專(zhuān)利名稱(chēng)：：功夫菊酯殘留的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種功夫菊酯殘留的間接竟?fàn)幟嘎?lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒，主要適用于大批量水樣品中功夫菊酯殘留的快速測(cè)定。
背景技術(shù)：
：功夫菊酯是一種合成菊酯類(lèi)農(nóng)藥，廣泛的應(yīng)用于農(nóng)作物與畜舍的害蟲(chóng)殺滅與預(yù)防。在我國(guó)，功夫菊酯主要用于棉花、茶葉、果樹(shù)和蔬菜種植中。然而，功夫菊酯是一種高毒物質(zhì)，對(duì)于大鼠和小鼠的經(jīng)口半數(shù)致死量(LC5o)分別為79mg/Kg和56mg/Kg，而對(duì)于魚(yú)類(lèi)(LC50=0.078-2.3|ig/L)和水生的無(wú)脊稚動(dòng)物(LC50=0.0023-3.3|ig/L)的毒性更高。而且，功夫菊酯在環(huán)境中的殘留時(shí)間也比較長(zhǎng)，它在土壤，植物和脂肪組織中的半衰期分別為30、40和23天。并且有研究顯示功夫菊酯可以在魚(yú)類(lèi)的體內(nèi)累積，從而有可能影響人類(lèi)的健康。常用的功夫菊酯的分析方法主要有高壓液相色譜法，氣相色譜連接電子捕獲檢測(cè)器法和液質(zhì)聯(lián)用法。應(yīng)用這些理化分析技術(shù)對(duì)環(huán)境、生物、食品等樣品中痕量功夫菊酯殘留進(jìn)行分析，不僅儀器化程度要求較高，并且需要經(jīng)過(guò)繁復(fù)的分離、提取、凈化、衍生等前處理過(guò)程，分析速度慢、成本高，前處理過(guò)程需要使用大量的有機(jī)溶劑，又造成了新的環(huán)境污染。隨著待檢樣品、特別是要求現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)樣品量的迅速增加，傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留分析手段難以適應(yīng)要求，因此，迫切需要開(kāi)發(fā)和應(yīng)用高效率農(nóng)藥殘留快速分析技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容(一)要解決的技術(shù)問(wèn)題為了解決目前農(nóng)藥殘留儀器分析方法成本高和操作復(fù)雜以及快速檢測(cè)技術(shù)中特異性差、靈敏度低和檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種具有高特異性、高靈敏度、高準(zhǔn)確度、高精確度、操作方法簡(jiǎn)單，并能用于大批量樣品快速檢測(cè)的功夫菊酯殘留的間接竟?fàn)幟嘎?lián)免疫吸附分析試劑盒。(二)技術(shù)方案本發(fā)明試劑盒包括包被功夫菊酯抗原的酶標(biāo)板、濃縮洗滌液、功夫菊酯標(biāo)準(zhǔn)品、功夫菊酯特異性抗體、酶標(biāo)記物、底物顯色液和反應(yīng)終止液。其中，所述包被抗原是3-[(±)氰基[(±)-(順式)-3-[(Z型)-3-氯-4,4，4-三氟-1-乙基-2,2-二甲基]-環(huán)丙基羰基氧基]苯氧基]苯丙酸與載體蛋白的偶聯(lián)復(fù)合物，所述載體蛋白優(yōu)選為卵清蛋白。其中所述功夫菊酯特異性抗體是由3-[(±)氰基[(±)-(順式)-3-[(Z型)_3_氯_4，4，4-三氟-l-乙基-2，2-二甲基]-環(huán)丙基羰基氧基]苯氧基]苯丙酸與載體蛋白偶聯(lián)作為免疫原制備獲得，可以是通過(guò)雜交瘤方法制備得到的單克隆抗體，或者是直接免疫動(dòng)物得到的多克隆抗體。所述，載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白(BCG)、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血藍(lán)蛋白等常用載體蛋白，優(yōu)選為牛血清白蛋白；所述多克隆抗體可以是鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，優(yōu)選為兔源多克隆抗體。其中，包被抗原的酶標(biāo)板的制備過(guò)程中，所用包被液可以是0.05MpH9.6碳酸鈉緩沖液，所用封閉液是含1%明膠的上述包被液。其中，酶標(biāo)記物為酶標(biāo)二抗，標(biāo)記酶可以是辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶。其中，濃縮洗滌液的配方為每20mL蒸餾水中加入氯化鈉7~9g、磷酸二氫鉀0.1~0.3g、磷酸氫二鈉24g、氯化鉀36g、吐溫-200.5~3mL。