-13重量份制成的藥物組合物制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于該方法包括如下步驟
鑒別
取本發(fā)明藥物組合物制劑20體積份，于水浴上蒸干，殘渣加甲醇5體積份使溶解，作為供試品溶液；另取人參對照藥材1重量份，加三氯甲烷40體積份，加熱回流1小時，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，加水0.5體積份攪拌濕潤，加水飽和正丁醇10體積份，超聲處理30分鐘，吸取上清液加3倍量氨試液，搖勻，放置分層，取上清液蒸干，殘渣加甲醇1體積份使溶解，作為對照藥材溶液；再取人參皂苷Re、Rg1對照品，分別加甲醇制成每1體積份含0.002重量份的對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述四種溶液各0.0018體積份，分別點于厚500μm同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水＝15∶40∶22∶10在10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，涼干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點；
含量測定
A人參照高效液相色譜法測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水＝19∶81為流動相；檢測波長為203nm；理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計算應(yīng)不低于3000；對照品溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品，加甲醇制成每1體積份各含0.00025重量份的混合溶液，搖勻，即得；供試品溶液的制備量取裝量差異項下的本發(fā)明藥物組合物制劑25體積份，置分液漏斗中，用三氯甲烷提取2次，每次20體積份，棄去三氯甲烷液，水液用水飽和正丁醇提取5次，每次20體積份，合并正丁醇液，用1％NaOH溶液洗滌3次，每次30體積份，棄去堿液，再用正丁醇飽和的水輕輕搖洗3次，每次30體積份，棄去水液，取正丁醇液蒸干；殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；測定法分別吸取對照品溶液與供試品溶液各0.01體積份，注入液相色譜儀，測定，即得；本發(fā)明藥物組合物制劑按日服用劑量計含人參皂苷Rg1(C42H72O14)和人參皂苷Re(C48H82O18)的總量不得少于0.00004重量份；
B苦參素照高效液相色譜法測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；1％磷酸溶液-乙腈＝93∶7為流動相，其中磷酸溶液用三乙胺調(diào)節(jié)PH值為2.5，檢測波長為220nm；理論板數(shù)按氧化苦參堿峰計算應(yīng)不低于2000，氧化苦參堿峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求；
對照品溶液的制備稱取氧化苦參堿對照品適量，加流動相制成每1體積份中含0.00025重量份的溶液，即得；供試品溶液制備量取本發(fā)明藥物組合物制劑按日服用劑量計2.5體積份，置100ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得；測定法量取對照品溶液及供試品溶液各0.020體積份，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算；本發(fā)明藥物組合物制劑按日服用劑量計含苦參素以氧化苦參堿C15H24N2O2計，應(yīng)為0.009重量份～0.011重量份；
C黃芪照高效液相色譜法測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水＝32∶68為流動相；蒸發(fā)光散射檢測器；理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計算應(yīng)不低于4000；對照品溶液的制備稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1體積份含0.0002重量份的溶液，即得；供試品溶液的制備取本發(fā)明藥物組合物制劑100體積份，混勻，精密量取10體積份，于水浴上蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得；測定法吸取對照品溶液0.01體積份、0.02體積份及供試品溶液0.02體積份，注入液相色譜儀，測定，即得；本發(fā)明藥物組合物制劑按日服用劑量計黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.00004重量份。
6、一種由原料藥黃芪200-400重量份、人參60-130重量份、苦參素6-13重量份制成的藥物組合物制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于該方法包括如下指紋圖譜測定中一種或幾種
A本發(fā)明藥物組合物制劑成品指紋圖譜檢測方法包括如下步驟
照高效液相色譜法色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A，以80％乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1體積份/min；參照物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品0.002～0.004重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得；供試品溶液的制備取本發(fā)明藥物組合物制劑作為供試品溶液；測定法取參照物溶液和供試品溶液各0.01～0.03體積份，注入高效液相色譜儀，記錄65min色譜；供試品指紋圖譜中與參照物人參皂苷Rg1相應(yīng)的峰為S峰，計算各共有峰相對保留時間；供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜有良好的相似性；
