專利名稱：一種適用于五氯硝基苯殘留分析的elisa試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒，具體地說， 涉及一種適用于五氯硝基苯殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
五氯硝基苯(PCNB)主要用作拌種劑和土壤消毒劑，用于防治棉 花苗期病害、麥類黑穗病以及蔬菜和果木的多種病害。在中草藥的栽 培過程中使用量很大，尤其是作為防治人參病害的藥劑在國內(nèi)外廣泛 使用。五氯硝基苯主要損害心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝、腎和造 血系統(tǒng)。我國強制性國家標準規(guī)定在蔬菜和原糧中五氯硝基苯的最高 殘留限量分別是0.2和0.1mg/kg，歐盟于2001年1月開始禁用五氯 硝基苯。
五氯硝基苯的常規(guī)檢測方法包括氣相色譜、高效液相色譜等，應(yīng) 用這些理化分析技術(shù)對環(huán)境、生物、食品等樣品中痕量五氯硝基苯殘 留進行分析，不僅儀器化程度要求較高，并且需要經(jīng)過繁復(fù)的分離、 提取、凈化、衍生等前處理過程，分析速度慢、成本高，前處理過程 需要使用大量的有機溶劑，又造成了新的環(huán)境污染。隨著待檢樣品、 特別是要求現(xiàn)場快速檢測樣品量的迅速增加，傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留分析手 段難以適應(yīng)要求，因此，迫切需要開發(fā)和應(yīng)用高效率農(nóng)藥殘留快速分 析技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題
針對上述不足，本發(fā)明提供一種具有高特異性、高靈敏度、高準 確度、高精確度、操作方法簡單的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，用于環(huán) 境中五氯硝基苯殘留的批量、快速檢測。(二)技術(shù)方案
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種五氯硝基苯殘留分析酶聯(lián)免 疫吸附檢測試劑盒，該試劑盒包括包被了五氯硝基苯包被抗原的酶標 板、濃縮洗滌液、五氯硝基苯標準品、五氯硝基苯特異性抗體、酶標 記物、底物顯色液、反應(yīng)終止液。
其中，五氯硝基苯抗體的制備過程中所用的免疫原是五氯硝基苯 半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)復(fù)合物，所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲
狀腺蛋白(BCG)、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵 清蛋白或血藍蛋白等常用載體蛋白，優(yōu)選為牛血清白蛋白；所述多克 隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，優(yōu)選為兔源多克 隆抗體。
其中，包被了五氯硝基苯包被抗原的酶標板的制備過程中，所用 的包被抗原是五氯硝基苯半抗原與卵清蛋白的偶聯(lián)復(fù)合物，所用包被 液可以是0.05 MpH 9.6碳酸鈉緩沖液，所用封閉液是含1%明膠的 上述包被液。
其中，酶標記物為酶標二抗，標記酶可以是辣根過氧化物酶或堿 性磷酸酶。
其中，濃縮洗滌液的配方為每20mL蒸餾水中加入氯化鈉7~9g、 磷酸二氫鉀0.1~0.3g、磷酸氫二鈉2~4g、氯化鉀3~6g、吐溫-20 0.5~3mL。濃縮洗滌液的濃度是正常使用時的50倍。
