專利名稱：：層粘連蛋白化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種層粘連蛋白(LN)生物素-親和素免疫放大技術(shù)結(jié)合化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)測定試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：肝纖維化是肝硬化的前期病理階段，是肝臟受到慢性損傷時，細胞外基質(zhì)可逆性沉積的創(chuàng)傷愈合過程，許多慢性肝臟疾病均可引起纖維化。目前肝纖維化主要的診斷方法包括影像學(xué)診斷、病理診斷和血清學(xué)診斷三種。影像學(xué)診斷在臨床上應(yīng)用廣泛，但只能在肝纖維化晚期發(fā)生肝硬化和門脈高壓癥時才能出現(xiàn)異常圖象。而肝纖維化的診斷金指標-肝組織活檢，由于所取標本量較少，以及肝臟病變的不均一性，會導(dǎo)致取樣誤差。鑒于影像學(xué)和病理診斷的局限性，人們經(jīng)過試驗和病例研究發(fā)現(xiàn)，透明質(zhì)酸(HA)、iv型膠原(civ)、m型前膠原肽(pnip)和層粘連蛋白(LN)等血清學(xué)指標對肝纖維化的診斷有一定價值。并且肝纖維化是一個慢性的漸進性的過程，血清學(xué)檢測更有利于對組織肝纖維化的動態(tài)觀察。正常肝臟間質(zhì)層粘連蛋白含量較少，但在肝纖維化和肝硬化時，肌成纖維細胞增多，大量合成和分泌膠原、層粘連蛋白等間質(zhì)成分形成完整的基底膜(肝竇毛細血管化)。層粘連蛋白與纖維化程度和門脈高壓正相關(guān)，在纖維化后期升高尤為顯著，因此可以反映肝纖維化的進展與嚴重程度。近十年來標記免疫分析技術(shù)的研究和應(yīng)用發(fā)展迅速，已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論研究及臨床疾病診斷各領(lǐng)域。其中技術(shù)工藝成熟，具有先進性且實用性強，易于推廣的主要有放射免疫分析、酶免疫分析、時間分辨熒光免疫分析和化學(xué)發(fā)光免疫分析等四種。這些超微量檢測技術(shù)的基本理論大體相同，但是所用示蹤劑及所發(fā)出的信號各不相同。根據(jù)大量的試驗結(jié)果及臨床應(yīng)用資料，從實用性、穩(wěn)定性、準確性及發(fā)展前景來看，依次為化學(xué)發(fā)光免疫分析、時間分辨熒光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。目前層粘連蛋白檢測方法主要有放射免疫分析法，酶聯(lián)免疫吸附層析和時間分辨熒光免疫分析方法等，以酶聯(lián)免疫吸附層析方法最為普及。放射免疫分析法存在諸多缺點，如操作復(fù)雜、測定結(jié)果不穩(wěn)定、試劑保存時間短、放射性污染、儀器昂貴等，時間分辨熒光免疫分析方法也需要稀有金屬進行標記，而采用化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的產(chǎn)品較少。生物素-親和素免疫放大技術(shù)可極大地提高檢測方法的靈敏度，且特異性強，穩(wěn)定性高，適用范圍廣，實驗成本低。生物素-親和素免疫放大技術(shù)有兩種基本類型，一類以游離親和素為中間物，分別連接包含生物素大分子的待測反應(yīng)體系和標記生物素，后在此基礎(chǔ)上發(fā)展了親和素-生物素化酶復(fù)合物技術(shù)；另一類是直接用標記親和素連接生物素化大分子反應(yīng)體系進行檢測，稱為標記親和素-生物素法。根據(jù)待測反應(yīng)體系中所用的是生物素化第一抗體或生物素化第二抗體，又分為直接法和間接法。在間接法中，親和素-生物素系統(tǒng)可以與免疫分析檢測體系偶聯(lián)，放大終反應(yīng)先將針對不同抗原決定簇的固相抗體和生物素化抗體與抗原(標準抗原和待測抗原)同時反應(yīng)，在固相載體表面形成雙抗體夾心免疫復(fù)合物，再加入已標記示蹤物的親和素與復(fù)合物中的生物素結(jié)合，最終使反應(yīng)信號放大，從而提高了免疫分析的靈敏度。目前，生物素-親和素免疫放大技術(shù)結(jié)合化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在層粘連蛋白免疫分析產(chǎn)品的應(yīng)用方面比較少見?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法結(jié)合生物素-親和素免疫放大技術(shù)是一種較先進而有效的方法。利用生物素-親和素系統(tǒng)間接包被抗體能達到良好的效果，而且更有利于包被抗體與抗原的結(jié)合，從而在一定程度上起到信號放大的作用。另外，現(xiàn)有技術(shù)中的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒為封閉式全自動化學(xué)發(fā)光測量系統(tǒng)，需要昂貴的全自動化學(xué)發(fā)光測量儀，從而限制了推廣使用，無法廣泛地應(yīng)用于臨床診斷和科研工作。