專利名稱：：一種檢測(cè)甲狀腺球蛋白的化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)免疫檢測(cè)分析
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地提供了一種人曱狀腺球蛋白酶促化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定試劑盒，適用于曱狀腺球蛋白的酶促化學(xué)發(fā)光檢測(cè)分析。
背景技術(shù)：
：曱狀腺球蛋白(Tg)是一分子量約為660kD的糖蛋白，在曱狀腺主要激素如曱狀腺素、三碘曱腺原氨酸的合成中起激素原的作用。在曱狀腺瘤、亞急性曱狀腺炎、橋本曱狀腺炎和葛瑞夫氏病中，Tg的數(shù)目會(huì)增多；測(cè)量Tg的濃度水平有助于嬰兒天生甲狀腺^f幾能減退癥狀的治療。目前測(cè)定Tg的方法有直接竟?fàn)幑滔喾派涿庖叻治?RIA)和雙抗體夾心免疫放射分析法(IMRA)或酶聯(lián)免疫分析法(ELISA),這些方法都會(huì)受到機(jī)體本身的曱狀腺球蛋白自身抗體的干擾，而且放射免疫分析方法存在對(duì)操作人員有放射性危害、廢棄物處理、產(chǎn)品保質(zhì)期短、操作時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題；酶聯(lián)免疫分析法存在靈敏度較低，操作步驟繁瑣，操作時(shí)間周期長(zhǎng)，易造成結(jié)果假陽(yáng)性或假陰性等問(wèn)題。從而需要人們尋找一種更為安全、靈敏和可靠的免疫檢測(cè)分析方法，而最近幾年使用化學(xué)發(fā)光為檢測(cè)技術(shù)的測(cè)定試劑盒開始初露端倪。把高靈敏的化學(xué)發(fā)光分析方法和特異性強(qiáng)的免疫分析方法相結(jié)合發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)具有化學(xué)發(fā)光分析的高靈敏度和免疫分析法的高選擇性的新的免疫分析技術(shù)。1985年第一代化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒研制成功并投放市場(chǎng)。進(jìn)入九十年代，化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒的研制和自動(dòng)化測(cè)量?jī)x的生產(chǎn)取得了突破性進(jìn)展，從而進(jìn)入高速發(fā)展階段?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是繼熒光、放射性同位素和酶免疫分析之后發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的免疫分析技術(shù)，根據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及臨床應(yīng)用資料，從實(shí)用性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性及發(fā)展前景來(lái)看，在非放射性標(biāo)記分析技術(shù)中化學(xué)發(fā)光免疫分析處于領(lǐng)先地位，代表了當(dāng)今世界發(fā)展的方向和潮流，它不僅具有免疫反應(yīng)的特異性，而且具有化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的高靈敏性(檢測(cè)限可達(dá)l(r"-l(T'8mol/L)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)具有靈敏度高、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、效期長(zhǎng)并安全無(wú)毒無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，成為取代放射免疫分析和酶免疫分析技術(shù)的首選。本發(fā)明用高活性的酶標(biāo)記抗體，以1,2-二氧乙烷類衍生物或魯米諾、異魯米諾及增強(qiáng)劑為發(fā)光底物，檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)，其靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于酶聯(lián)免疫方法中檢測(cè)顯色底物的吸光度的靈敏度。本發(fā)明既有效地利用了高特異的免疫方應(yīng)，又使用了化學(xué)發(fā)光技術(shù)確保了檢測(cè)的靈敏度，使用本試劑盒可以快速靈敏地檢測(cè)血清樣本中甲狀腺球蛋白的含量，為臨床診斷提供有價(jià)值的參考指標(biāo)。