當標記酶為辣根過氧化物酶時，底物顯色液由A液和B液組成， 顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，顯色液B液為鄰苯二胺或四甲 基聯(lián)苯胺，終止液為1-2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液。具體地說，A 液配方可為每lOOOmL水中加入過氧化脲lg，10.3g檸檬酸，35.8gNa2 HP04'12 H20,吐溫-20 100pL, pH5; B液配方可為每1000mL蒸餾 水中加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 700mg (仰mLDMSO溶解)，l(Ug才寧檬 酸，pH2.4-2.6。當標記酶為細菌提取堿性轔酸酯酶時，底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為2mol/L的氫氧化鈉。 本發(fā)明試劑盒的分析原理是
當酶標板預(yù)包被抗原時，加入待測五氯硝基苯樣品和五氯硝基苯 多克隆抗體后，固相包被抗原和待測五氯硝基苯相互竟爭與抗體反 應(yīng)，由于每個孔中的固相抗原和加入的抗體含量均一致，所以當待測 的五氯硝基苯濃度高時，則被結(jié)合在固相抗原上的抗體少，加入的酶 標二抗與被固定抗體結(jié)合量少，用洗滌液洗滌后加入底物顯色液，顯 色反應(yīng)淺，用酶標儀檢測的OD值低，表明抑制率高；反之，當待測 五氯硝基苯濃度低時，則所測的OD值高，抑制率低。根據(jù)用已知的 五氯硝基苯濃度檢測所作的標準曲線，可以推算出待測五氯硝基苯的 濃度。
(三)有益效果
本發(fā)明的優(yōu)點是能準確靈敏地檢測環(huán)境中的五氯硝基苯殘留，樣 品的前處理過程簡單，耗時少，能同時檢測大量的樣品，樣品檢測成 本遠低于傳統(tǒng)的儀器檢測方法。本發(fā)明對解決大批量樣品的五氯硝基 苯殘留現(xiàn)場監(jiān)控技術(shù)具有重要的現(xiàn)實意義。
具體實施例方式
以下實施例用于對本發(fā)明的進一步說明，但不用來限制本發(fā)明所 要保護的范圍。
實施例l試劑盒操作及結(jié)果計算
待測樣品經(jīng)前處理后，用PBST定容備用。拆開真空包裝袋并取 出酶標板，在室溫下平衡5分鐘備用。配制0ng/mL, 10 ng/mL， 50 ng/mL, 100 ng/mL， 500ng/mL, 2000ng/mL的五氯硝基苯標準液， 加入50pL標樣或處理好的樣品到各孔中，標樣和樣品做4個重復(fù)， 加入50pL稀釋的抗體，37'C孵育30分鐘；倒出孔中的液體，用稀釋 好的PBST洗5次，將酶標板倒置在吸水紙上拍干；加入按1:1000稀釋好的酶標羊抗兔二抗IO(VL， 37'C孵育30分鐘；倒出孔中的液 體，用PBST洗板5次，拍干；取A液和B液等體積混勻，每孔加 IOOjiL,在37。C顯色30分鐘，每孔加入5(V1的終止液終止反應(yīng)，酶 標儀上測定各孔在波長為450nm處的OD值。
將含0 ng/mL標準品孔的OD值減去含最大濃度標準品孔的OD 值定為B。，其余孔經(jīng)同樣方法校正后的OD值定為B;以B/B。值為 縱坐標，相應(yīng)標準品濃度的log值為橫坐標，繪制五氯硝基苯標準抑 制曲線。根據(jù)曲線的回歸方程可以求出對應(yīng)樣品的濃度，也可以求出 五氯硝基苯抑制中濃度IC50 ( B/B0=50% )及最小檢測限IC20 (B/B0=80%)。其中，抑制中濃度IC5『37ng/ml，最低檢測限1<:20= 7.2 ng/ml。
實施例2半抗原的合成
稱取2g五氯酴(pentachlorophenol, PCP )和lgK2C03溶于30rnL 丙酮中，加入到反應(yīng)器中，在氮氣的保護下，加入1.14g溴丙酸，加 溫回流反應(yīng)2個小時，再加入0.5g溴丙酸，保持以上條件不變反應(yīng) 過夜(反應(yīng)生成的氣體通入NaOH吸收瓶吸收)。減壓蒸除有機溶劑， 剩余物質(zhì)用濃鹽酸和二氯甲烷分開，棄掉無機相，有機相用無水 Na2S04干燥，減壓蒸除有機溶劑后，用硅膠柱層析凈化即得到所需 半抗原粗產(chǎn)品。收率50%。
實施例3五氯硝基苯多克隆抗體制備
