專(zhuān)利名稱(chēng)：：戊型肝炎病毒IgM抗體化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及臨床體外診斷免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種戊型肝炎病毒IgM抗體化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：戊型肝炎病毒(h印atitisEvirus,HEV)是無(wú)包膜的單正鏈RNA病毒，經(jīng)糞口途徑傳播，引起的急性戊型肝炎(hepatitisE,HE),多表現(xiàn)為急性黃疽型肝炎，易發(fā)展為亞急性重癥肝炎或淤膽肝炎。近年來(lái)呈逐年上升趨勢(shì)。患者主要為成年人，病死率較高，尤其孕期最后3個(gè)月的妊娠婦女患病后，病死率可達(dá)IO%~39%,危害嚴(yán)重。戊型病毒性肝炎，首先在印度次大陸發(fā)現(xiàn)，中亞、東南亞、非洲、印度次大陸均有較大流行的報(bào)道。多數(shù)爆發(fā)流行為水源性的。食源性的報(bào)道亦見(jiàn)諸文獻(xiàn)。我國(guó)人群戊型肝炎的感染率約18%。急性散發(fā)性肝炎中戊肝約占10%,是我國(guó)乙類(lèi)法定傳染病之一。在急性期血清中可測(cè)出高滴度的抗HEV-IgM,恢復(fù)期抗HEV-IgM滴度下降或消失。但取而代之的是血清中產(chǎn)生抗HEV-IgG。血清中抗-HEVlgM出現(xiàn)，是HEV急性感染和近期感染的血清學(xué)證據(jù)；具有比HEVIgG抗體更高的診斷價(jià)值，因此對(duì)戊型肝炎的早期診斷和預(yù)防有著重要意義。目前國(guó)內(nèi)常用的戊型肝炎診斷方法有免疫熒光法、免疫電子顯微鏡、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)、特異性抗體檢測(cè)法。免疫焚光法檢測(cè)肝組織中戊型肝炎病毒抗原，此方法須進(jìn)行肝穿活檢；免疫電子顯微鏡檢測(cè)急性期患者的糞便及膽汁中病毒抗原或用已知患者血清中相應(yīng)的抗體；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)檢測(cè)戊型肝炎病毒核糖核酸(HEV-RNA)。戊型肝炎病毒特異性抗體酶聯(lián)免疫法檢測(cè)法是目前醫(yī)院主要的檢測(cè)方法，其測(cè)定抗HEV-IgM具有臨床意義。由于ELISA試劑方法的靈敏度不如化學(xué)發(fā)光試劑高，對(duì)HEV感染窗口期患者不能提早診斷；RT-PCR、免疫焚光法方法、免疫電子顯微鏡檢測(cè)法，操作繁瑣，穩(wěn)定性差、儀器昂貴、有局限性。鑒于此，本發(fā)明建立了一種快速、敏感、特異性、穩(wěn)定性強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光酶促免疫分析方法來(lái)檢測(cè)戊型肝炎病毒抗體。現(xiàn)在，化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒多為進(jìn)口封閉式全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)量系統(tǒng)，設(shè)備昂貴，使用成本高，從而限制了推廣使用，無(wú)法廣泛地應(yīng)用于臨床診斷和科研工作。本發(fā)明的試劑盒采用微孔板化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，既可應(yīng)用于開(kāi)放式的半自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x，也可用于全自動(dòng)的測(cè)量系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)大批量快檢測(cè)，使用成本低，更能適合在大、中、小醫(yī)院推廣應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是:提供一種化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定戊型肝炎病毒IgG抗體的試劑盒。該發(fā)明試劑盒能夠簡(jiǎn)便、快速、靈敏、設(shè)備簡(jiǎn)單、重復(fù)性較好、無(wú)污染能穩(wěn)定地檢測(cè)戊型肝炎病毒IgM抗體，并適于在產(chǎn)業(yè)上有效地推廣應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包括戊型肝炎病毒IgM抗體陰、陽(yáng)性對(duì)照品；包被固相載體；酶標(biāo)記結(jié)合物；酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物液；以及濃縮洗滌液。