專利名稱：C肽微孔板式磁顆?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學領域，具體地，本發(fā)明公開了一種c肽微孔板式磁
顆粒化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法。
背景技術：
人C肽是由31個氨基酸組成的直鏈，分子量3020。 C肽是在胰島素原形成胰 島素過程中釋放的一段連接肽。C肽與胰島素以等分子量從B細胞分泌到血液中。 C肽無生物活性(也有少數(shù)學者認為C肽具有生物活性)，也不與細胞膜上的受體 結合且不被降解，其半衰期為胰島素的3-5倍。對使用胰島素治療的糖尿病患者 測定C肽是較為理想的判斷指標。
C肽不受肝臟酶滅活，僅受腎臟作用而排泄，在外周血中半衰期長，C肽與 胰島素無交叉反應，C肽的檢測不受胰島素抗體的干擾，也不受外源胰島素注射的 影響，能更準確地反映人胰島P細胞的分泌功能。2003年美國糖尿病協(xié)會資助的專 家委員會的報告建議將C肽和胰島素抗體、谷氨酸脫羧酶抗體(GADAb)等自身抗 體作為糖尿病分型的重要指標。
目前用于檢測C肽的免疫分析方法主要有放射免疫分析、酶聯(lián)免疫分析、時 間分辨熒光免疫分析、化學發(fā)光免疫分析等。根據(jù)大量的試驗結果及臨床應用資 料，從實用性、穩(wěn)定性、準確性及發(fā)展前景來看，優(yōu)先順序依次為化學發(fā)光免 疫分析、時間分辨熒光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。
放射免疫分析技術因其使用放射性元素作為標記物，因此對環(huán)境有放射性污 染，并存在靈敏度不高，搡作復雜，試劑保存時間短等缺點；酶免疫分析法存在 靈敏度低，信噪比不高，線性范圍窄等方法學制約因素；時間分辨熒光免疫分析 對檢測環(huán)境的要求較高，易受空氣塵埃的干擾；化學發(fā)光免疫分析法是一種較先進而有效的方法，可使檢測靈敏度達到10—18摩爾水平，而且檢測范圍可達6個數(shù) 量級，其酶標記物穩(wěn)定，可長期使用?；瘜W發(fā)光免疫分析技術因其高靈敏、高特 異、快速、高通量等特點得到越來越廣泛的應用，目前化學發(fā)光主要有酶促底物 化學發(fā)光和標記物直接發(fā)光兩大系列，酶促化學發(fā)光所使用示蹤物一般為辣根過 氧化物酶和堿性磷酸酶。而標記物直接發(fā)光分為通過改變溶液酸堿度而發(fā)光的 發(fā)光物質為吖啶酯；通過電極作用的電化學發(fā)光的發(fā)光物質是三聯(lián)吡啶釕。
目前微孔板式免疫分析主要有酶聯(lián)免疫分析和化學發(fā)光免疫分析，而微孔板 式化學發(fā)光一般將微孔板作為固相載體，通過抗體的物理吸附作用包被在微孔板 上如專利(中國，申請?zhí)?00610107393. 1 ),也有通過將親和素或鏈親和素包被在 微孔板上，然后通過將生物素標記在抗體上，以親和素-生物素較強的結合能力為 橋聯(lián)，間接地將抗體固定到微孔板的方法。
目前磁顆粒在化學發(fā)光的應用上主要釆用單個反應杯或反應槽的形式。 本發(fā)明采用微孔板式磁顆粒整合了目前兩種技術，主要體現(xiàn)在(l)在微孔 板上使用磁顆粒，利用磁顆粒在相同體積的情況下表面積最大的原理，較目前微 孔板式化學發(fā)光固相物理吸附或用親和素-生物素橋聯(lián)方法包被抗體方式會結合 更多的抗體，這樣就會使反應的靈敏度更高，線性范圍更寬。(2)較目前磁顆粒 在化學發(fā)光的應用上采用單個反應杯或反應槽的形式相比，微孔板的反應模式因 為幾十或幾百個反應微孔在同一塊微孔板上，可以進行同時批量測量，適合大批 量血清篩査(如96孔微孔板， 一次就可以實現(xiàn)96個樣本的測試)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種C肽微孔板式磁顆?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒。