以活性酯法將半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)，稱2mg偶聯(lián)物溶于 lmL生理鹽水中，和lmL完全弗氏佐劑混合，充分乳化后注射新西 蘭大耳白兔大腿，以后每隔兩周加強免疫一次，換用不完全弗氏佐劑 與免疫原混合，免疫部位為頸背部皮下，從第三次免疫開始，每次免 疫后一周從兔耳靜脈釆血檢測血清效價?？偣裁庖?次，最后一次免 疫后一周從兔頸動脈釆全血，用35%的飽和硫酸銨鹽析法粗提兔抗血 清，最后用DE-52陰離子交換層析法進一步純化，獲得較純的五氯硝基苯多克隆抗體。
DE-52陰離子交換純化抗體
(1) DE-52預(yù)處理以lmg粗IgG需5g濕重纖維素計算，稱 適量DE-52加0.5mol/LNaOH浸泡30min,蒸餾水反復(fù)洗至中性；接 著用0.5mol/LHCl浸泡30min ,蒸餾水反復(fù)洗至中性；再用 0.5mol/LNaOH浸泡30min,蒸餾水反復(fù)洗至中性，最后用O.01mol/L、 pH7.4的PBS充分平衡過夜。
(2) 裝柱裝柱前用真空泵抽去DE-52溶液中的氣泡，裝柱過 程中不能產(chǎn)生氣泡，上樣前柱床用O.01mol/L、 pH7.4的PBS平衡。
(3) 上樣用4-6mL的PBS將適量的粗IgG稀釋，然后沿柱
臂緩慢加在柱床上表面，待樣品進入柱床后開始洗脫。
(4 )洗脫以O(shè).01mol/L、 pH7.4的PBS作洗脫液，流速0.5mL/min，
收集第一和第二吸收峰。
(5)收集液冷凍干燥，4'C保存。
實施例4酶標板的制備
用包被緩沖液(0.05 MpH 9.6碳酸鈉緩沖液)將五氯硝基苯抗 原稀釋成lpg/mL,每孔加入100^iL, 37t:溫育2h并4。C過夜，傾去 包被液，用洗滌液洗滌3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入 150-200jiL封閉液，37'C溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空 密封保存。
實施例5五氯硝基苯殘留分析酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒的組建 本例中，試劑盒包含如下部分
(1) 包被了五氯硝基苯抗原的酶標板
(2) 海綿支架
(3 ) lmg/mL五氯硝基苯標準品
(4) 五氯硝基苯多克隆抗體
(5) 辣根過氧化酶標記羊抗兔抗體
7(6)濃縮洗滌液配方為氯化鈉8g、磷酸二氫鉀0,2g、磷酸氫 二鈉3g、氯化鉀5g、吐溫-20 2mL、蒸餾水20mL。
(7) 顯色液A液配方過氧化脲lg， 10.3g檸檬酸，35.8g Na2 HP0412H20,吐溫-20 100pL，蒸餾水1000 mL， pH5。
(8) 顯色液B液配方四甲基聯(lián)苯胺(TMB)700mg(40mLDMSO 溶解)，10.3g杼檬酸，蒸餾水1000 mL， pH2.5。
實施例6試劑盒特異性實驗
使用實施例5中的試劑盒，進行實驗。選擇五氯硝基苯的結(jié)構(gòu)類 似物五氯酚、六氯苯、2, 4-D、五氯酚乙酯、PCB、半抗原、甲酯化 半抗原作為待測物，測得各種物質(zhì)的抑制中濃度(IC5。)，再用下式計 算抗體對這些物質(zhì)的交叉反應(yīng)性；交叉反應(yīng)率愈小，則抗體對五氯硝 基苯的特異性愈強，反之則抗體的特異性差。
交叉反應(yīng)(CR%) 4C5o(五氯硝基苯)/IC5()(供試物)xl00。/0。
實驗測定結(jié)果見表l，采用間接ELISA法，多克隆抗體對與五氯 硝基苯結(jié)構(gòu)類似物存在一定的交叉反應(yīng)，多克隆抗體對六氯苯的交叉 反應(yīng)較大為12%，而對合成半抗原的原料五氯酚(PCP)的交叉反應(yīng) 較小。半抗原、甲酯化半抗原、酯化的PCP的交叉反應(yīng)分別是230M、 15%和8%，但這些物質(zhì)在自然界中不存在，抗體不會受到上述物質(zhì) 的干擾。而對其它結(jié)構(gòu)相近或相似物質(zhì)則均無明顯的交叉反應(yīng)。說明 該試劑盒的特異性好，可保證對樣品中五氯硝基苯殘留測定結(jié)果的可 靠性。
表1交叉反應(yīng)
Table 1 Cross Reactivities of Indirect ELISA Kit
化合物名稱交叉反應(yīng)
(%)
五氯硝基苯100
半抗原230
甲酯化半抗原15
