專利名稱：：檢測林可霉素藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，具體涉及一種用于檢測林可霉素藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特別適于動物組織和蜂蜜中林可霉素藥物殘留的檢測。技術(shù)背景林可霉素(lincomycin)又稱潔霉素或林肯霉素，是由鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的林可酰胺類抗生素(結(jié)構(gòu)式如圖1)，有較強(qiáng)的抑菌活性。其殘留通過食物鏈進(jìn)入人體后累積可以導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性，因此，各國都對其作出限量要求，我國農(nóng)業(yè)部235號文件規(guī)定其殘留限量為0.05ppm(雞蛋)，日本肯定列表規(guī)定其殘留限量為0.02ppm(雞可食用內(nèi)臟)。林可霉素殘留量的常規(guī)檢測方法主要有高效液相色譜(HPLC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MSMS)、紙色譜等，由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的過程以及對檢驗(yàn)人員的高技能要求，不適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本的篩查。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對上述不足提供一種用于林可霉素檢測的酶聯(lián)免疫試劑盒，其操作簡單適，適合現(xiàn)場大批量樣品的篩選。本發(fā)明試劑盒，它含有(1)包被有包被原的酶標(biāo)板(包被原為抗原、抗體或抗抗體)；(2)酶標(biāo)記物(為酶標(biāo)記半抗原(某些地方寫的是酶標(biāo)記半抗原，請確認(rèn)并統(tǒng)一)、酶標(biāo)記抗體或酶標(biāo)記抗抗體)；(3)林可霉素特異性抗體工作液(當(dāng)酶標(biāo)板上包被抗原且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)板上包被抗抗體且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原時(shí)含有)；(4)林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(5)底物顯色液；(6)終止液；(7)濃縮洗滌液；(s)濃縮復(fù)溶液。本發(fā)明所提供的檢測林可霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括林可霉素特異性抗體工作液及預(yù)包被包被原的酶標(biāo)板和酶標(biāo)記物工作液；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記的抗抗體，酶標(biāo)記林可霉素半抗原或酶標(biāo)記林可霉素特異性抗體；所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體。所述林可霉素半抗原是林可霉素通過琥珀酸酐法得到的。所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，其中優(yōu)選辣根過氧化物酶；酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體是釆用戊二醛法或過碘酸鈉法將標(biāo)記酶與抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到的；酶標(biāo)記林可霉素半抗原是釆用混合酸野或碳化二亞胺法將標(biāo)記酶與林可霉素半抗原偶聯(lián)得到的；酶標(biāo)記特異性抗體是釆用戊二醛法或過碘酸鈉法將標(biāo)記酶與特異性抗體偶聯(lián)得到的，辣根過氧化物酶可釆用現(xiàn)有技術(shù)中的多種方法將其與抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)，如戊二醛法，過碘酸鈉法等，本發(fā)明經(jīng)過長期的勞動創(chuàng)造將過碘酸鈉法進(jìn)行了改良，使其省時(shí)、降低辣根過氧化物酶(HRP)與抗抗體的濃度比率，節(jié)省了原材料。所述林可霉素特異性抗體可為林可霉素單克隆抗體或林可霉素多克隆抗體；它們均是用林可霉素半抗原與載體蛋白釆用混合酸酐法或碳化二亞胺法得到的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述林可霉素多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，所述林可霉素單克隆抗體優(yōu)選為林可霉素鼠單克隆抗體，所述林可霉素多克隆抗體優(yōu)選為林可霉素兔多克隆抗體。所述林可霉素單克隆抗體優(yōu)選為林可霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-l-3CGMCCNo.2398分泌的單克隆抗體。所述林可霉素單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-1-3CGMCCNo.2398(分類命名對林可霉素藥物的單克隆雜交瘤細(xì)胞株)已于2008年03月12曰保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京巿朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)。以上抗體均可以用林可霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原制備。所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白(BCG)、牛血清蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白和纖維蛋白原等常用載體蛋白；所述林可霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過將林可霉素半抗原和載體蛋白用混合酸酐法或碳化二亞胺法進(jìn)行偶聯(lián)得到。為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液。