根據(jù)本發(fā)明C肽微孔板式磁顆?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒，其中，所述 試劑盒包括
51) C肽校準品；
2) C肽單克隆抗體包被的磁顆粒；
3) 辣根過氧化物酶(服P)標記的另一株單克隆抗體或多克隆抗體；
4 )微孔板；
5 )洗滌液；
6)上述酶所作用的化學發(fā)光底物液。
根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述反應微孔板為48孔、96孔、256孔不透明 微孔板。
根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述化學發(fā)光底物液包含A液和B液
A液是0. 2M pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，包含4. Og/L的魯米諾和0. 2g/L 的乙二醇乙二醚二胺四乙酸(EGTA)、 2.5%丙三醇、0. 05g/L對乙酰氨基酚；
B液是0. 2M pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，包含6%過氧化氫、9g/L氯化鈉的溶液。
化學發(fā)光底物液包含A液和B液使用方法A、 B液雙組分試劑，在使用前根 據(jù)使用量計算完畢后A: B為l: 1混合，應保證在6h內使用。
本發(fā)明的再一目的是提供一種制備上述試劑盒的制備方法。
根據(jù)本發(fā)明C肽微孔板式磁顆?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒的制備方法， 具體地，制備方法包括配制校準品；制備C肽抗體包被磁顆粒；以辣根過氧化 物酶標記C肽抗體；配制洗滌液；配制化學發(fā)光底物液。
根據(jù)本發(fā)明所述配制校準品，其中校準品基質的配方為三羥甲基氨基甲烷(Tris) 6. 06g
牛血清白蛋白(BSA) 1.5g
0. lmol/L鹽酸(HCL) 3. 45ml
Proclin300 lml
甘藍紅 0. lml
雙蒸水定容 1Q00ml
配制校準品基質液后，用此基質液將C肽抗原純品稀釋成系列濃度校準品， 每個濃度點，每瓶裝l ml,凍干保存。其中，所述校準品的C肽抗原原料純度應 不低于90%。
根據(jù)本發(fā)明試劑盒制備方法中C肽抗體包被磁顆粒的稀釋液配方為
磷酸二氫鈉(NaH2P04*2H20) 2.19 g
磷酸氫二鈉(Na2HP04'12H20) 12.9 g
牛血清白蛋白(BSA) 10g
明膠 15g
乙二醇 50ml
去離子水定容 1000ml
配制完成后，應混勻，放置30分鐘后用肉眼觀察無晶體或沉淀析出，應采用 電子PH計或中性pH試紙進行檢驗pH應控制在7. 0-7. 5之間，最佳pH為7. 2。然 后分裝到適當體積的聚乙烯塑料瓶中。根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，所述制備C肽抗體包被磁顆粒，是將磁顆粒 通過偶聯(lián)羧基和/或氨基中的至少一種活性基團后，與c肽抗體中的賴氨酸殘基中 裸露氨基反應共價結合的過程，反應結東后用去離子水沖洗3次，2仰SA封閉，離 心去上清液后，用上述磁顆粒稀釋液適當體積溶解，備用。
根據(jù)本發(fā)明提到的磁顆粒如果活化的為羧基基團，則與C肽抗體中的賴氨酸 殘基中裸露氨基反應以共價鍵結合的過程；