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述包被固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒；所述酶為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶；所述化學(xué)發(fā)光底物液為1，2-二氧乙烷類(lèi)衍生物、魯米諾或異魯米諾，其中所述1,2-二氧乙烷類(lèi)衍生物為(金剛烷)-l，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-曱氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。本發(fā)明采用捕獲夾心法原理，利用化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定戊型肝炎IgM抗體水平的變化。包被高純度抗人-(j鏈包被微孔板，酶標(biāo)記特異性重組戊型肝炎病毒抗原。在包被板微孔中加入稀釋的待測(cè)樣本、酶標(biāo)記物，溫育后形成固抗體-抗體-酶標(biāo)抗原的復(fù)合物，充分洗滌后加入化學(xué)發(fā)光底物液，測(cè)定其發(fā)光強(qiáng)度(RLU)。根據(jù)樣本的RLU值隨抗-IgM抗體濃度的增加而升高，從而判定戊型肝炎病毒IgM抗體在人體里的變化情況。本發(fā)明的另一目提供了一種制備上述試劑盒的方法，包括以下步驟l)以戊型肝炎病毒IgM抗體陰、陽(yáng)性血清制配對(duì)照品戊型肝炎病毒IgM抗體陰、陽(yáng)性對(duì)血清為經(jīng)HBsAg、抗-HIV、抗-TP以及抗-HCV抗體測(cè)定均為陰性的多份混合血清，6(TC滅活1小時(shí)，適度稀釋配制(抗-HEVIgM抗體陽(yáng)性效價(jià)〉1:500)2)以抗人-JLl鏈抗體(單抗或多抗)直接包被固相載體(微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒)用0.1MpH值為8.0的硼酸緩沖液配制成所需濃度的戊型肝炎病毒抗原包被液，并將包被液負(fù)載于固相載體上；用含O.1%酪蛋白，1°/。蔗糖，0.01%明膠，0.1%Proclin300,pH值為7.0~7.5，濃度為0.01M的磷酸鹽緩沖液作為封閉液封閉上述的固相載體3)以酶標(biāo)記重組戊型肝炎病毒抗原用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶偶聯(lián)重組戊型肝炎病毒抗原；4)配制酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物液；用1，2-二氧乙烷類(lèi)衍生物、魯米諾或異魯米諾配制酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物液。5)配制濃縮洗滌液為PBST濃縮稀液。分裝上述戊型肝炎病毒IgM抗體陰、陽(yáng)性對(duì)照品、酶標(biāo)記的戊型肝炎病毒重組抗原、該酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物及濃縮洗滌液；并組裝為成品。本發(fā)明"戊型肝炎病毒IgM抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒"可以非常專(zhuān)一地檢測(cè)出早期感染戊型肝炎病毒后人體中的戊型肝炎病毒IgM抗體，可以根據(jù)檢測(cè)戊型肝炎病毒IgM抗體變化，判斷治療效果及早期病情的變化根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，載體上包被的抗人-ia鏈抗體先捕獲被測(cè)樣品中特異性抗體(IgM抗體)，和加入的酶標(biāo)記的重組戊型肝炎病毒特異性抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，因此本發(fā)明采用的"捕獲夾心法"反應(yīng)模式，既有效地利用了化學(xué)發(fā)光技術(shù)原理，又確保了檢測(cè)的靈敏度。另外，這種反應(yīng)模式還便于操作。本發(fā)明的試劑盒應(yīng)用的是酶催化發(fā)光底物，通過(guò)檢測(cè)發(fā)光底物產(chǎn)生的光信號(hào)代替酶免疫分析中的顯色底物，因而具有比酶免疫分析特異性好，靈敏度高的特點(diǎn)；可為戊型肝炎病毒IgM抗體的診斷提供更為特異、快速、可靠的依據(jù)。