發(fā)明內(nèi)容首先，本發(fā)明提供了一種化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定曱狀腺球蛋白的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包括以下組分曱狀腺球蛋白校準(zhǔn)品；曱狀腺球蛋白抗體包被的固相載體；酶標(biāo)記的甲狀腺球蛋白抗體；化學(xué)發(fā)光底物液；以及濃縮洗涂液。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，所述固相載體為微孔板、塑料珠或塑料管。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，所述酶為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶，優(yōu)選的所述酶為辣根過(guò)氧化物酶。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，所述化學(xué)發(fā)光底物液的發(fā)光劑為1,2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾。其次，本發(fā)明提供了制備上述試劑盒的方法。其步驟如下以曱狀腺球蛋白純品配制校準(zhǔn)品；以曱狀腺球蛋白抗體包被固相載體；制備酶標(biāo)記的甲狀腺球蛋白抗體；配制化學(xué)發(fā)光底物液；分裝上述組分并組裝為試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的方法，所述曱狀腺球蛋白抗體包被固相載體的步驟包括以下步驟采用0.020MpH值為4.2的磷酸緩沖液與適當(dāng)濃度的甲狀腺球蛋白抗體混合制成包被液，并將其負(fù)載于固相載體上，使用封閉液封閉。配制封閉液為，lOOOmL所述封閉液中包含0.2gNaH2P042H20、2.9gNaH2P0412H20、10g水解明膠和lmL生物防腐劑，pH值為7.0-7.6,然后將所得封閉液負(fù)載于上述固相載體上。在上述方法中，所述固相載體為微孔板、塑料珠或塑料管，優(yōu)選的，曱狀腺球蛋白抗體包被的微孔板為96孔的微孔板條。在上述方法中，所述酶為堿性磷酸酶或辣才艮過(guò)氧化物酶，優(yōu)選的，所述酶為辣根過(guò)氧化物酶。所述化學(xué)發(fā)光底物液的發(fā)光劑為1,2-二氧乙烷類衍生物或魯米諾、異魯米諾。在上述方法中，優(yōu)選的，所述化學(xué)發(fā)光底物液包含A液和B液，其中，lOOOmL所述化學(xué)發(fā)光底物A液，包括1.7716g魯米諾、0.051g4-羥基聯(lián)苯、0.012g4-碘苯硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂，其pH值為8.0~10.0;lOOOmL所述化學(xué)發(fā)光底物B液，包括0.329g過(guò)氧化脲、lmlTween20、51.58gNa2HP0412H20、8.74gNaH2P04.2H20，其pH值為7.0~7.6。在上述方法中，所述濃縮洗滌液包括Na2HP0412H20，87g;NaH2P042H20,3g;NaCl,240g;Tween-20，1.5mL;Proclin300,1.5mL;雙蒸水，定溶至lOOOmL;調(diào)整pH至7.2-7.4。使用時(shí)用雙蒸水稀釋30倍。上述方法中，所述配制曱狀腺球蛋白校準(zhǔn)品的原料為標(biāo)準(zhǔn)級(jí)，純度不低于90%。本發(fā)明的試劑盒應(yīng)用酶催化發(fā)光底物，通過(guò)檢測(cè)發(fā)光底物產(chǎn)生的光信號(hào)代替酶聯(lián)免疫分析中的顯色底物，具有與酶聯(lián)免疫分析同等的特異性，而檢測(cè)光信號(hào)的靈敏度要比檢測(cè)顯色底物的吸光度要靈敏的多，可為曱狀腺球蛋白抗體的診斷提供更為特異、快速、可靠的依據(jù)。