指紋圖譜應(yīng)有12個共有峰；
各序號特征峰的相對保留時間按分鐘計分別為1號峰為0.830、S峰為1.000、2號峰為1.100、3號峰為1.221、4號峰為1.294、5號峰為1.630、6號峰為1.738、7號峰為1.811、8號峰為1.848、9號峰為1.887、10號峰為2.015、11號峰為2.808；
各序號特征峰的峰面積比值分別為1號峰為0.105、S峰為1.000、2號峰為0.296、3號峰為2.244、4號峰為0.495、5號峰為0.131、6號峰為0.052、7號峰為0.031、8號峰為0.050、9號峰為0.055、10號峰為0.044、11號峰為0.019；
非共有峰面積不得過總峰面積的5％；
B本發(fā)明藥物組合物制劑中間體指紋圖譜檢測方法包括如下步驟
指紋圖譜照高效液相色譜法，結(jié)合指紋圖譜的要求進(jìn)行測定；色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗
用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A、80％乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0～5min 25％B\，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1體積份/min；參照物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品0.002～0.004重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得；供試品溶液的制備取1～3體積份中間體，用水稀釋至8～12體積份，作為供試品溶液；HPLC分析前用0.45μm水系濾膜過濾；測定法取參照物溶液和供試品溶液各0.01～0.03體積份，注入高效液相色譜儀，記錄65min色譜，以人參皂苷Rg1峰為參考峰S，計算各共有峰的相對保留時間；供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜有良好的相似性；
指紋圖譜應(yīng)有19個共有峰；
各序號特征峰的相對保留時間按分鐘計分別為1號峰為0.827、S峰為1.000、2號峰為1.100、3號峰為1.222、4號峰為1.296、5號峰為1.636、6號峰為1.744、7號峰為1.817、8號峰為1.855、9號峰為1.895、10號峰為2.024、11號峰為2.137、12號峰為2.375、13號峰為2.694、14號峰為2.837、15號峰為2.987、16號峰為3.382、17號峰為3.542、18號峰為3.643；
各序號特征峰的峰面積比值分別為1號峰為0.129、S峰為1.000、2號峰為0.209、3號峰為1.636、4號峰為0.542、5號峰為0.183、6號峰為0.158、7號峰為0.133、8號峰為0.099、9號峰為0.102、10號峰為0.050、11號峰為0.171、12號峰為0.185、13號峰為0.070、14號峰為0.059、15號峰為0.050、16號峰為0.060、17號峰為0.143、18號峰為0.063；
非共有峰面積不得過總峰面積的5％；
C人參藥材指紋圖譜檢測標(biāo)準(zhǔn)
指紋圖譜照高效液相色譜法；色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A，以80％乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min85％B，65～72min 85％～25％B；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1體積份/min；參照物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品0.002～0.004重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得；供試品溶液的制備藥材經(jīng)粉碎后過3號篩，取各批藥材粉末4～6重量份，精密稱定，置于250ml圓底燒瓶中，加40～60體積份75％乙醇，加熱回流30min，離心，取提取液，如此3～5次，合并提取液，旋蒸至干，用40～60體積份40％甲醇溶液溶解，離心，精密量取上清液1～3體積份，用40％甲醇溶液稀釋至8～12體積份，作為供試品溶液；HPLC分析前用0.45μm的有機系濾膜過濾；測定法取參照物溶液和供試品溶液各0.001～0.003體積份，注入高效液相色譜儀，記錄65min色譜；供試品指紋圖譜中與參照物相應(yīng)的峰為S峰，計算各共有峰相對保留時間；供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜有良好的相似性；
指紋圖譜應(yīng)有15個共有峰；
各序號特征峰的相對保留時間按分鐘計分別為1號峰為0.731、2號峰為0.824、S峰為1.000、3號峰為1.649、4號峰為1.699、5號峰為1.739、6號峰為1.828、7號峰為1.870、8號峰為1.925、9號峰為1.951、10號峰為2.000、11號峰為2.151、12號峰為3.031、13號峰為3.605、14號峰為3.875；
各序號特征峰的峰面積比值分別為1號峰為0.048、2號峰為0.108、S峰為1.000、3號峰為0.213、4號峰為0.078、5號峰為0.621、6號峰為0.409、7號峰為0.046、8號峰為0.243、9號峰為0.039、10號峰為0.027、11號峰為0.157、12號峰為0.027、13號峰為0.099、14號峰為0.257；