濃縮洗滌液的濃度是正常使用時(shí)的50倍。當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶時(shí)，底物顯色液由A液和B液組成，顯色液A液為過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲，顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為12mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液。具體地說(shuō)，A液配方可為每1000mL水中加入過(guò)氧化脲lg，10.3g檸檬酸，35.8gNa2HPCV12H20,吐溫-20100pL，pH5;B液配方可為每1000mL蒸餾水中加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)700mg(40mLDMSO溶解)，10.3g梓檬酸，pH2.4-2.8。當(dāng)標(biāo)記酶為細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶時(shí)，底物顯色液為對(duì)硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為2mol/L的氫氧化鈉。本發(fā)明試劑盒的分析原理是當(dāng)酶標(biāo)板預(yù)包被抗原時(shí)，加入待測(cè)功夫菊酯樣品和多克隆抗體，固相包被抗原和待測(cè)功夫菊酯相互竟?fàn)幣c抗體反應(yīng)，由于每個(gè)孔中的固相抗原和加入的抗體含量均一致，所以當(dāng)待測(cè)的功夫菊酯濃度高時(shí)，則被結(jié)合在固相抗原上的抗體少，加入的酶標(biāo)二抗與被固定抗體結(jié)合量少，最后加入底物液和顯色液，顯色反應(yīng)淺，用酶標(biāo)儀檢測(cè)的OD值低，表明抑制率高；反之，當(dāng)待測(cè)功夫菊酯濃度低時(shí)，則所測(cè)的OD值高，抑制率低。根據(jù)用已知的功夫菊酯濃度檢測(cè)所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，可以推算出待測(cè)功夫菊酯的濃度。(三)有益效果本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)不同來(lái)源的水樣中功夫菊酯殘留，樣品的前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，能同時(shí)檢測(cè)大量的樣品，樣品檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的儀器檢測(cè)方法。本發(fā)明對(duì)解決大批量樣品的功夫菊酯殘留現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控技術(shù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。圖l功夫菊酯的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線(xiàn)。具體實(shí)施例方式下面實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l試劑盒操作及結(jié)果計(jì)算待測(cè)樣品經(jīng)前處理后，用含甲醇50。/。的PBS定容備用。拆開(kāi)真空包裝袋并取出酶標(biāo)板，在室溫下平衡5分鐘備用。配制Ong/mL,5ng/mL，10ng/mL，100ng/mL,1000ng/mL，10000ng/mL的功夫菊酯標(biāo)準(zhǔn)液，加入50pL標(biāo)樣或處理好的樣品到各孔中，標(biāo)樣和樣品做24個(gè)重復(fù)，加入50pL稀釋的抗體，37。C孵育30分鐘；倒出孔中的液體，用稀釋好的PBST洗26次，將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍干；加入按1:1000稀釋好的酶標(biāo)羊抗兔二抗100pL，37'C孵育30分鐘；倒出孔中的液體，用PBST洗板2-6次，拍干；取A液和B液等體積混勻，每孔加100pL,在暗處顯色10-15分鐘，每孔加入50pL的終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔在波長(zhǎng)為450nm處的OD值。