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1制備本發(fā)明的戊型肝炎病毒IgM抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒在本發(fā)明的研究過(guò)程中，本發(fā)明的發(fā)明人首先對(duì)所用的原材料進(jìn)行了篩選實(shí)驗(yàn)和質(zhì)量鑒定，包括抗原標(biāo)記物與包被抗體的活性、栽體(如不透光的白色微孔板)的吸附性能和變異大小、HRP的活性、化學(xué)發(fā)光底物的發(fā)光強(qiáng)度及發(fā)光持續(xù)時(shí)間等。然后對(duì)包被方法進(jìn)行了研究，用不同的包被緩沖液和保護(hù)液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，選擇出最適合的包被緩沖液和保護(hù)液，通過(guò)抗體不同包被濃度實(shí)驗(yàn)找到最佳的濃度條件。對(duì)于HRP的標(biāo)記可以有不同的方法，通過(guò)反復(fù)探索和對(duì)比實(shí)驗(yàn)最終找到了簡(jiǎn)便、產(chǎn)率高、成本低、質(zhì)量可靠的標(biāo)記方法，并對(duì)不同的酶稀釋液進(jìn)行了長(zhǎng)期的考察實(shí)驗(yàn)，配制出了能夠使抗原標(biāo)記物長(zhǎng)期保持活性穩(wěn)定的稀釋液。一、辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)重組戊型肝炎病毒抗原制備重組戊型肝炎病毒抗原用二馬來(lái)酰亞胺(Dimaleimide)偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶。具體操作如下將抗lgG抗體溶于0.1Mol/LPH5.0醋酸鈉緩沖液并對(duì)同一緩沖液透析平衡過(guò)夜，離心除去不溶性物質(zhì)，抗IgG(14mg/2ml)與10mloc-巰基乙胺在37。C溫育90min。過(guò)Sephadex后濃縮使每ml含3.Omg左右的還原抗IgG。在O'C中，按1:1滴加飽和N,、N'-O-苯二馬來(lái)酰亞胺溶液，混合，于3(TC溫育20min,過(guò)S印hadexG25柱，除去未反應(yīng)的二馬來(lái)酰亞胺。收集二馬來(lái)酰亞胺"活化"的抗IgG,濃縮使?jié)舛葹镺D28。nm=l.0(光徑lcm),取lml溶液加20ju1(5mg/ml)辣根過(guò)氧化物酶，置30。C20min,用0.10Mol/LNaOH中和后，于4'C置24h-72h，再過(guò)Sepharose-6B柱(1.5x40cm),以pH7.OPBS洗脫，收集酶結(jié)合物，加疊氮鈉(NaN3)防腐，4'C保存?zhèn)溆?。酶?biāo)記重組戊型肝炎病毒抗原濃度選定基于1000ml酶標(biāo)抗原稀釋液組份含量為2.9gNa2HP0412H20、0.3gNaH2P04.2H20、9gNaCl、25gBSA、lmlProclin300、lmlTween—20。將酶標(biāo)記抗原結(jié)合物稀釋不同的稀釋度，采用方陣滴定法確定酶標(biāo)抗原的工作濃度為1:6000二、戊型肝炎病毒IgM抗體陰、陽(yáng)性對(duì)照的制備混合6份以上經(jīng)ELISA試劑盒檢測(cè)戊型肝炎病毒IgM抗體陽(yáng)性血清或陰性血清，經(jīng)抗-HIV、抗-TP以及抗-HCV抗體陰性血清，60。C滅活1小時(shí)，適度稀釋配制(抗-HEVIgM抗體陽(yáng)性效價(jià)〉l:500)，過(guò)濾除菌、分裝，低溫凍存。三、固相包被板的制備包被基于1000ml包被液組份含量為2.86g硼砂、4.33g硼酸，稱(chēng)取所需組份量放入潔凈容器中雙蒸水溶解混勻后，調(diào)整至PH8.0,定溶1000ml。加入適量抗人-p鏈抗體混勻，然后加入微孔板各孔中，每孔100uL,4'C過(guò)夜。包被微孔板為48或96孔的微孔板條。封閉每孔分別加入封閉液150j^L，4'C放置24小時(shí)。甩掉封閉液，在吸水紙上拍干。室溫除濕干燥24小時(shí)。立即進(jìn)行真空封袋。封袋后放置15分鐘檢查無(wú)漏氣，如果有漏氣需重新封袋。貼簽后置2-8。C保存?；?000ml封閉液組份含量為0.2gNaH2P04'2H20、2.9gNa2HP04.12H20、lg酪蛋白、10g蔗糖、0.lg明膠，lmlProclin300。稱(chēng)量好各組份量放入潔凈容器中，加雙蒸水，溶解混勻，調(diào)整pH值為7.0~7.5,定容1000ml。四、化學(xué)發(fā)光底物A液基于1000mlA液組份含量為10mM魯米諾1.7716g、0.3mM4-羥基聯(lián)苯0.051g、0.05mM4-石典苯硼酸0.012g、硼酸11.4g、硼砂4.9g。稱(chēng)量好各組份量放入潔凈容器中，加雙蒸水，溶解混勻，調(diào)整pH值為8.0~10.0,定容1000ml。