根據(jù)本發(fā)明提到的磁顆粒如果活化的為氨基基團則通過偶聯(lián)劑戊二醛、1-乙 基-3- (3-二甲基氨丙基)-碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺三種中的至少一種氨基 基團偶聯(lián)劑與C肽抗體中的賴氨酸殘基中棵露氨基反應以共價鍵結合的過程。
包被磁顆粒的C肽單克隆抗體應為鼠源或兔源的。
包被磁顆粒的C肽單克隆抗體在使用前應搖勻。
根據(jù)本發(fā)明提到的以辣根過氧化物酶標記C肽抗體采用過碘酸鈉法進行標記。 其制備步驟為稱5mgHRP溶于lml雙蒸水中，加入0. 2ml新配的0. lMNal(V溶液, 室溫避光20min。 lmM pH4. 4醋酸鈉緩沖液透析，4'C過夜。加入20ul0.2M pH9. 6 碳酸鹽緩沖液，加入lml 0. OIM碳酸鹽緩沖液含5mg抗體，室溫2h。再加0. lml 新配4g/L NaBH4,混勻，4'C2h。 0. 15M pH7. 4 PBS透析4'C過夜。攪拌下逐滴加 入等體積飽和硫酸銨，4'Clh。 3000rpm離心0. 5h,棄上清。沉淀物溶于lm10. 15M pH7. 4PBS。 0. 15M pH7. 4的PBS透析4'C4h, 10， OOOrpm離心30min,上清液即為 酶結合物，加入等量丙三醇，-2(TC保存。
辣根過氧化物酶標記C肽單克隆抗體或多克隆抗體應為鼠源、兔源或羊源的。
根據(jù)本發(fā)明試劑盒制備方法中洗滌液的配方為
磷酸二氣鈉(NaH2P04*2H20) 1 g
8磷酸氫二鈉(Na2HP04*12H20 ) 1.28 g
氯化鈉(NaCL) 9g
Tween20 0. lml
去離子水定容 1000ml
根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中免疫反應結束后，磁顆粒以及反應復合物是通 過在微孔板的底部安裝有磁鐵和/或電磁場的至少一種磁場，磁顆粒以及反應復合 物被吸附到微孔板底部后，再洗滌。
綜上，在本發(fā)明的研究過程中，本發(fā)明的發(fā)明人首先對所用的原材料進行了 篩選實驗和質量檢定，包括包被抗體的活性、磁顆粒的吸附性能和變異大小、HRP 的活性、化學發(fā)光底物的發(fā)光強度及發(fā)光持續(xù)時間等。對于HRP的標記可以有不 同的方法，通過反復探索和對比實驗最終找到了簡便、產率高、成本低、質量可 靠的標記方法。
本發(fā)明公開了基于上述摸索試驗得到的各種試劑配方，包括化學發(fā)光底物 液配方、校準品的基質配方、洗滌液的配方、C肽抗體包被磁顆粒的稀釋液配方。 進一步，公開了辣根過氧化物酶標記C肽抗體的制備過程和C肽抗體包被磁顆粒 的制備過程。
利用本發(fā)明方法進行檢測，靈敏度高，特異性強，檢測范圍寬，操作簡單， 無放射性污染，試劑盒成本低，臨床適用性強，更適用于我國臨床檢測及篩查實 驗室。


圖l為實施例7試劑盒中的校準品線性圖(雙對數(shù)標準曲線)。圖2為實施例9本發(fā)明的試劑盒同國外試劑盒(M0N0BIND公司CLIA試劑盒) 臨床血樣測值比對的相關曲線。
具體實施例方式
實施例1 C肽微孔板式磁顆?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒發(fā)光底物液的制
備
按照化學發(fā)光底物液A液配方
磷酸二氫鈉(NaH2P04'2H20) 2. 19 g
磷酸氫二鈉(Na2HP04*12H20) 12. 9 g
魯米諾(luminol ) 4g
乙二醇乙二醚二胺四乙酸(EGTA) 0.2g
丙三醇 25ml
對乙酰氨基酚 0. 05g
雙蒸水定容 1000ml
配制完成后用聚乙烯塑料瓶，每瓶分裝10ml。 按照化學發(fā)光底物液B液配方
磷酸二氫鈉(NaH2P04*2H20) 2. 19 g
磷酸氫二鈉(Na2HP04'12H20) 12.9 g