所述濃縮洗滌液優(yōu)選為1.0%~1.5%吐溫20和0.5%硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液。當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)，顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為終止液為12mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酯酶時(shí)，顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為12mol/L氫氧化鈉溶液。所述濃縮復(fù)溶液液優(yōu)選為含有5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。其中酶標(biāo)板在制備過程中所用的包被緩沖液優(yōu)選為pH值為6.7,0.05mol/L醋酸緩沖液，所用封閉液為含有5~10%山羊血清，10%酪蛋白的磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明中酶標(biāo)板的制備過程為用包被緩沖液將包被原稀釋成0.050.2嗎/ml，每孔加入lOO(il，37。C溫育2h,再4。C過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入15020(Hil封閉液，37t:溫育l~2h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存。本發(fā)明中抗原的合成過程為1.半抗原的合成將林可霉素釆用琥珀酸酐法得到，技術(shù)路線如圖2。2.林可霉素抗體的制備將林可霉素半抗原與載體蛋白釆用混合酸酐法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。免疫原的具體制備方法林可霉素是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。因此將林可霉素通過琥珀酸酐法合成林可霉素半抗原，這樣突出了林可霉素分子結(jié)構(gòu)中的特征基團(tuán)，使制備的林可霉素抗體對林可霉素的特異性很高。林可霉素鼠單克隆抗體的制備動物免疫程序釆用Balb/c小鼠作為免疫動物，以林可霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原，得到較好的多抗血清后，取出脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合。細(xì)胞融合與克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選細(xì)胞株，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。林可霉素兔多克隆抗體的制備釆用新西蘭大白兔作為免疫動物，以林可霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原對新西蘭大白兔進(jìn)行免疫，多次免疫后測定血清抗體效價(jià)得到多克隆抗體。本發(fā)明抗抗體的制備過程羊抗鼠抗抗體是以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病菌體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；羊抗兔抗抗體是以羊作為免疫動物，以兔源抗體為免疫原對無病菌體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗兔抗抗體。本發(fā)明所述試劑盒中林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，0|ig/L，0.2(ig/L，0.6ng/L，1.8|ig/L,5,4嗎/L，16.2|ig/L。本發(fā)明的檢測原理為當(dāng)在微孔條上預(yù)包被林可霉素偶聯(lián)抗原時(shí)，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入林可霉素特異性抗體溶液，樣本中殘留的林可霉素藥物與酶標(biāo)板上包被的林可霉素偶聯(lián)抗原竟?fàn)幜挚擅顾靥禺愋钥贵w，加入酶標(biāo)記抗抗體進(jìn)行放大作用，用顯色液顯色，樣本吸光值與林可霉素藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中林可霉素的殘留量。同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系列濃度的林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中林可霉素殘留量的濃度范圍。當(dāng)在微孔條上預(yù)包被林可霉素特異性抗體時(shí)，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入酶標(biāo)記林可霉素半抗原溶液，樣本中殘留的林可霉素藥物與酶標(biāo)記抗原竟?fàn)幇辉诿笜?biāo)板上的林可霉素特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與林可霉素藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中林可霉素的殘留含量。同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系列濃度的林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中林可霉素殘留量的濃度范圍。當(dāng)在微孔條上預(yù)包被林可霉素偶聯(lián)抗原時(shí)，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入酶標(biāo)記林可霉素特異性抗體溶液，樣本中殘留的林可霉素藥物與酶標(biāo)板上包被的林可霉素偶聯(lián)抗原竟?fàn)幜挚擅顾靥禺愋钥贵w，用顯色液顯色，樣本吸光值與林可霉素藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中林可霉素的殘留含量。同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系列濃度的林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中林可霉素殘留量的濃度范圍。