五、化學(xué)發(fā)光底物B液基于1000mlA液組份含量為:3.5raM過(guò)氧化脲0.329g、lml0.l%Tween20、51.58gNa肌.12H20、8.74gNaH2P04.2H20、稱(chēng)量好各組份量力丈入潔凈容器中,加雙蒸水，溶解混勻，調(diào)整pH值為7.0-7,6,定容1000ml。稱(chēng)量好各組份量放入潔凈容器中，加雙蒸水，溶解混勻，調(diào)整pH值為8.0~10.0,定容1000ml。使用時(shí)A液與B液等比例混合。六、20倍洗滌液基于1000ml20倍洗滌液各組份含量為58gNa2HP04.12H20、2gNaH2P04.2H20、160gNaCl、lmLTween-20、lmLProclin300。稱(chēng)量好各組份量放入潔凈容器中，加雙蒸水，溶解混勻，調(diào)整pH值為7.2~7.4，定容1000ml。七、半成品及成品纟且成上述步驟所得產(chǎn)品分裝即為半成品。半成品經(jīng)特異性、精密性、靈敏度及穩(wěn)定性檢定合格才能組裝成戊型肝炎病毒IgM抗體測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)成品。組裝成成品試劑盒再經(jīng)特異性、精密性、靈敏度及穩(wěn)定性檢定合格后方能應(yīng)用。本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)對(duì)試劑盒的反應(yīng)模式和反應(yīng)條件進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究，最終確定了捕獲法夾心反應(yīng)模式，并就不同的反應(yīng)時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，確定最適合的反應(yīng)時(shí)間。通過(guò)對(duì)化學(xué)發(fā)光底物液發(fā)光持續(xù)時(shí)間的測(cè)定及不同發(fā)光時(shí)間對(duì)測(cè)定值的影響實(shí)-瞼表明在加入化學(xué)發(fā)光底物液后5-25分鐘之間進(jìn)行測(cè)量為最佳，其結(jié)果也較為準(zhǔn)確。實(shí)施例2~3制備本發(fā)明的戊型肝炎病毒IgM抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒除以堿性磷酸酶標(biāo)記戊型肝炎病毒重組抗原、以AMPPD作為化學(xué)發(fā)光底物、以塑料珠、塑料管作為栽體、包被液的pH值為4.5、封閉液的pH值為7.5夕卜，其余均以與實(shí)施例1相同的方法制備戊型肝炎病毒IgM抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒。實(shí)施例4制備本發(fā)明的戊型肝炎病毒IgM抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒除以磁性顆粒作為載體，用戊二醛偶聯(lián)法制備磁顆?？谷?m鏈抗體固相載體外，其余均以與實(shí)施例1相同的方法制備戊型肝炎病毒IgM抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒。實(shí)施例5本發(fā)明的試劑盒的使用方法以上實(shí)施例1制備的戊型肝炎病毒IgM抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒的具體操作如下1)自4'C冰箱中取出試劑盒，室溫平衡15分鐘。血清樣本用生理鹽水l:1000稀釋備用。2)取出包被板條，插入板架上。3)除空白孔外，反應(yīng)孔中分別加陰、陽(yáng)對(duì)照品各兩孔，每孔50ul,各孔加稀釋后的待檢樣本50ul，然后每孔加酶結(jié)合物50)aL，用微量震蕩器充分振蕩混勻，37。C溫育1小時(shí)。4)甩去反應(yīng)液，每孔加滿(mǎn)稀釋后的洗涂液，洗板5次，最后在干凈的吸水紙上扣干。5)各孔加化學(xué)發(fā)光底物液A、B各50pL,用微量震蕩器充分振蕩混合均勻，室溫(20~25。C)避光反應(yīng)5分鐘。6)必須于加化學(xué)發(fā)光底物液后的第5~25分鐘內(nèi)測(cè)量，在化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x上依序測(cè)量各孔的發(fā)光強(qiáng)度(RLU)，測(cè)量時(shí)間1秒/孔。9)CO值=2.1^，RLU值>CO值則樣本判定為陽(yáng)性樣本；RLU值<CO值則樣本判定為陰性樣本。實(shí)施例6本發(fā)明的試劑盒的方法學(xué)鑒定按照本領(lǐng)域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程對(duì)實(shí)施例1中制備的試劑盒進(jìn)行檢定，見(jiàn)下表l:表1<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>說(shuō)明"戊型肝炎病毒IgM抗體(抗-HAVIgM)化學(xué)發(fā)光法免疫分析測(cè)定試劑盒"的靈敏度、特異性、精密性以及穩(wěn)定性完全符合檢定要求。