30%過氧化氫(H202 ) 200ml
氯化鈉(NaCL) 9g
10雙蒸水定容 1000ml 配制完成后用聚乙烯塑料瓶，每瓶分裝10ml。 實施例2 C肽校準品的制備 根據(jù)本發(fā)明校準品的基質液配方
三羥甲基氨基甲烷(Tris) 6. 06g
牛血清白蛋白(BSA) 1. 5g
0, 1mol/L鹽酸(HCL) 3. 45ml
Proclin300 lml
甘藍紅 0. lml
雙蒸水 1000ml
配制校準品基質液，用此基質液將C肽抗原純品(〉90%)稀釋成校準品，濃 度分別為0. 2ng/ml、 0. 6ng/ml、 2ng/ml、 6ng/ml、 15ng/ml,另加基質液Ong/ml， 共6瓶，每瓶裝l ml,凍干保存。
實施例3 C肽抗體磁顆粒的制備
根據(jù)本發(fā)明試劑盒制備方法中C肽抗體包被磁顆粒的稀釋液配方進行配制
磷酸二氫鈉(NaH2P04'2H20) 2. 19 g
磷酸氫二鈉(Na2HP04*12H20) 12. 9 g
牛血清白蛋白(BSA) 10g
明膠 15g乙二醇 50ml 去離子水定容 1000ml
配制完成后，應混勻，放置30分鐘后用肉眼觀察無晶體或沉淀析出，應采用 電子PH計或中性pH試紙進行檢驗pH應控制在7. 0-7. 5之間，最佳pH為7. 2。然 后分裝到適當體積的聚乙烯塑料瓶中。
當粒徑為1~2 ia m磁顆粒表面附有氨基基團時，將此磁顆粒在堿性條件下用 1-乙基-3- (3-二甲基氨丙基)-碳二亞胺進行活化，室溫攪拌，混勻3小時后， 加磁場，靜置20 25min,倒出上清，用pH值為7. 4的0. Olmol/L磷酸鹽緩沖液將 磁顆粒進行懸浮，濃度為50~100g/L;每毫升懸浮液中加入C肽單克隆抗體20 50 Hg,在4'C下攪拌過夜后，反應結東后加電磁場，用去離子水沖洗3次，2%BSA 封閉，離心去上清液后，用磁顆粒稀釋液適當體積溶解，備用。
實施例4 C肽試劑盒中洗滌液的制備
根據(jù)本發(fā)明試劑盒制備方法中洗滌液的配方進行配制
磷酸二氫鈉(NaH2P04'2H20) 1 g
磷酸氫二鈉(Na2HP04*12H20 ) 1.28 g
氯化鈉(NaCL) 9g
Tween20 0. lml
去離子水定容 1000ml
配制完成后，應混勻，放置30分鐘后用肉J艮觀察無晶體或沉淀析出，應采用 電子pH計或中性pH試紙進行檢驗pH應控制在7. 0-7. 5之間，最佳pH為7. 2。然 后分裝洗滌液到適當規(guī)格的聚乙烯塑料瓶中。實施例5 C肽抗體磁顆粒和辣根過氧化物酶標記的C肽抗體的濃度選定標準
釆用方陣法將c肽抗體磁顆粒和辣根過氧化物酶標記抗體以不同稀釋度進行 配比，以最高信噪比大于1200,最低信噪比大于5為基準，優(yōu)化選擇成本最低的 配比關系。
采用，將C肽抗體磁顆粒以1/1000、 1/2000、 1/4000、 1/8000、 1/16000、 1/32000、 1/64000、 1/128000的不同稀釋度，與辣根過氧化物酶標記抗體1/1000、 1/2000、 1/4000、 1/8000、 1/16000、 1/32000、 1/64000、 1/128000的不同稀釋度進行方陣 法，兩組比例交叉配比，發(fā)現(xiàn)滿足最高信噪比大于1200,最低信噪比大于5的組 合中，將C肽抗體磁顆粒以1/16000和辣根過氧化物酶標記抗體1/64000的配比 比例所用成本最低。故選擇這個合適的配比比例。
實施例6 C肽微孔板式磁顆?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒半成品及成品組
成
上述步驟所得產品分裝即為半成品。抽出三份經(jīng)過特異性、精密性、靈敏度 及穩(wěn)定性檢定合格才能組裝成C肽微孔板式磁顆?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒， 組裝成試劑盒后還需抽檢合格后才能出廠。