將含0標(biāo)準(zhǔn)液孔的OD值減去含最大濃度標(biāo)準(zhǔn)液孔的OD值定為Bo，其余孔經(jīng)同樣方法校正后的OD值定為B;以B/Bo值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度的log值為橫坐標(biāo)，繪制功夫菊酯標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線(xiàn)(附圖1)。其中，曲線(xiàn)回歸方程為Y=-0.448X+1.201,R2=0.993，,抑制中濃度IC50=37^ig/L,最低檢測(cè)限IC10=4.7嗎/L。實(shí)施例2半抗原3-[(±)氰基[(±)-(cis)-3-[(Z)-3-氯-4，4，4-三氟-l-乙基-2，2-二甲基環(huán)丙基羰基氧沐氧基]苯丙酸的合成4-羥基苯丙酸苯甲酯的合成250mL三口瓶中加入14.4g對(duì)羥基苯丙酸,27mL節(jié)醇，15mL甲苯，滴入4滴85。/。的H3P04，回流，分水，反應(yīng)需10h。蒸餾除去過(guò)量甲苯，減壓蒸去芐醇，殘余物溶于乙醚中，分別用飽和NaHC03溶液、水洗滌三次。無(wú)水MgS04干燥，蒸去低沸物，減壓蒸餾。收集234-236°C(4mmHg)餾分，得無(wú)色粘液4-羥基苯丙酸苯甲酯16.1g,收率72.5%。1-澳-3-(二甲氧基甲基)苯的合成18.5g間溴苯甲醛，12.2g甲酸三甲酯，15mL甲醇于250mL三口瓶中，滴入2滴濃H2S04，常溫?cái)嚢?h。混合物用乙醚稀釋?zhuān)謩e用飽和Na2C03溶液、水洗滌三次。無(wú)水MgS04干燥，蒸去低沸物，減壓蒸餾。收集102-104。C(6mmHg)餾分，得無(wú)色液體l-溴-3-(二甲氧基甲基)苯13.5g,收率57.9%。4-(3-甲醛苯氧基)苯丙酸苯甲酯的合成100mL三口瓶中，加入5.0g4-羥基苯丙酸苯甲酯，30mL無(wú)水DFM，冰浴到5'C以下，分批加入NaH(50%)1.0g，加完后撤去冰浴，加入2.7gl-溴-3-(二甲氧基甲基)苯，1.8gCu2Cl2,0.9g銅粉，4.8mL吡啶，回流反應(yīng)8h,停止反應(yīng)，冷卻，用150mL乙酸乙酯稀釋?zhuān)?0%HC1洗滌三次，加入10%HC110mL振蕩2h，水洗三次，分出有機(jī)層，干燥，脫溶，柱層析，得4-(3-甲醛苯氧基)苯丙酸苯甲酯1.27g，收率30.2%。3-[3-[氰基(羥基)甲基苯氧基]苯丙酸苯甲酯的合成50mL三口瓶中，加入1.5gKCN，4mL水，攪拌溶解，冰洛到5。C以下。加入4-(3-甲醛苯氧基)苯丙酸苯甲酯1.27g，THF(四氫呋喃)16mL,緩慢滴加40。/。H2SO44mL。滴完后，5°C以下反應(yīng)30min。停止反應(yīng)，用乙醚萃取三次，合并有機(jī)層，干燥，脫溶，得3-[3-[氰基(羥基)甲基]苯氧基]苯丙酸苯甲酯1.05g，收率76.6%。3-[(±)氟基[(±)國(guó)(cis)畫(huà)3畫(huà)[(Z)-3國(guó)氯畫(huà)4，4，4-三氟國(guó)l-乙基-2，2-二甲基]環(huán)丙基羰基氧沐氧基l苯丙酸苯甲酯的合成50mL三口瓶中，加入2.38g3-[3-[氰基(羥基)甲基]苯氧基]苯丙酸苯甲酯，15mLCH2C12,1.34g功夫菊酸((±)隱(^)誦3國(guó)[(2)國(guó)3-氯-4,4,4-三氟-l-乙基-2,2-二甲基]環(huán)丙基甲酸)，冰洛下滴加溶有1.26gDCC的15mLCH2Cl2,滴加完畢后停止發(fā)應(yīng)。脫溶，柱層析得3-[(±)氰基[(±)-(cis)-3-[(Z)-3-氯-4，4，4-三氟-l-乙基-2,2-二甲基]環(huán)丙基羰基氧]苯氧基]苯丙酸苯甲酯(Cwb-5)2.54g，收率75.1%。3-[(±)氟基[(±)-(cis)國(guó)3國(guó)(Z)-3畫(huà)氯畫(huà)4，4，4-三氟-l-乙基-2，2隱二甲基]環(huán)丙基羰基氧1苯氧基苯丙酸的合成50mL三口瓶中，加入2.38g3-[(±)氰基[(±)-(cis)-3-[(Z)-3畫(huà)氯_4,4，4-三氟-1-乙基-2，2-二甲基]環(huán)丙基羰基氧]苯氧基]苯丙酸苯甲酯，CH2Cl210mL,Me3SiZ0.4mL，N2保護(hù)下，35。C反應(yīng)2h。大板層析分離得3-[(±)氰基[(±)畫(huà)(cis)-3-[(Z)國(guó)3-氯-4,4,4-三氟-l-乙基-2,2-二甲基]環(huán)丙基羰基氧]苯氧基]苯丙酸0.93g，收率76.2%。實(shí)施例3功夫菊酯多克隆抗體制備以活性酯法將半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)，稱(chēng)2mg偶聯(lián)物溶于lmL生理鹽水中，和lmL完全弗氏佐劑混合，充分乳化后注射新西蘭大耳白兔大腿，以后每隔兩周加強(qiáng)免疫一次，換用不完全弗氏佐劑與免疫原混合，免疫部位為頸背部皮下，從第三次免疫開(kāi)始，每次免疫后一周從兔耳靜脈釆血檢測(cè)血清效價(jià)?？