非共有峰面積不得過總峰面積的5％；
D黃芪藥材指紋圖譜檢測標(biāo)準(zhǔn)
指紋圖譜照高效液相色譜法；色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A，以80％乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1體積份/min；內(nèi)標(biāo)物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品0.002～0.004重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得；供試品溶液的制備黃芪切片經(jīng)粉碎后過3號篩，取黃芪粉末4～6重量份，加水40～60體積份，回流提取2～4小時，離心，取提取液，如此1～3次，合并提取液，濃縮至20～40體積份，加乙醇至含醇量為75％，4℃放置過夜，離心，上清液用75％乙醇定容至200～300體積份，取4～6體積份，加入0.4～0.6體積份內(nèi)標(biāo)物溶液，作為供試品溶液；HPLC分析前用0.45μm有機系濾膜過濾；測定法取內(nèi)標(biāo)物溶液和供試品溶液各0.01～0.03體積份，注入高效液相色譜儀，記錄65min色譜，分別以內(nèi)標(biāo)物人參皂苷Rg1峰S1和相對S1峰保留時間約為1.25的色譜峰為參考峰S，計算各共有峰的相對保留時間；供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜有良好的相似性；
指紋圖譜應(yīng)有12個共有峰；
各序號特征峰的相對保留時間1按分鐘計分別為S1號峰為1.000、1號峰為1.063、S峰為1.226、2號峰為1.344、3號峰為1.777、4號峰為2.157、5號峰為2.247、6號峰為2.292、7號峰為2.382、8號峰為3.085、9號峰為3.540、10號峰為3.603；
各序號特征峰的相對保留時間2按分鐘計分別為S1號峰為0.816、1號峰為0.867、S峰為1.000、2號峰為1.096、3號峰為1.449、4號峰為1.760、5號峰為1.833、6號峰為1.870、7號峰為1.943、8號峰為2.516、9號峰為2.888、10號峰為2.939；
各序號特征峰的峰面積比值分別為1號峰為0.385、S峰為1.000、2號峰為1.975、3號峰為0.090、4號峰為0.402、5號峰為0.049、6號峰為0.693、7號峰為1.064、8號峰為0.155、9號峰為0.043、10號峰為0.054；
非共有峰面積不得過總峰面積的10％。
7、一種由原料藥黃芪200-400重量份、人參60-130重量份、苦參素6-13重量份制成的藥物組合物制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于該方法包括如下步驟
鑒別
取本發(fā)明藥物組合物制劑20體積份，于水浴上蒸干，殘渣加甲醇5體積份使溶解，作為供試品溶液；另取人參對照藥材1重量份，加三氯甲烷40體積份，加熱回流1小時，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，加水0.5體積份攪拌濕潤，加水飽和正丁醇10體積份，超聲處理30分鐘，吸取上清液加3倍量氨試液，搖勻，放置分層，取上清液蒸干，殘渣加甲醇1體積份使溶解，作為對照藥材溶液；再取人參皂苷Re、Rg1對照品，分別加甲醇制成每1體積份含0.002重量份的對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述四種溶液各0.0018體積份，分別點于厚500μm同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水＝15∶40∶22∶10在10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，涼干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點；
含量測定
A人參照高效液相色譜法測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水＝19∶81為流動相；檢測波長為203nm；理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計算應(yīng)不低于3000；對照品溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品，加甲醇制成每1體積份各含0.00025重量份的混合溶液，搖勻，即得；供試品溶液的制備量取裝量差異項下的本發(fā)明藥物組合物制劑25體積份，置分液漏斗中，用三氯甲烷提取2次，每次20體積份，棄去三氯甲烷液，水液用水飽和正丁醇提取5次，每次20體積份，合并正丁醇液，用1％NaOH溶液洗滌3次，每次30體積份，棄去堿液，再用正丁醇飽和的水輕輕搖洗3次，每次30體積份，棄去水液，取正丁醇液蒸干；殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；測定法分別吸取對照品溶液與供試品溶液各0.01體積份，注入液相色譜儀，測定，即得；本發(fā)明藥物組合物制劑按日服用劑量計含人參皂苷Rg1(C42H72O14)和人參皂苷Re(C48H82O18)的總量不得少于0.00004重量份；
B苦參素照高效液相色譜法測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；1％磷酸溶液-乙腈＝93∶7為流動相，其中磷酸溶液用三乙胺調(diào)節(jié)PH值為2.5，檢測波長為220nm；理論板數(shù)按氧化苦參堿峰計算應(yīng)不低于2000，氧化苦參堿峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求；