本發(fā)明試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到或高于ELISA試劑的檢測(cè)指標(biāo)。實(shí)施例7本發(fā)明的戊型肝炎病毒IgM抗體(抗-HAVIgM)化學(xué)發(fā)光法免疫分析測(cè)定試劑盒的臨床應(yīng)用與ELISA試劑盒比較臨床醫(yī)院使用實(shí)施例1的戊型肝炎病毒IgM抗體(抗-HAVIgM)化學(xué)發(fā)光法免疫分析測(cè)定試劑盒和ELISA試劑盒檢測(cè)臨床樣本662份，以對(duì)比兩種試劑盒檢測(cè)的符合率。一、臨床血清標(biāo)本的來(lái)源醫(yī)院臨床收集戊型肝炎病毒患者、非戊型肝炎病毒患者樣本及正常人血清標(biāo)本。二、使用戊型肝炎病毒IgM抗體(抗-HAVIgM)化學(xué)發(fā)光法免疫分析測(cè)定試劑盒與ELISA試劑盒比較一1、方法臨床分別使用本發(fā)明實(shí)施例1制備的"戊型肝炎病毒IgM抗體(抗_HAVIgM)化學(xué)發(fā)光法免疫分析測(cè)定試劑盒"(按其說(shuō)明書(shū)操作)和ELISA試劑盒(按其說(shuō)明書(shū)操作)檢測(cè)臨床樣本662份(急性戊肝55例、戊肝IgG抗體陽(yáng)性38例、健康人421例、類(lèi)風(fēng)濕因子陽(yáng)性血樣42例、乙型肝炎陽(yáng)性62例、曱型肝炎IgM抗體陽(yáng)性43例)，以對(duì)比兩種試劑盒檢測(cè)的符合率。2、結(jié)果臨床醫(yī)院使用實(shí)施例1的"戊型肝炎病毒IgM抗體(抗-HAVIgM)化學(xué)發(fā)光法免疫分析測(cè)定試劑盒"和ELISA試劑盒對(duì)比檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)表2)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>備注發(fā)明試劑檢出1例抗-HEVIgG血清樣，抗-HEVIgM陽(yáng)性；確認(rèn)為抗-HEVIgM陽(yáng)性對(duì)比試劑檢出1例抗-HAVIgM血清樣，抗-HEVIgM陽(yáng)性；確認(rèn)為假陽(yáng)性對(duì)比試劑檢出1例急性戊肝血清樣，抗-HEVIgM陰性；確認(rèn)為假陰性臨床醫(yī)院使用"戊型肝炎病毒IgM抗體(抗-HAVIgM)化學(xué)發(fā)光法免疫分析測(cè)定試劑盒"與ELISA試劑盒對(duì)比檢測(cè)結(jié)果表明本發(fā)明試劑盒的各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到或超過(guò)了ELISA法，且該試劑盒的特異性100%,敏感性100°/。；臨床試驗(yàn)中的1例抗-HEVIgG陽(yáng)性血清樣本，本發(fā)明試劑檢出抗-HEVIgM陽(yáng)性；1例急性HEV樣本血清ELISA試劑檢測(cè)抗—HEVIgM陰性、l例抗—HAVIgM血清標(biāo)本ELISA試劑檢出陽(yáng)性。3份血清樣經(jīng)臨床試驗(yàn)確認(rèn)，l例抗-HEVIgG陽(yáng)性血清樣本結(jié)果為陽(yáng)性，是屬于急性感染后期患者；1例急性HEV樣本血清臨床結(jié)果是陽(yáng)性，ELISA試劑結(jié)果是灰區(qū)標(biāo)本；1例抗-HAVIgM血清標(biāo)本臨床結(jié)果是陰性。本試劑盒與類(lèi)風(fēng)濕因子陽(yáng)性血清、乙肝陽(yáng)性血清、曱肝IgM陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)。發(fā)明的戊型肝炎病毒IgM抗體(抗-HAVIgM)化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒特異性、靈敏性、穩(wěn)定性均高于ELISA試劑盒，可以推廣應(yīng)用于臨床戊型肝炎疾病診斷。權(quán)利要求1、一種戊型肝炎病毒IgM抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒，其特征在于，本發(fā)明試劑盒包括戊型肝炎病毒IgM抗體陰、陽(yáng)性對(duì)照品；包被固相載體；酶標(biāo)記結(jié)合物；所述酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物液；以及濃縮洗滌液。2、如權(quán)利要求1所述本發(fā)明試劑盒，其特征在于，所述包被固相載體為抗人-u鏈抗體(單抗或多抗)包被的微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。