偣裁庖?次，最后一次免疫后一周從兔頸動(dòng)脈采全血，用35%的飽和硫酸銨鹽析法粗提兔抗血清，最后用DE-52陰離子交換層析法進(jìn)一步純化，獲得較純的功夫菊酯多克隆抗體。DE-52陰離子交換純化抗體(1)DE-52預(yù)處理以lmg粗IgG需5g濕重纖維素計(jì)算，稱(chēng)適量DE-52加0.5mol/LNaOH浸泡30min,蒸餾水反復(fù)洗至中性；接著用0.5mol/LHCl浸泡30min，蒸餾水反復(fù)洗至中性；再用0.5mol/LNaOH浸泡30min，蒸餾水反復(fù)洗至中性，最后用0.01mol/L、pH7.4的PBS充分平衡過(guò)夜。(2)裝柱裝柱前用真空泵抽去DE-52溶液中的氣泡，裝柱過(guò)程中不能產(chǎn)生氣泡，上樣前柱床用0.01mol/L、pH7.4的PBS平衡。(3)上樣用46mL的PBS將適量的粗IgG稀釋?zhuān)缓笱刂劬徛釉谥采媳砻?，待樣品進(jìn)入柱床后開(kāi)始洗脫。(4)洗脫以0.01mol/L、pH7.4的PBS作洗脫液，流速0.5mL/min，收集第一和第二吸收峰。(5)收集液冷凍干燥，4'C保存。實(shí)施例4酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液(0.05MpH9.6碳酸鈉緩沖液)將功夫菊酯抗原稀釋成l嗎/mL，每孔加入100iiL,37。C溫育2h并4'C過(guò)夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150-200pL封閉液，37。C溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。實(shí)施例5功夫菊酯殘留分析酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒的組建本例中，試劑盒包含如下部分(1)包被了功夫菊酯抗原的酶標(biāo)板(2)海綿支架(3)功夫菊酯標(biāo)準(zhǔn)品(4)功夫菊酯多克隆抗體(5)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體(6)濃縮洗滌液配方為氯化鈉8g、磷酸二氫鉀0,2g、磷酸氫二鈉3g、氯化鉀5g、吐溫-202mL、蒸餾水20mL。(7)顯色液A液配方過(guò)氧化脲lg,10.3g檸檬酸，35.8gNa2HP04'12H20,吐溫-20100pL，蒸餾水1000mL，pH5。(8)顯色液B液配方四甲基聯(lián)苯胺(TMB)700mg(40rnLDMSO溶解)，10.3g杼檬酸，蒸餾水1000mL,pH2.5。實(shí)施例6試劑盒特異性實(shí)驗(yàn)選擇常用II型菊酯類(lèi)農(nóng)藥氰戊菊酯(fenvelerate)、甲氰菊酯(fenpropathrin)、溴氰菊酉旨(deltmethrin)、氟胺氰菊酯(fluvalinate)和氯氰菊酯(cypermethrin)為待測(cè)物，測(cè)得各種物質(zhì)的抑制中濃度(IC5C)，再用下式計(jì)算抗體對(duì)這些物質(zhì)的交叉反應(yīng)性；交叉反應(yīng)率愈小，則抗體對(duì)功夫菊酯的特異性愈強(qiáng)，反之則抗體的特異性差。交叉反應(yīng)(CR%)=105()(功夫菊酯)/1(:5()(供試物^100°/0。實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表l,采用間接ELISA法，多克隆抗體對(duì)常用11型菊酯類(lèi)農(nóng)藥的交叉反應(yīng)均小于3%，說(shuō)明該試劑盒的特異性好,可保證對(duì)樣品中功夫菊酯殘留測(cè)定結(jié)果的可靠性。表l交叉反應(yīng)Tab1CrossReactivitiesofIndirectELISAKit<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>ni:所用被測(cè)物濃度為10mg/L時(shí)，抑制率小于10%實(shí)施例7回收試驗(yàn)供試的自來(lái)水與井水水樣采自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)，河水水樣采自北京巿小清河。添加功夫菊酯的來(lái)源不同的水樣進(jìn)行不同的前處理后進(jìn)行酶聯(lián)免疫測(cè)定分析，結(jié)果見(jiàn)表2。表2水樣中功夫菊酯的添加回收率Table2Recoveryofcyhalothrinfromthespikedwatersamplesbypretreatment樣品添加量理論測(cè)定值實(shí)際測(cè)定值回收率AnalyteSpikedTheoreticalMeasured(ppb)Recovery(mean±(n=4)(ppm)(ppb)(mean±S.E.)S.E.)