對照品溶液的制備稱取氧化苦參堿對照品適量，加流動相制成每1體積份中含0.00025重量份的溶液，即得；供試品溶液制備量取本發(fā)明藥物組合物制劑按日服用劑量計2.5體積份，置100ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得；測定法量取對照品溶液及供試品溶液各0.020體積份，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算；本發(fā)明藥物組合物制劑按日服用劑量計含苦參素以氧化苦參堿C15H24N2O2計，應(yīng)為0.009重量份～0.011重量份；
C黃芪照高效液相色譜法測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水＝32∶68為流動相；蒸發(fā)光散射檢測器；理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計算應(yīng)不低于4000；對照品溶液的制備稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1體積份含0.0002重量份的溶液，即得；供試品溶液的制備取本發(fā)明藥物組合物制劑100體積份，混勻，精密量取10體積份，于水浴上蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得；測定法吸取對照品溶液0.01體積份、0.02體積份及供試品溶液0.02體積份，注入液相色譜儀，測定，即得；本發(fā)明藥物組合物制劑按日服用劑量計黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.00004重量份；
指紋圖譜檢測
A本發(fā)明藥物組合物制劑成品指紋圖譜檢測方法包括如下步驟
照高效液相色譜法色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A，以80％乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1體積份/min；參照物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得；供試品溶液的制備取本發(fā)明藥物組合物制劑作為供試品溶液；測定法取參照物溶液和供試品溶液各0.02體積份，注入高效液相色譜儀，記錄65min色譜；供試品指紋圖譜中與參照物人參皂苷Rg1相應(yīng)的峰為S峰，計算各共有峰相對保留時間；供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜有良好的相似性；
指紋圖譜應(yīng)有12個共有峰；
各序號特征峰的相對保留時間按分鐘計分別為1號峰為0.830、S峰為1.000、2號峰為1.100、3號峰為1.221、4號峰為1.294、5號峰為1.630、6號峰為1.738、7號峰為1.811、8號峰為1.848、9號峰為1.887、10號峰為2.015、11號峰為2.808；
各序號特征峰的峰面積比值分別為1號峰為0.105、S峰為1.000、2號峰為0.296、3號峰為2.244、4號峰為0.495、5號峰為0.131、6號峰為0.052、7號峰為0.031、8號峰為0.050、9號峰為0.055、10號峰為0.044、11號峰為0.019；
非共有峰面積不得過總峰面積的5％；
B本發(fā)明藥物組合物制劑中間體指紋圖譜檢測方法包括如下步驟
指紋圖譜照高效液相色譜法，結(jié)合指紋圖譜的要求進(jìn)行測定；色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗
用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A、80％乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0～5min 25％B\，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1體積份/min；參照物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得；供試品溶液的制備取2體積份中間體，用水稀釋至10體積份，作為供試品溶液；HPLC分析前用0.45μm水系濾膜過濾；測定法取參照物溶液和供試品溶液各0.02體積份，注入高效液相色譜儀，記錄65min色譜，以人參皂苷Rg1峰為參考峰S，計算各共有峰的相對保留時間；供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜有良好的相似性；
指紋圖譜應(yīng)有19個共有峰；
各序號特征峰的相對保留時間按分鐘計分別為1號峰為0.827、S峰為1.000、2號峰為1.100、3號峰為1.222、4號峰為1.296、5號峰為1.636、6號峰為1.744、7號峰為1.817、8號峰為1.855、9號峰為1.895、10號峰為2.024、11號峰為2.137、12號峰為2.375、13號峰為2.694、14號峰為2.837、15號峰為2.987、16號峰為3.382、17號峰為3.542、18號峰為3.643；
各序號特征峰的峰面積比值分別為1號峰為0.129、S峰為1.000、2號峰為0.209、3號峰為1.636、4號峰為0.542、5號峰為0.183、6號峰為0.158、7號峰為0.133、8號峰為0.099、9號峰為0.102、10號峰為0.050、11號峰為0.171、12號峰為0.185、13號峰為0.070、14號峰為0.059、15號峰為0.050、16號峰為0.060、17號峰為0.143、18號峰為0.063；
非共有峰面積不得過總峰面積的5％；