五氯酴3六氯苯 12
2, 4-D <2 五氯酚乙酯 8 PCB (42)_<1.5
實施例7回收試驗
使用實施例5中的試劑盒，進行實驗。井水、河水、土壤添加五 氯硝基苯后，用試劑盒測定其含量，結(jié)果見表2。
表2井水、河水、土壤中添加五氯硝基苯的ELISA測定結(jié)果
樣品添加濃度 (ppb)回收率(％)
50088
井水10087
1090
50085
河水10081
1080
土壤20079
9
權(quán)利要求
1.一種適用于五氯硝基苯殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，包括包被五氯硝基苯抗原的酶標板、濃縮洗滌液、五氯硝基苯標準品、五氯硝基苯特異性抗體、酶標記物、底物顯色液和反應(yīng)終止液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，其中，五氯 硝基苯抗體在制備過程中所用的免疫原是五氯硝基苯半抗原與載體 蛋白BSA的偶聯(lián)復(fù)合物；所述五氯硝基苯抗原是五氯硝基苯與載體 蛋白OVA的偶聯(lián)復(fù)合物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其中，所述 酶標記物是酶標二抗。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其中，所述酶標 二抗為辣根過氧化物酶標記羊抗兔抗體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，其中， 濃縮洗滌液的配方為每20mL蒸餾水中加入氯化鈉7~9g、磷酸二氫 鉀0.1 0.3g、磷酸氫二鈉2 4g、氯化鉀3 6g、吐溫-20 0.5 3mL。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，其特征 在于，當標記酶為辣根過氧化物酶時，顯色液包括A液和B液，所 述A液為過氧化氫或過氧化脲、所述B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯 胺、終止液為1 2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當標記酶為細菌提取 堿性嫌酸酯酶時，底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為 2mol/L的氫氧化鈉。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，其中，所述 A液配方為每1000mL水中加入過氧化脲lg， 10.3g檸檬酸，35.8gNa2 HP04.12H20，吐溫-20 100pL， pH5;所述B液配方為每1000mL蒸 餾水中加入四甲基聯(lián)苯胺700mg， 10.3g檸檬酸，pH2.4-2.8。
8. 權(quán)利要求1 7任一項所述的檢測試劑盒在檢測五氯硝基苯殘留 中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種適用于五氯硝基苯殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，包括包被了五氯硝基苯包被抗原的酶標板、濃縮洗滌液、五氯硝基苯標準品、五氯硝基苯多克隆抗體、酶標二抗、顯色液、反應(yīng)終止液。檢測已知濃度的五氯硝基苯并繪制標準曲線，可以推算出待測五氯硝基苯的濃度。本發(fā)明的優(yōu)點是能準確靈敏地檢測環(huán)境中的五氯硝基苯殘留，樣品的前處理過程簡單，耗時少，能同時檢測大量的樣品，樣品檢測成本遠低于傳統(tǒng)的儀器檢測方法。
文檔編號G01N33/53GK101526527SQ20081010155
公開日2009年9月9日 申請日期2008年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月7日
發(fā)明者季 李, 艇 許, 邵曉龍 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)