3、如權(quán)利要求1所述本發(fā)明試劑盒，其特征在于，所述酶標(biāo)記結(jié)合物為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的戊型肝炎病毒重組抗原。4、如權(quán)利要求1所述本發(fā)明試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物為1,2-二氧乙烷類(lèi)衍生物、魯米諾或異魯米諾。5、如權(quán)利要求1所述本發(fā)明試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物包括A液和B液，其中，所述化學(xué)發(fā)光底物A液，包括10mM魯米諾、0.3mM4-羥基聯(lián)苯、0.05mM4-硪代苯基硼酸、0.2MpH8.7硼酸-硼砂緩沖液，其pH值為8.0~10.0;所述化學(xué)發(fā)光底物B液，包括3.5mM過(guò)氧化脲、0.l%Tween20、0.2MpH7.2磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.0-7.6。6、一種制備權(quán)利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟以戊型肝炎病毒IgM抗體陰、陽(yáng)性血清制備對(duì)照品；以抗人-jj鏈抗體(單抗或多抗)直接包被固相載體；以酶標(biāo)記重組戊型肝炎病毒抗原；配制酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物液；配制濃縮洗滌液；分裝上述戊型肝炎病毒IgM抗體陰、陽(yáng)性對(duì)照品、酶標(biāo)記的戊型肝炎病毒重組抗原、該酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物液及濃縮洗滌液；以及組裝為成品。7、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述包被固相載體的步驟2)采用以下方法制備用0.1MpH值為8.0的硼酸緩沖液配制成所需濃度的抗人-p鏈抗體，并將包被液負(fù)載于固相載體上；用含0.1%酪蛋白，1%蔗糖，0.01%明膠，0.1%Proclin300,pH值為7.0-7.5,濃度為0.01M的磷酸鹽緩沖液作為封閉液封閉上述的固相載體。8、如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述包被抗人-n鏈抗體(單抗或多抗)的固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。9、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶或石咸性》舞酸酶。10、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物為1,2-二氧乙烷類(lèi)衍生物、魯米諾或異魯米諾；所述l,2-二氧乙烷類(lèi)衍生物，為(金剛烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-曱氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-1,.2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。全文摘要本發(fā)明屬于臨床體外診斷免疫分析
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種化學(xué)發(fā)光法免疫分析測(cè)定戊型肝炎病毒IgM抗體的劑盒及其制備方法，本發(fā)明試劑盒制備方法包括以下步驟以戊型肝炎病毒IgM抗體陰、陽(yáng)性血清制備對(duì)照品；以抗人-μ鏈抗體(單抗或多抗)包被固相載體；以酶標(biāo)記戊型肝炎病毒重組抗原；配制酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物液；配制濃縮洗滌液；分裝上述戊型肝炎病毒IgM抗體的陰、陽(yáng)性對(duì)照品、標(biāo)記結(jié)合物、化學(xué)發(fā)光底物及濃縮洗滌液；及組裝為成品。本發(fā)明制備試劑盒的性能指標(biāo)(特異性、靈敏度、穩(wěn)定性)穩(wěn)定，可應(yīng)用于戊型肝炎早期診斷。文檔編號(hào)G01N33/543GK101551395SQ20081010326公開(kāi)日2009年10月7日申請(qǐng)日期2008年4月2日優(yōu)先權(quán)日2008年4月2日發(fā)明者于尚永,宋勝利,應(yīng)希堂,楊俊峰,胡國(guó)茂,鄭金來(lái)申請(qǐng)人:北京科美東雅生物技術(shù)有限公司