本發(fā)明的試劑盒主要采用微孔板化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，既可應(yīng)用于開放式的半自動化學(xué)發(fā)光測量儀，也可用于全自動的測量系統(tǒng)，可實現(xiàn)大批量快檢測，使用成本低，更易推廣應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明同時解決了上述問題，即將生物素-親和素免疫放大技術(shù)結(jié)合化學(xué)發(fā)光技術(shù)與層粘連蛋白的免疫分析學(xué)有效地結(jié)合，提供了一種能夠簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定地檢測層粘連蛋白的試劑盒，該試劑盒適于在產(chǎn)業(yè)上有效地推廣應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供一種生物素-親和素免疫放大技術(shù)結(jié)合化學(xué)發(fā)光免疫分析測定層粘連蛋白的試劑盒及其制備方法。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包括1)層粘連蛋白校準品；2)親和素化的固相載體;3)生物素化的層粘連蛋白的單克隆抗體和酶標記的層粘連蛋白的多克隆抗體或單克隆抗體的混合物；4)上述酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物；以及5)濃縮洗滌液根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述固相載體為微孔板、塑料珠或塑料管；所述標記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶；所述化學(xué)發(fā)光底物為魯米諾、異魯米諾或1，2-二氧乙烷類衍生物，其中所述1,2-二氧乙垸類衍生物為(金剛烷)-1,2-二氧乙垸、3-(2'-螺旋金剛垸)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙垸(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。進一步，本發(fā)明提供了一種制備上述試劑盒的方法，包括以下步驟1)以層粘連蛋白純品配制層粘連蛋白校準品；2)固相載體包被親和素；3)使層粘連蛋白的單克隆抗體生物素化；4)用酶標記層粘連蛋白的多克隆抗體或單克隆抗體；5)配制化學(xué)發(fā)光底物；6)配制濃縮洗滌液；7)分裝上述層粘連蛋白校準品、生物素化的單克隆抗體、酶標記的層粘連蛋白的多克隆抗體或單克隆抗體、該酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物和濃縮洗滌液；以及8)組裝為成品。根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選，所述固相載體包被親和素的步驟2)包括以下步驟1)包被用0.050MpH值為9.6的碳酸鹽緩沖液配制成所需濃度的親和素包被液，并將包被液負載于固相載體上；2)用生鹽水洗滌上述固相載體；以及3)封閉用含l。/oBSA，pH值為7.07.5，濃度為0.010M的磷酸鹽緩沖液作為封閉液封閉上述洗滌后的固相載體。在上述方法中，優(yōu)選，所述親和素的固相載體為微孔板、塑料珠或塑料管；所述酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶；所述化學(xué)發(fā)光底物為魯米諾、異魯米諾或1,2-二氧乙烷類衍生物，其中所述1,2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。在上述方法中，優(yōu)選，所述化學(xué)發(fā)光底物液包含A液和B液，其中，A液包括10mM魯米諾、0.3mM4"羥基聯(lián)苯、0.05mM4-碘苯硼酸、0.2MpH8.7硼酸-硼砂緩沖液，其pH值為8.010.0;B液包括3.5mM過氧化脲、0.1%Tween20、0.2MpH7.2磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.07.6;或者，所述化學(xué)發(fā)光底物液包含24gTris、160gNaCl、4gKC1、15mLHCl、200mL3-(2'-螺旋金剛垸)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙垸、lmLProclin300、1000mL雙蒸水。本發(fā)明"層粘連蛋白化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒"可以專一地檢測出纖維化肝組織層粘連蛋白的含量，可以反映肝臟的早期損害和肝組織病變的活動進程，對預(yù)示肝纖維化的發(fā)生和肝硬化早期診斷有重要價值。它具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點。該層粘連蛋白測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法與免疫放大技術(shù)結(jié)合)的各項指標均達到酶聯(lián)免疫分析法水平。