C人參藥材指紋圖譜檢測標(biāo)準(zhǔn)
指紋圖譜照高效液相色譜法；色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A，以80％乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1體積份/min；參照物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得；供試品溶液的制備藥材經(jīng)粉碎后過3號篩，取各批藥材粉末5重量份，精密稱定，置于250ml圓底燒瓶中，加50體積份75％乙醇，加熱回流30min，離心，取提取液，如此4次，合并提取液，旋蒸至干，用50體積份40％甲醇溶液溶解，離心，精密量取上清液2體積份，用40％甲醇溶液稀釋至10體積份，作為供試品溶液；HPLC分析前用0.45μm的有機系濾膜過濾；測定法取參照物溶液和供試品溶液各0.002體積份，注入高效液相色譜儀，記錄65min色譜；供試品指紋圖譜中與參照物相應(yīng)的峰為S峰，計算各共有峰相對保留時間；供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜有良好的相似性；
指紋圖譜應(yīng)有15個共有峰；
各序號特征峰的相對保留時間按分鐘計分別為1號峰為0.731、2號峰為0.824、S峰為1.000、3號峰為1.649、4號峰為1.699、5號峰為1.739、6號峰為1.828、7號峰為1.870、8號峰為1.925、9號峰為1.951、10號峰為2.000、11號峰為2.151、12號峰為3.031、13號峰為3.605、14號峰為3.875；
各序號特征峰的峰面積比值分別為1號峰為0.048、2號峰為0.108、S峰為1.000、3號峰為0.213、4號峰為0.078、5號峰為0.621、6號峰為0.409、7號峰為0.046、8號峰為0.243、9號峰為0.039、10號峰為0.027、11號峰為0.157、12號峰為0.027、13號峰為0.099、14號峰為0.257；
非共有峰面積不得過總峰面積的5％；
D黃芪藥材指紋圖譜檢測標(biāo)準(zhǔn)
指紋圖譜照高效液相色譜法；色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A，以80％乙腈溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；檢測波長203nm；柱溫35℃；流速1體積份/min；內(nèi)標(biāo)物溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1對照品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得；供試品溶液的制備黃芪切片經(jīng)粉碎后過3號篩，取黃芪粉末5重量份，加水50體積份，回流提取3小時，離心，取提取液，如此2次，合并提取液，濃縮至30體積份，加乙醇至含醇量為75％，4℃放置過夜，離心，上清液用75％乙醇定容至250體積份，取5體積份，加入0.5體積份內(nèi)標(biāo)物溶液，作為供試品溶液；HPLC分析前用0.45μm有機系濾膜過濾；測定法取內(nèi)標(biāo)物溶液和供試品溶液各0.02體積份，注入高效液相色譜儀，記錄65min色譜，分別以內(nèi)標(biāo)物人參皂苷Rg1峰S1和相對S1峰保留時間約為1.25的色譜峰為參考峰S，計算各共有峰的相對保留時間；供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜有良好的相似性；
指紋圖譜應(yīng)有12個共有峰；
各序號特征峰的相對保留時間1按分鐘計分別為S1號峰為1.000、1號峰為1.063、S峰為1.226、2號峰為1.344、3號峰為1.777、4號峰為2.157、5號峰為2.247、6號峰為2.292、7號峰為2.382、8號峰為3.085、9號峰為3.540、10號峰為3.603；
各序號特征峰的相對保留時間2按分鐘計分別為S1號峰為0.816、1號峰為0.867、S峰為1.000、2號峰為1.096、3號峰為1.449、4號峰為1.760、5號峰為1.833、6號峰為1.870、7號峰為1.943、8號峰為2.516、9號峰為2.888、10號峰為2.939；
各序號特征峰的峰面積比值分別為1號峰為0.385、S峰為1.000、2號峰為1.975、3號峰為0.090、4號峰為0.402、5號峰為0.049、6號峰為0.693、7號峰為1.064、8號峰為0.155、9號峰為0.043、10號峰為0.054；
非共有峰面積不得過總峰面積的10％。
8、如權(quán)利要求1-7任一所述的藥物組合物制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于其中該制劑的原料藥組成為
黃芪200-400重量份、人參60-130重量份、苦參素6-13重量份。
9、如權(quán)利要求8所述的藥物組合物制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于其中該制劑的原料藥組成為
黃芪250重量份、人參120重量份、苦參素8重量份；
黃芪350重量份、人參70重量份、苦參素12重量份；
或黃芪300重量份、人參100重量份、苦參素10重量份。
10、如權(quán)利要求1-7任一所述的藥物組合物制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于其中該制劑成品由如下方法制成