當(dāng)在微孔條上預(yù)包被抗抗體時(shí)，加入林可霉素抗體孵育后，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入酶標(biāo)記林可霉素偶聯(lián)抗原溶液，樣本中殘留的林可霉素藥物與酶標(biāo)記林可霉素偶聯(lián)抗原竟?fàn)幜挚擅顾靥禺愋钥贵w，用顯色液顯色，樣本吸光值與林可霉素藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中林可霉素的殘留含量。同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系列濃度的林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中林可霉素殘留量的濃度范圍。本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒監(jiān)測林可霉素藥物的方法，它包括步驟(1)樣品前處理；(2)用試劑盒進(jìn)行檢測；(3)分析檢測結(jié)果。樣品的前處理主要是為了從樣品中獲得林可霉素溶液，從而用于后續(xù)的檢測。下面是常見的幾種樣品的前處理方法1、雞肉、肝臟樣品的前處理方法稱取2.0g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入10ml甲醇-鹽酸溶液，振蕩5min，3000g以上，室溫離心5min,移取200(xl上清液，加入600|il復(fù)溶液充分混勻，取50pl用于分析；2、蜂蜜樣品前處理方法稱取l.O蜂蜜至50ml聚苯乙烯離心管中，加入5ml去離子水，用渦旋儀渦動至蜂蜜全部溶解，再使用振蕩器振蕩5min;3000g以上，室溫離心5min;取上層清液lml,加入lml復(fù)溶液用渦旋儀渦動30s;取50iil用于分析。本發(fā)明中用試劑盒檢測時(shí)當(dāng)包被原為林可霉素偶聯(lián)抗原時(shí)，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液再加入抗體，溫育后洗滌拍干，再加入酶標(biāo)抗抗體，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；當(dāng)包被原為林可霉素偶聯(lián)抗原時(shí)，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液再加入酶標(biāo)記抗體，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；當(dāng)包被原為林可霉素特異性抗體時(shí)，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液再加入酶標(biāo)記林可霉素半抗原，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；當(dāng)包被原為抗抗體時(shí)，向酶標(biāo)板微孔中加入林可霉素抗體，溫育后洗滌拍干，再加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液后加入酶標(biāo)林可霉素半抗原，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值。本發(fā)明中檢測結(jié)果分析過程為用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(Bo)再乘以100。/。，即百分吸光度值。計(jì)算公式為百分吸光度值(％)=(B/Bq)xl00%以林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度(嗎/L)的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本中林可霉素的殘留量。本發(fā)明中檢測結(jié)果的分析也可以釆用回歸方程法，計(jì)算出樣品溶液濃度。本發(fā)明中檢測結(jié)果的分析還可以利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件，此法更便于大量樣品的快速分析，整個(gè)檢測過程只需1.5小時(shí)可以完成。本發(fā)明檢測林可霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒主要釆用間接競爭ELISA方法定性或定量檢測樣品中林可霉素的殘留量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時(shí)快速檢測大批量樣品；釆用高特異性的林可霉素單克隆抗體，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、價(jià)格便宜、攜帶便利、檢測方法高效、準(zhǔn)確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量。本發(fā)明的試劑盒將在林可霉素的檢測中發(fā)揮重要作用。圖l:林可霉素類抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)通式；圖2:林可霉素半抗原合成技術(shù)路線；圖3:標(biāo)準(zhǔn)品林可霉素濃度。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l試劑盒組分的制備l.抗原的合成a.半抗原的合成將林可霉素釆用琥珀酸酐法得到具有羧基官能團(tuán)的半抗原。半抗原的具體步驟稱取2.3g林可霉素和0.5g琥珀酸酐放入50ml圓底燒瓶中加無水吡啶至完全溶解，7(TC加熱攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)東后，減壓蒸餾去溶劑，殘余物用丙酮洗滌數(shù)次，用乙酸乙酯-正己烷使其結(jié)晶，得半抗原林可霉素-琥珀酸酐。b.免疫原合成將林可霉素半抗原與牛血清白蛋白釆用混合酸酐法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。免疫原的制備過程取5.8mg林可霉素半抗原用0.1mlDMF溶解，冷卻至10°C,力口2|il氯甲酸異丁酯，l(TC攪拌反應(yīng)30分鐘，60mg牛血清白蛋白用2ml50mmol/LNa2CO3溶解，10。