并且，根據(jù)本發(fā)明的檢測系統(tǒng)為開放式操作，簡便快速，不需要昂貴的全自動化學(xué)發(fā)光測量儀，特別適合廣大的中小醫(yī)院推廣使用，為臨床診斷和科研工作提供一種非常有價值的檢測手段。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，酶標記的抗體與親和素包被的載體上相連的生物素化抗體和被測樣品的層粘連蛋白形成"雙抗體夾心"結(jié)構(gòu)，因此本發(fā)明采用的"雙抗體夾心一步法"反應(yīng)模式，既有效地利用了化學(xué)發(fā)光技術(shù)原理，又確保了檢測的靈敏度。另外，這種模式還便于操作和生產(chǎn)。本發(fā)明的試劑盒應(yīng)用的是酶催化發(fā)光底物，通過檢測發(fā)光底物產(chǎn)生的光信號代替酶免疫分析中的顯色底物，因而具有與酶免疫分析同等的特異性，而靈敏度大大提高，比現(xiàn)今的酶免疫分析的靈敏度大大提高，可為層粘連蛋白的診斷提供更為特異、快速、可靠的依據(jù)。圖1為實施例1所制備的層粘連蛋白測定試劑盒的校準品線性圖。圖2顯示了用本發(fā)明的測定試劑盒和層粘連蛋白酶聯(lián)免疫測定試劑盒檢測各種肝病患者樣本的相關(guān)性結(jié)果。其中，層粘連蛋白酶聯(lián)免疫測定試劑盒的測定值為X軸，本發(fā)明中的試劑盒的測定值為Y軸，結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理得相關(guān)系數(shù)r=0.9497，y=0.9449x+7.5005。具體實施例方式實施例1制備本發(fā)明的層粘連蛋白化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒一、酶標抗體制備和生物素偶聯(lián)抗體的制備1.層粘連蛋白的多克隆抗體或單克隆抗體用過碘酸氧化法與辣根過氧化物酶偶聯(lián)，對PBS充分透析，加等體積甘油，一2(TC以下保存?zhèn)溆谩?.生物素偶聯(lián)層粘連蛋白單克隆抗體的制備U)用常規(guī)方法將生物素(BNHS)溶于N，N—二甲基甲酰胺(DMF)配成lmg/mL;(2)用0.1mol/LpH值為9.0的NaHC03將純化的層粘連蛋白的單克隆抗體稀釋為12mg/mL;(3)按BNHS與抗體容積比為1:8或重量比1:7左右混合，室溫攪拌下反應(yīng)24h;(4)裝入透析對0.05mol/LpH值為7.2的PBS，4。C透析過夜，結(jié)合物加等體積甘油，小量分裝，一2(TC以下保存?zhèn)溆?。二、層粘連蛋白校準品的制備用層粘連蛋白純品配制，分裝0、50、100、200、400、800ng/mL共6瓶。三、生物素化抗體和酶標抗體濃度選定采用方陣法選擇生物素化抗體和酶標抗體的工作濃度分別為l:3000和1:6000，將生物素化抗體和酶標抗體用酶標多抗或單抗稀釋液稀釋。Tris12.120gBSA5gProclin300lmL雙蒸水1000mL四、親和素化的固相微孔板制備(1)包被無水碳酸鈉0.795g碳酸氫鈉1.47g雙蒸水500mL溶解混勻后，調(diào)整pH至9.6，加入適量的親和素混勻，然后加入微孔板各孔中，每孔110nL，4'C放置24h。(2)洗滌用生理鹽水洗三次。(3)封閉液的配制NaH2P042H200.2gNa2HP04'12H202.9gBSA10gProclin300lmL雙蒸水定容至lOOOmL將上述試劑稱量好放入潔凈容器中，加雙蒸水定容，溶解混勻，測定pH值為7.0。每孔分別加入封閉液300pL，室溫放置3小時。甩掉封閉液，在吸水紙上拍干。室溫除濕干燥24小時。立即進行封袋，貼簽后置28'C保存。五、化學(xué)發(fā)光底物A液魯米諾10mM1.7716g4-羥基聯(lián)苯0.3mM0.05lg4-碘苯硼酸0.05mM0.012g硼酸11.4g硼砂4.9g雙蒸水定容lOOOmLpH8.010.0六、化學(xué)發(fā)光底物B液過氧化脲3.5mM0.329gTween200.1%1mlNa2HP0412H2051.58gNaH2P042H208.74g雙蒸水定容lOOOmLpH7.07.6使用時A液與B液等比例混合。七、20倍濃縮洗滌液Na2HP0412H2058gNaH2P04-2H202gNaCl160gTween-20lmLProclin300lmL去離子水lOOOmL調(diào)整pH至7.27.4八、半成品及成品組成上述步驟所得產(chǎn)品分裝即為半成品。抽出三份經(jīng)過特異性、精密性、靈敏度及穩(wěn)定性檢定合格才能組裝成層粘連蛋白測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)。組裝成試劑盒后還需抽檢合格后才能出廠。綜上，在本發(fā)明的研究過程中，本發(fā)明的發(fā)明人首先對所用的原材料進行了篩選試驗和質(zhì)量鑒定，包括標記抗體與生物素化抗體的活性、親和素化載體(如不透光的白色微孔板)的吸附性能和變異大小、HRP的活性、化學(xué)發(fā)光底物的發(fā)光強度及發(fā)光持續(xù)時間等。然后對親和素化載體的方法進行了研究，用不同的包被緩沖液和封閉液進行試驗，選擇出最適合的包被緩沖液和封閉液，通過親和素不同包被濃度試驗找到最佳的濃度條件。