%自來(lái)水0.054.75±0.395±6Tapwater0.22019.6±1.698±80.55048.5±2.097±4井水0.055±0.4100±8Wellwater0.22019.6±2.298±110.55048.5±1.597±3河水0.255.7±0.25114±5Riverwater12021.6±1.0108±52.55055.5±3.5111±71權(quán)利要求1.一種檢測(cè)功夫菊酯殘留的酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒，包括包被功夫菊酯抗原的酶標(biāo)板、濃縮洗滌液、功夫菊酯標(biāo)準(zhǔn)品、功夫菊酯特異性抗體、酶標(biāo)記物、底物顯色液和反應(yīng)終止液。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于制備功夫菊酯特異性抗體的免疫原為3-[(士)氰基[(士)-(順式)-3-[(Z型)-3-氯-4，4，4-三氟-l-乙基-2，2-二甲基]-環(huán)丙基羰基氧基]苯氧基]苯丙酸與載體蛋白的偶聯(lián)復(fù)合物。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述功夫菊酯抗原為3-[(±)氰基[(±)-(順式)-3-[(2型)-3-氯-4，4，4-三氟-1-乙基-2，2-二甲基]-環(huán)丙基羰基氧基]苯氧基]苯丙酸與載體蛋白的偶聯(lián)復(fù)合物。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記二抗。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述的濃縮洗滌液的配方為每20mL蒸餾水中加入有氯化鈉79g、磷酸二氫鉀0.1~0.3g、磷酸氫二鈉24g、氯化鉀36g、吐溫-200.53mL。6.根據(jù)權(quán)利要求l或2所述的試劑盒，其特征在于，當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶時(shí)，底物顯色液包括A液和B液，所述A液為過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲、所述B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺、終止液為1~2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶為細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶時(shí)，底物顯色液為對(duì)硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為2mol/L的氫氧化鈉。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述A液配方為每lOOOmL水中加入過(guò)氧化脲lg，10.3g檸檬酸，35.8gNa2HP(V12H20，吐溫-20100pL,pH5;所述B液配方為每1000mL蒸餾水中加入四甲基聯(lián)苯胺700mg,10.3g杼檬酸，pH2.4-2.6。8.權(quán)利要求17任一項(xiàng)所述試劑盒在檢測(cè)功夫菊酯殘留中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了一種適用于功夫菊酯殘留檢測(cè)的酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒，包括包被功夫菊酯抗原的酶標(biāo)板、濃縮洗滌液、功夫菊酯標(biāo)準(zhǔn)品、功夫菊酯特異性抗體、酶標(biāo)記物、底物顯色液和反應(yīng)終止液。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)水中功夫菊酯殘留，樣品的前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，能同時(shí)檢測(cè)大量的樣品，樣品檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的儀器檢測(cè)方法。文檔編號(hào)G01N33/543GK101526526SQ20081010154公開(kāi)日2009年9月9日申請(qǐng)日期2008年3月7日優(yōu)先權(quán)日2008年3月7日發(fā)明者季李,艇許,高宏斌申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)