實施例7本發(fā)明的試劑盒的使用方法
一、 樣品前處理
取人的空腹及口服75g葡萄糖lh、 2h、 3h晨血清樣品,3000rpm離心15min, 取上層液50ul進行分析。
二、 檢測方法
使用本試劑盒進行實驗前，需先取出辣根過氧化物酶標記的C肽抗體、校準 品/待測樣品、C肽抗體磁顆粒、發(fā)光底物液和洗滌液，在室溫放置15~30分鐘， 使它們平衡到室溫；之后，將恒溫溫箱或者水洛鍋調至37°C;準備好合適的微量 加樣器及對應吸頭并且檢査化學發(fā)光儀是否正常工作。使用本試劑盒實驗的具體搡作步驟如下
首先，根據(jù)試驗需求設計好分布圖，然后向微孔中加入50yl血清樣品或系 列校準品溶液，校準品每孔加Ong/ml、 0.2ng/tnl、 0.6ng/ml、 2ng/ral、 6ng/ral、 15ng/ml各50m 1,再加入C肽抗體包被的磁顆粒溶液100 )a 1,加入辣根過氧化物 酶標記C肽抗體50iu1, 37。C振蕩反應30min。之后，將微孔板置于帶有磁分離器 的微孔板洗板機上洗滌5次。將化學發(fā)光底物液A、 b等體積混合搖勻后，每孔加 入化學發(fā)光底物200]ul，充分混勻，暗處放置5min，而后在化學發(fā)光測量儀上依 序測量各孔的發(fā)光強度(RLU)。以校準品濃度的Log值為橫坐標，RLU的Log值為 縱坐標繪出標準曲線(雙對數(shù)曲線)，以各待測血清RUJ值在標準曲線上查出該血 清的C肽的濃度，見附圖l，其中，縱坐標為發(fā)光強度，橫坐標為C肽濃度(單位 為ng/ml )，相關系數(shù)r = 0. 9992， Log (Y) =0. 5834Log (X) +5. 1424
實施例8本發(fā)明的試劑盒的方法學檢定
按照本領域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程對通過實施例1~6中制備成的試劑盒進 行檢定，結果如下
1) 準確性
試劑盒校準品與國家標準品同時測定，兩條劑量-反應曲線不顯著偏離平行。 以國家標準品為對照品，試劑盒校準品的實測值與標示值之比應在0.90-1.10的 范圍內。
2) 劑量-反應曲線的線性
用雙對數(shù)數(shù)學模型擬合，在0.2 ng/m卜15 ng/ml濃度范圍內，劑量-反應曲 線相關系數(shù)(r)的絕對值應不低于0.9900
3) 精密性
CV(%)應小于15. 0%(n = 10)
4) 最低檢出量
14應不高于0. 1 ng/ml5) 質控血清測定值 各質控測值應在質控范圍內。6) 特異性與胰島素原交叉反應率應小于2. 5% 與胰島素的交叉反應率應小于0. 1%7) 穩(wěn)定性將試劑盒37'C放置7天，測定結果應符合上述1)- 5)項要求。 實施例9本發(fā)明的試劑盒同國外試劑盒臨床血樣測值比對用本發(fā)明的試劑盒和M0N0BIND公司的試劑盒對50份正常人(經(jīng)過傳染病四 項HBsAg、 HIV、 HCV、 TP、肝功能、血常規(guī)、尿常規(guī)、血糖檢測正常)血清樣品同 時進行檢測。其檢測結果見附圖2，以本發(fā)明方法測定的血樣C肽濃度結果為縱坐 標，以MONOBIND測定的濃度結果為橫坐標作回歸分析，相關方程為Y = 1. 1657 X-0.0236,相關系數(shù)r = 0.9692。經(jīng)統(tǒng)計學處理結果表明，本發(fā)明方法同國外試 劑盒臨床血樣測值相關性良好。
權利要求
1、C肽微孔板式磁顆?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括1)C肽校準品；2)C肽單克隆抗體包被的磁顆粒；3)辣根過氧化物酶(HRP)標記的另一株單克隆抗體或多克隆抗體；4)微孔板；5)洗滌液；6)上述酶所作用的化學發(fā)光底物液。