C反應(yīng)4小時(shí)，然后4'C過夜，過柱，用緩沖液平衡和洗脫，合并含有牛血清白蛋白的洗脫管內(nèi)液體，進(jìn)一步純化后得到免疫原。c.包被原林可霉素偶聯(lián)抗原的制備將林可霉素半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)得到包被原。包被原的制備過程取5.8mg林可霉素半抗原用O.lmlDMF溶解，冷卻至1(TC，加2pl氯甲酸異丁酯，l(TC攪拌反應(yīng)30分鐘，30mg卵清蛋白用2ml50mmol/LNa2CO3溶解，1(TC反應(yīng)4小時(shí)，然后4"C過夜，過柱，用緩沖液平衡和洗脫，合并含有卵清蛋白的洗脫管內(nèi)液體，進(jìn)一步純化后得到包被原。單克隆抗體的制備a.動物免疫將免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為100jiig,/只，使其產(chǎn)生多克隆抗體血清。b.細(xì)胞融合和克隆化小鼠血清測定結(jié)果較高后，取其脾細(xì)胞，按7:l比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，釆用間接竟?fàn)嶦LISA測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)條選得到林可霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-1-3CGMCCNo.2398。林可霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株可以無限量的產(chǎn)生林可霉素特異性抗體，且該抗體特異性是針對林可霉素的，靈敏度能達(dá)到0,2|ig/L。c.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇將林可霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株用凍存液制成lxl(^個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液氣中長期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37'C水洛中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。d.單克隆抗體的生產(chǎn)與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7天后腹腔注射林可霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株5><107個(gè)/只，7天后釆集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，-20匸保存。2.多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以林可霉素與牛血清白蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為1.5mg/kg,首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔34周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫10天后采血，測定血清抗體效價(jià)，心臟采血，用硫酸銨分級沉淀得到純化的多克隆抗體。3.羊抗鼠抗抗體的制備過程以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；羊抗兔抗抗體的制備以羊作為免疫動物，以兔源抗體為免疫原對無病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗兔抗抗體。4.酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液將林可霉素偶聯(lián)抗原、抗體或抗抗體稀釋成0.05-0.2昭/m1,每孔加入lO(Hil,37"C溫育2h或4°。過夜，傾去包被液，用稀釋20倍的濃縮洗滌液洗滌2次，每次30秒，拍干，然后再每孔中加入200^1封閉液，37'C溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。5.酶標(biāo)記羊抗鼠抗抗體的置備將抗抗體與辣根過氧化物酶(HRP)釆用改良后的過碘酸鈉法進(jìn)行偶聯(lián)。傳統(tǒng)的過碘酸鈉法要求反映體系中酶與抗抗體的摩爾濃度比為4:1;由于辣根過氧化物酶在強(qiáng)氧化的作用下產(chǎn)生許多與抗抗體結(jié)合的位點(diǎn)，這樣活化的辣根過氧化物酶分子充當(dāng)了連接各分子的橋梁，降低了酶標(biāo)記物的酶活性，使制備的偶聯(lián)物中混有許多聚合體，為了解決這個(gè)問題，我們將傳統(tǒng)的方法進(jìn)行了改良，即1)省去了氨基的封閉過程，因?yàn)槟墚a(chǎn)生自身氨基連接的氨基實(shí)際很少。2)降低了辣根過氧化物酶抗抗體的摩爾濃度比率至2:1，改良后的方法比傳統(tǒng)的方法簡便，對酶的活性的損失減少。實(shí)施例2檢測林可霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建組建檢測林可霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被林可霉素偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板；(2)用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體；(3)林可霉素單克隆抗體工作液；(4)林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0嗎/L、0.2嗎/L、0.6ng/L、1.8|ig/L、5.4嗎/L、16.2|ng/L;(5)底物顯色液由A液和B液組成，底物顯色液A液為過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺；(6)終止液為2mol/L鹽酸；(7)濃縮洗滌液為1.0%~1.5%吐溫20和0.5%硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液。(8)濃縮復(fù)溶液為含有5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。