對于生物素偶聯(lián)抗體和對于HRP的標記可以有不同的方法，通過反復(fù)探索和對比試驗最終找到了簡便、產(chǎn)率高、成本低、質(zhì)量可靠的標記方法，并對生物素偶聯(lián)抗體和酶標記物使用的稀釋液進行了長期的考察試驗，配制出了能夠使生物素偶聯(lián)抗體和酶標記物長期保持活性而穩(wěn)定的稀釋液。再次通過多次方陣交叉試驗確定了生物素化的抗體與酶標記物的最佳稀釋比例分別為1:3000和1:6000。本發(fā)明的發(fā)明人還對試劑盒的反應(yīng)模式和反應(yīng)條件進行了試驗研究，最終確定了雙抗體夾心一步法反應(yīng)模式，并就不同的反應(yīng)時間對試驗結(jié)果的影響進行了試驗，確定最適合的反應(yīng)時間。通過對化學(xué)發(fā)光底物液發(fā)光持續(xù)時間的測定及不同發(fā)光時間對測定值的影響試驗表明在加入化學(xué)發(fā)光底物液后530分鐘之間進行測量為最佳，其結(jié)果也較為準確。實施例23制備本發(fā)明的層粘連蛋白化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒除以塑料珠、塑料管作為載體外，其余均以與實施例1相同的方法制備層粘連蛋白化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒。實施例4制備本發(fā)明的層粘連蛋白化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒除采用戊二醛法以堿性磷酸酶標記層粘連蛋白單克隆抗體、以AMPPD作為化學(xué)發(fā)光底物、以塑料珠作為載體、包被液為pH值為4.5的檸檬酸緩沖液、封閉液的pH值為7.5外，其余均以與實施例1相同的方法制備層粘連蛋白化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒。實施例5本發(fā)明的試劑盒的使用方法以實施例1制備的層粘連蛋白化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒的具體操作如下1)自4'C冰箱中取出試劑盒，室溫平衡15分鐘。2)取出包被板條，插入板架上。3)反應(yīng)孔中分別加各濃度校準品每孔加0、50、100、200、400、800ng/ml各25pL，每次試驗設(shè)空白1L，然后除空白孔外各孔加生物素化的抗體和酶標記物的混合物100pL，用微量震蕩器充分振蕩混勻，室溫溫育45分鐘。4)甩去反應(yīng)液，每孔加滿稀釋后的洗滌液，洗板5次，最后在干凈的吸水紙上扣干。5)化學(xué)發(fā)光底物液A、B以比例l:l混合后，各孔加入100nL，用微量震蕩器充分振蕩混合均勻，室溫(2025°C)避光反應(yīng)5分鐘。6)必須于加化學(xué)發(fā)光底物液后的第530分鐘內(nèi)測量，在化學(xué)發(fā)光測量儀上依序測量各孔的發(fā)光強度(RLU)，測量時間1秒/孔。7)以校準品濃度為橫坐標，RLU值為縱坐標繪出標準曲線，以各待測血清RLU值在標準曲線上查出該血清的層粘連蛋白的濃度。實施例6本發(fā)明的試劑盒與酶聯(lián)免疫測定試劑盒的比較1)兩種試劑盒的性能指標評價用層粘連蛋白酶聯(lián)免疫測定試劑盒與本發(fā)明的試劑盒一同進行精密性、特異性、靈敏度和準確性等性能指標的評價，結(jié)果見表l:表l兩種層粘連蛋白測定試劑盒的性能指標評價<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表1的數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明試劑盒在精密性、特異性和準確性等方面優(yōu)于所選的層粘連蛋白酶聯(lián)免疫測定試劑盒。2)兩種層粘連蛋白測定試劑盒對臨床樣本的檢測結(jié)果選取正常對照樣本121例，確診慢性肝炎樣本49例，肝硬化樣本60例，肝癌樣本35例，采用上述兩種層粘連蛋白測定試劑盒進行平行檢測，檢測程序和結(jié)果判斷嚴格按照各試劑說明書進行。表2兩種層粘連蛋白測定試劑盒對臨床樣本的檢測結(jié)果(單位ng/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表3兩種層粘連蛋白測定試劑盒檢測結(jié)果的分析比較<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>酶聯(lián)免疫測定試劑盒于正常對照樣本中檢出2份陽性，于慢性肝炎樣本中檢出1份陰性，而本發(fā)明中的試劑盒檢測結(jié)果與臨床結(jié)果完全相符，說明其靈敏度優(yōu)于所選的酶聯(lián)免疫測定試劑盒。本發(fā)明試劑盒與酶聯(lián)免疫測定試劑盒的樣本檢測符合率為98.87%，相關(guān)系數(shù)為R=0.9497(見圖2)。權(quán)利要求1、一種層粘連蛋白化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括1)層粘連蛋白校準品；2)親和素化的固相載體；3)生物素化的層粘連蛋白單克隆抗體和酶標記的層粘連蛋白的多克隆抗體或單克隆抗體的混合物；4)上述酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物；以及5)濃縮洗滌液。