稱取以上三味原料藥，人參用70-80％的乙醇，回流提取2～3次，每次1～3小時，合并提取液，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.20的清膏，測定溫度為65℃，備用；黃芪加水煎煮2～3次，每次1～3小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.20的清膏，測定溫度為65℃，與人參清膏合并，加乙醇使含醇量達(dá)60～80％，用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，靜置12小時，取上清液，回收乙醇，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.15的清膏，測定溫度為65℃；再加乙醇使含醇量達(dá)70～90％，用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，靜置12小時，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，加注射用水到400體積份，用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，100℃滅菌30分鐘，冷藏，抽濾；用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，加活性炭適量，攪勻，煮沸15分鐘，濾過，濾液備用；另取苦參素溶解，用稀鹽酸調(diào)PH值至6～7，100℃滅菌30分鐘，冷藏，抽濾，與脫炭后的藥液合并，混勻，加注射用水至1000體積份，濾過，灌裝，即得。
11、如權(quán)利要求10所述的藥物組合物制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于其中該制劑成品由如下方法制成
稱取以上三味原料藥，人參用75％的乙醇，回流提取3次，每次2小時，合并提取液，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.20的清膏，測定溫度為65℃，備用；黃芪加水煎煮2次，每次2小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.20的清膏，測定溫度為65℃，與人參清膏合并，加乙醇使含醇量達(dá)75％，用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，靜置12小時，取上清液，回收乙醇，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.15的清膏，測定溫度為65℃；再加乙醇使含醇量達(dá)85％，用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，靜置，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，加注射用水到400體積份(按ml/g的比例)，用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，100℃滅菌30分鐘，冷藏，抽濾。用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，加活性炭適量，攪勻，煮沸15分鐘，濾過，濾液備用；另取苦參素溶解，用稀鹽酸調(diào)PH值至6～7，100℃滅菌30分鐘，冷藏，抽濾，與脫炭后的藥液合并，混勻，加注射用水至1000體積份(按ml/g的比例)，濾過，灌裝，即得。
12、如權(quán)利要求1-7任一所述的藥物組合物制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于其中該制劑中間體由如下方法制成
稱取以上三味原料藥，人參用70-80％的乙醇，回流提取2～3次，每次1～3小時，合并提取液，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.20的清膏，測定溫度為65℃，備用；黃芪加水煎煮2～3次，每次1～3小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.20的清膏，測定溫度為65℃，與人參清膏合并，加乙醇使含醇量達(dá)60～80％，用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，靜置，去上清液，回收乙醇，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.15的清膏，測定溫度為65℃；再加乙醇使含醇量達(dá)70～90％，用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，靜置，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，加注射用水到400體積份，用氫氧化鈉調(diào)PH值至6～7，加活性炭適量，攪勻，煮沸15分鐘，濾過，濾液備用；另取苦參素溶解，用稀鹽酸調(diào)PH值至6～7，100℃滅菌30分鐘，冷藏，抽濾，與脫炭后的藥液合并，混勻，即得中間體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療腫瘤的藥物組合物制劑的質(zhì)量控制方法，該制劑是由如下原料藥制成的黃芪200-400重量份，人參60-130重量份，苦參素6-13重量份。本發(fā)明藥物組合物制劑質(zhì)量控制方法包括對該制劑的鑒別和/或含量測定方法，還包括對該制劑成品及中間體的指紋圖譜質(zhì)量控制方法。本發(fā)明質(zhì)量控制方法過程中采用特定的方法處理供試液，或者采用特定的填充劑、流動相等，使最終得到的結(jié)果數(shù)據(jù)更確切，有效地控制了本發(fā)明藥物組合物制劑的質(zhì)量。
文檔編號G01N30/90GK101269113SQ200810097290
公開日2008年9月24日 申請日期2008年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月9日
發(fā)明者紅 翁, 張子安, 姜麗萍, 梅 楊, 李禹西, 馬松梅 申請人:李彥群