實(shí)施例3樣品中林可霉素的檢測1.樣品前處理a)動物組織(雞肉、雞肝、豬肉、豬肝等)稱取2.0g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入10ml甲醇-鹽酸溶液，振蕩5min，3000g以上，室溫離心5min,移取200|^1上清液，加入600nl復(fù)溶液充分混勻，取50pl用于分析。b)蜂蜜樣本蜂蜜樣本中處理方法稱取l.Og蜂蜜至50ml聚苯乙烯離心管中，加入5ml去離子水，用渦旋儀渦動至蜂蜜全部溶解，再使用振蕩器振蕩5min,3000g以上，室溫離心5min，取上層清液lml，加入lml復(fù)溶液用渦旋儀渦動30s,取50ial用于分析。2.用試劑盒檢測向包被有林可霉素偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板微孔中加入林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液再加入林可霉素單克隆抗體工作液50nl，用蓋板模封板，25'C恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔內(nèi)液體，每孔加入250|il洗滌液，30s后倒出孔內(nèi)液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液100|_d,25。C恒溫箱中反應(yīng)30min,倒出孔內(nèi)液體，重復(fù)洗板步驟，每孔加入底物顯色液A液過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB),輕輕振蕩混勻，25。C恒溫箱避光顯色15min,每孔加入2mol/L終止液鹽酸50)nl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀波長設(shè)定在450nm處，測定每孔吸光度值(OD值)。3.檢測結(jié)果分析用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(Bo)再乘以100%，得到百分吸光度值。以林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(|ig/L)的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度，則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出林可霉素的殘留量。實(shí)驗(yàn)例l標(biāo)準(zhǔn)品精密度試驗(yàn)分別從三個(gè)不同的時(shí)間段制備的酶標(biāo)板中各抽出一批酶標(biāo)板，每批各抽取10個(gè)試劑盒，每板各抽出20個(gè)微孔，測定1.8嗎/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，計(jì)算變異系數(shù)。_表1標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)性試驗(yàn)(cv%)_<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>通過上述試驗(yàn)結(jié)果可以得出，每批試劑盒各IO次標(biāo)準(zhǔn)品變異系數(shù)在4.2%-15.7%之間，符合精密度小于或等于25%的規(guī)定。實(shí)驗(yàn)例2樣本精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)1.樣品精密度試驗(yàn)以20ng/L濃度的林可霉素對肌肉、肝臟、蜂蜜進(jìn)行添加測定，分別取三個(gè)不同批次的試劑盒各五個(gè)，每個(gè)濃度重復(fù)5次，分別計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果見表2~4.異系數(shù)，結(jié)果見表2~4。表2肌肉樣本可重復(fù)性試?yán)?lt;table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表4蜂蜜樣本可重復(fù)性試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>結(jié)果表明肌肉、肝臟、蜂蜜樣本的變異系數(shù)均在3.7%-15.8%之間，符合了《農(nóng)業(yè)部文件》農(nóng)醫(yī)發(fā)200517號附件2試劑盒備案參考評判標(biāo)準(zhǔn)中第四點(diǎn)精密度標(biāo)準(zhǔn)。b.樣本準(zhǔn)確度試驗(yàn)取兩個(gè)濃度的林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別為20|ig/kg(L)、40嗎/kg(L)，分別對樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度做4個(gè)平行，分別計(jì)表5試劑盒的準(zhǔn)確度<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>結(jié)果表明肌肉樣本添加回收率在78.2%-98.3%之間，肝臟樣本的添加回收率在75.6%-97.2°/。之間，蜂蜜樣本添加回收率在86.7%隱107.4%之間。實(shí)驗(yàn)例3交叉反應(yīng)率試驗(yàn)選擇與林可霉素有類似結(jié)構(gòu)和類似功能的5種藥物測定交叉反應(yīng)率，通過各種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其50%抑制濃度。用下式計(jì)算試劑盒對其它藥物的交叉反應(yīng)率。交叉反應(yīng)率越大，那么此試劑盒對林可霉素的檢測的特異性就越好。交叉反應(yīng)率(％)=(引起50%抑制林可霉素的濃度/引起50%抑制的類似物濃度)xl00%表6試劑盒的特異性<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實(shí)驗(yàn)例4試劑盒保存條件為28'C,經(jīng)過6個(gè)月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50%抑制濃度、林可霉素添加實(shí)際測定值均在正常范圍之內(nèi)?？