2、 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述微孔板為48孔、96孔、 256孔不透明微孔板。
3、 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發(fā)光底物液包含A液 和B液，其中，A液是O. 05MpH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，包含4. Og/L的魯米諾 和0. 2g/L的乙二醇乙二醚二胺四乙酸(EGTA)、 2. 5%丙三醇、0. 05g/L對乙酰氨基 酚；B液是O. 05M pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，包含6%過氧化氫、9g/L氯化鈉。
4、 C肽微孔板式磁顆粒化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒的制備方法，其特征在 于制備方法包括配制校準品；制備C肽抗體包被磁顆粒；以辣根過氧化物酶標 記C肽抗體；配制洗滌液；配制化學發(fā)光底物液。
5、 如權利要求4所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述配制校準品的 基質配方為含1.5 g/L BSA， 0. l%Procl in300 , 0. 05mol/L PH 7.8 Tris-HCL, 0. 01%甘藍紅。
6、 如權利要求4所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述以C肽抗體包 被磁顆粒，是將磁顆粒通過偶聯(lián)羧基和/或氨基中的至少一種活性基團后，與C肽 抗體中的賴氨酸殘基中裸露氨基反應共價結合的過程，反應結東后用去離子水沖 洗3次，2仰SA封閉，離心去上清液后，用磁顆粒稀釋液溶解，備用。
7、 如權利要求6所述試劑盒的制備方法，其特征在于，所述用磁顆粒稀釋液 溶解，稀釋液配方為0. 05MpH值為7. 2的磷酸鹽緩沖液，1. 5%明膠、1%BSA, 5% 乙二醇。
8、 如權利要求4所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述以辣根過氧化物酶標記C肽抗體采用過碘酸鈉法進行標記。
9、如權利要求4所述的試劑盒制備方法，其特征在于，所述配制洗滌液，配 方為0.01M pH值為7. 2的磷酸鹽緩沖液，0. 01訂ween20， 9g/L NaCl。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種C肽微孔板式磁顆?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法。根據(jù)本發(fā)明試劑盒包括1)C肽校準品；2)C肽單克隆抗體包被的磁顆粒；3)辣根過氧化物酶(HRP)標記的另一株單克隆抗體或多克隆抗體；4)微孔板；5)洗滌液；6)上述酶所作用的化學發(fā)光底物液。進一步，根據(jù)本發(fā)明制備上述試劑盒的制備方法包括配制校準品；制備C肽抗體包被磁顆粒；以辣根過氧化物酶標記C肽抗體；配制洗滌液；配制化學發(fā)光底物液。本發(fā)明試劑盒具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/577GK101545909SQ20081010266
公開日2009年9月30日 申請日期2008年3月25日 優(yōu)先權日2008年3月25日
發(fā)明者唐寶軍, 宋勝利, 應希堂, 坤 張, 王宏銳, 胡國茂, 鄭金來 申請人:北京科美東雅生物技術有限公司