2、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述親和素化的固相載體為微孔板、塑料珠或塑料管。3、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶；所述化學(xué)發(fā)光底物為魯米諾、異魯米諾或1,2-二氧乙烷類衍生物。4、如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述1,2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛垸)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。5、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物包括A液和B液，其中，A液包括lOmM魯米諾、0.3mM4-羥基聯(lián)苯、0.05mM4-碘苯硼酸、0.2MpH8.7硼酸-硼砂緩沖液，其pH值為8.010.0;B液包括3.5mM過氧化脲、0.1%Tween20、0.2MpH7.2磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.07.6;或者，所述化學(xué)發(fā)光底物液包含24gTris、160gNaCl、4gKC1、15mLHCl、200mL3-(2'-螺旋金剛垸)-4-甲氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙垸、lmLProclin300、1000mL雙蒸水。6、一種制備權(quán)利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟1)以層粘連蛋白純品配制層粘連蛋白校準品；2)固相載體包被親和素；3)使層粘連蛋白的單克隆抗體生物素化；4)用酶標記層粘連蛋白的多克隆抗體或單克隆抗體；5)配制化學(xué)發(fā)光底物；6)配制濃縮洗滌液；7)分裝上述層粘連蛋白校準品、生物素化的單克隆抗體、酶標記的層粘連蛋白的多克隆抗體或單克隆抗體、該酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物和濃縮洗滌液；以及8)組裝為成品。7、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述固相載體包被親和素的步驟2)采用以下方法1)包被用0.050MpH值為9.6的碳酸鹽緩沖液配制成所需濃度的親和素包被液，并將包被液負載于固相載體上；2)用生理鹽水洗滌上述固相載體；以及3)封閉用含1%BSA，pH值為7.07.5，濃度為0.010M的磷酸鹽緩沖液作為封閉液封閉上述洗滌后的固相載體。8、如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述親和素化的固相載體為微孔板、塑料珠或塑料管。9、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶；所述化學(xué)發(fā)光底物為魯米諾、異魯米諾或1，2-二氧乙烷類衍生物。10、如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述1，2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-l，2-二氧乙垸、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。全文摘要本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種層粘連蛋白測定試劑盒及其制備方法。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包括1)層粘連蛋白校準品；2)親和素包被載體；3)生物素化的層粘連蛋白的單克隆抗體和層粘連蛋白的多克隆抗體或單克隆抗體酶標記物的混合物；5)化學(xué)發(fā)光底物；以及6)濃縮洗滌液。進一步，根據(jù)本發(fā)明制備上述試劑盒的方法包括以下步驟1)以層粘連蛋白純品配制校準品；2)以親和素包被載體；3)使層粘連蛋白的單克隆抗體生物素化；4)以酶標記層粘連蛋白的多克隆抗體或單克隆抗體；5)配制化學(xué)發(fā)光底物；6)配制濃縮洗滌液；7)分裝上述校準品、生物素化的抗體、酶標記物、化學(xué)發(fā)光底物和濃縮洗滌液；以及8)組裝為成品。本發(fā)明的試劑盒具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點，可為臨床診斷和科研工作提供了一種非常有價值的檢測手段。文檔編號G01N21/76GK101377508SQ20081010200公開日2009年3月4日申請日期2008年3月14日優(yōu)先權(quán)日2008年3月14日發(fā)明者唐寶軍,應(yīng)希堂,坤張,胡國茂,蔣冰飛申請人:北京科美東雅生物技術(shù)有限公司