紤]在運(yùn)輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37'C保存條件下放置6天，進(jìn)行加速老化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求。考慮到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-2(TC冰箱冷凍5天，測定結(jié)果也表明試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在28。C至少可以保存6個(gè)月以上。權(quán)利要求1、一種檢測林可霉素藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于它含有(1)包被有包被原的酶標(biāo)板；(2)酶標(biāo)記物；(3)林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(4)底物顯色液；(5)終止液；(6)濃縮洗滌液；(7)濃縮復(fù)溶液，所述包被原為林可霉素抗原、抗體或抗抗體，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記林可霉素抗原、酶標(biāo)記林可霉素抗體或酶標(biāo)記抗抗體，當(dāng)酶標(biāo)板上包被抗原且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)板上包被抗抗體且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原時(shí)還含有林可霉素特異性抗體工作液。2、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述林可霉素抗原是由林可霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述林可霉素抗體是由所述抗原制備獲得，其中所述林可霉素半抗原為林可霉素-琥珀酸酐。3、如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述林可霉素抗體為單克隆抗體。4、如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述林可霉素抗體由雜交瘤細(xì)胞株C-l-3CGMCCNo.2398分泌產(chǎn)生。5、如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述載體蛋白為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白或纖維蛋白原。6、如權(quán)利要求書l或2所述的試劑盒，其特征在于所用包被緩沖液為pH值為6.7,0.05mol/L醋酸緩沖液，所用封閉液為含有5~10%山羊血清，10%酪蛋白的磷酸鹽緩沖液。7、如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶，當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)，底物顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，底物顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為12mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶標(biāo)記酶為細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶時(shí)，底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為12mol/L氫氧化鈉。8、如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于濃縮洗滌液為1.0%~1.5%吐溫20和0.5%硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液；濃縮復(fù)溶液為含有5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液，林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度分別為0嗎/L，0.2昭/L，0.6嗎/L,1.8pg/L，5.4pg/L,16.2嗎/L。9、權(quán)利要求18任一項(xiàng)所述的試劑盒在檢測林可霉素藥物殘留中的應(yīng)用。10、一種檢測樣品林可霉素藥物殘留的方法，包括步驟(1)樣品前處理；(2)用權(quán)利要求l-8任一項(xiàng)所述的試劑盒進(jìn)行檢測；(3)分析檢測結(jié)果。全文摘要本發(fā)明提供了一種檢測林可霉素藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒，它含有包被有包被原的酶標(biāo)板，酶標(biāo)記物，林可霉素特異性抗體工作液(當(dāng)酶標(biāo)板上包被抗原且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)板上包被抗抗體且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原時(shí)含有)，林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，底物顯色液，終止液，濃縮洗滌液，濃縮復(fù)溶液。本發(fā)明還公開了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測林可霉素的方法，它包括首先進(jìn)行樣品前處理，然后用試劑盒進(jìn)行檢測，最后分析檢測結(jié)果。本發(fā)明提供的酶聯(lián)免疫試劑盒可用于檢測動物組織(肌肉、肝臟)和蜂蜜等樣品中林可霉素的殘留量，其操作簡便、費(fèi)用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本的篩查。文檔編號G01N33/577GK101256188SQ200810104129公開日2008年9月3日申請日期2008年4月16日優(yōu)先權(quán)日2008年4月16日發(fā)明者萬宇平,何方洋,余厚美,靜馮,馮才偉,馮才茂,勇李,沈建忠,趙正苗,馬孝斌申請人:北京望爾康泰生物技術(shù)有限公司;北京望爾生物技術(shù)有限公司