本發(fā)明解決了以往檢測(cè)方法的缺陷，即去除了放射免疫分析對(duì)操作人員的放射性危害，解決的廢棄物的處理問(wèn)題，使產(chǎn)品的保存期更長(zhǎng)，大大提高了分析方法的靈敏度，簡(jiǎn)化了操作步驟并節(jié)省了操作時(shí)間，提供了一種能夠簡(jiǎn)便、快速、靈敏、穩(wěn)定地檢測(cè)曱狀腺球蛋白的試劑盒。圖1為實(shí)施例1所制備的試劑盒校準(zhǔn)曲線的線性圖。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1制備本發(fā)明的曱狀腺球蛋白化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒一、酶標(biāo)抗體的制備及酶標(biāo)抗體濃度的選定1.曱狀腺球蛋白抗體用戊二醛氧化法與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)，用PBS充分透析，加等量?jī)?yōu)質(zhì)丙三醇，-20。C以下保存。具體的1)將lOmgHRP溶于0.2mL含1.25%戊二醛的0.lmol/LPH6.8的PBS中，置室溫18小時(shí)，充分透析除去多余戊二趁；2)加生理鹽水至lmL,然后加入5mg純化的抗體球蛋白及0.lmLPH9.6的1mol/L碳酸鹽緩沖液，混合后于4'C冰箱放置24小時(shí)；3)加入0.lmL0.2mol/L的賴氨酸溶液，室溫置2小時(shí)；4)用PH7.2、0.15mol/LPBS充分透析，藉離心除去沉淀，上清即為酶結(jié)合物。2.酶標(biāo)抗體稀釋液的配制三羥甲基氨基曱烷C4HN0312.1g鹽酸HC1調(diào)PH至7.5氟化鈉NaCl8.8g牛血清白蛋白BSA10gProclin3001.0mL食品紅0.1mL純化水H20加至1000mL3.采用方陣法選擇酶標(biāo)抗體的工作濃度范圍為1:500-1:5000。二、曱狀腺球蛋白校準(zhǔn)品的制備用含100。/。小牛血清稀釋甲狀腺球蛋白純品至2、10、40、100、250ng/mL，So為稀釋液，分裝成每瓶O.5mL，-20。C保存。三、固相微孔板制備(1)包被采用lOOOmL的磷酸包被緩沖液，其中包含0.78gNaH2P04.2H20，調(diào)整pH至4.2,加入適量曱狀腺球蛋白抗體混勻，然后加入微孔板各孔中，每孔110UL，4'C過(guò)夜。棄去孔中溶液，在吸水紙上拍干。(2)封閉，該封閉液組分包括NaHzPO,2H200.2gNa2HP04.12H202.9g水解明膠10gProclin300lmL雙蒸水lOOOraL將上述試劑稱量好^t入潔凈容器中，加雙蒸水定容，溶解混勻，測(cè)定pH值為7.2。每孔分別加入封閉液30<VL,室溫放置3小時(shí)。甩掉封閉液，在吸水紙上拍干。室溫除濕干燥24小時(shí)后進(jìn)行封袋，置28。C保存。四、化學(xué)發(fā)光底物液本實(shí)施例所使用的化學(xué)發(fā)光底物液的配制方法lOOOmL所述化學(xué)發(fā)光底物A液，包括1.7716g魯米諾、0.051g4-羥基聯(lián)苯、0.012g4-硤苯硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂，其pH值為8.0~10.0;lOOOmL所述化學(xué)發(fā)光底物B液，包括0.329g過(guò)氧化脲、lmLTween20、51.58gMP0412眼8.74gNaH2P04.2眼其pH值為7.0~7.6。使用前將A液與B液按1:1比例混合后使用。五、濃縮洗滌液，其組分包括Na2HP0412H2087gNaH2P0,.2H203gNaCl240gTween-201.5mLProclin3001.5mL雙蒸水1000mL調(diào)整pH至7.2~7.4。使用時(shí)用雙蒸水稀釋30倍.六、組裝試劑盒將上述組分分裝，隨機(jī)抽取三份，經(jīng)過(guò)各項(xiàng)方法學(xué)指標(biāo)檢定合格后，組裝成曱狀腺球蛋白測(cè)定試劑盒(附使用說(shuō)明書)。實(shí)施例2制備本發(fā)明的甲狀腺球蛋白化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒除以塑料珠作為栽體外，其余均以與實(shí)施例1相同的方法制備曱狀腺球蛋白化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒。實(shí)施例3制備本發(fā)明的甲狀腺球蛋白化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒除以塑料管作為載體外，其余均以與實(shí)施例1相同的方法制備曱狀腺球蛋白化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒。實(shí)施例4制備本發(fā)明的曱狀腺球蛋白化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒1、改良的戊二醛交聯(lián)法標(biāo)記堿性磷酸酶(ALP)1)取ALP2.Omg和抗體4.Omg，分別溶于生理鹽水中，混合，最終體積控制在0.50ml;2)加入0.50ml1%的戊二醛，室溫磁力攪拌15min后，避光反應(yīng)4h;3)加入1.Omol/L的乙醇胺0.10ml，室溫溫育2h;4)4。C條件下用PBS加磁力攪拌過(guò)夜透析，更換透析液三至四次；5)將透析產(chǎn)物移入試劑瓶加入等體積甘油，混勻，加入iy。BSA，密閉冷凍保存?zhèn)溆谩?、本實(shí)施例所使用的堿性磷酸酶(ALP)的化學(xué)發(fā)光底物液的配制方法lOOOmL所述化學(xué)發(fā)光底物液，包括24gTris、160gNaCl、4gKC1、15mlHC1、lmlProclin300、200mlAMPPD、1000ml雙蒸水。除使用堿性磷酸酶標(biāo)記抗體，及所使用的化學(xué)發(fā)光底物液不同外，本實(shí)施例其余均以與實(shí)施例1相同的方法制備甲狀腺球蛋白化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒。實(shí)施例5本發(fā)明的試劑盒的^f吏用方法以上實(shí)施例1制備的曱狀腺球蛋白化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒的具體使用方-法如下1)將包被好的固相栽體(微孔板條)、校準(zhǔn)品/待測(cè)樣品、化學(xué)發(fā)光底物液、酶標(biāo)記抗體從4X:冰箱中取出，平衡至室溫；2)配制洗滌緩沖液將試劑盒提供的洗滌液緩沖液加雙蒸水30倍稀釋；3)在板架上固定已包被好的微孔板條；4)反應(yīng)孔中分別加待測(cè)樣品和各濃度校準(zhǔn)品每孔加0、2、10、40、100、250ng/mL各25|jL,室溫反應(yīng)60min;5)用洗滌緩沖液在自動(dòng)洗板機(jī)上或者手工洗板5次，在吸水紙上拍干；6)各孔加入酶標(biāo)抗體工作液100pl，于微量振蕩器上振蕩30秒混勻，放室溫反應(yīng)60min，洗板5次，在吸水紙上拍干；7)每孔加化學(xué)發(fā)光底物100yL，振蕩混勻，室溫(20-28'C)反應(yīng)IO分鐘；8)在化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x上依序測(cè)量各孔的發(fā)光強(qiáng)度(RLU),測(cè)量時(shí)間1秒/孔；9)分別對(duì)校準(zhǔn)品濃度和對(duì)應(yīng)RLU取對(duì)數(shù)，在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)圖上建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以校準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，RLU值為縱坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，見附圖1,以各待測(cè)血清RLU值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出該血清的曱狀腺球蛋白的濃度；10)打印檢測(cè)結(jié)果報(bào)告。實(shí)施例6本發(fā)明的試劑盒的方法學(xué)檢定方法的精密性1)分析內(nèi)精密度用兩份正常人血清配制成低、高質(zhì)控血清，在同一批實(shí)驗(yàn)中測(cè)定它們的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值，每個(gè)質(zhì)控血清平行做10孔，本試劑盒的分析內(nèi)精密度CV<15.0%。表l分析內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>方法的靈敏度以S。校準(zhǔn)品進(jìn)行10次重復(fù)測(cè)定，其平均值加上兩倍標(biāo)準(zhǔn)差求出所對(duì)應(yīng)的濃度值，分別用不同批次的試劑和校準(zhǔn)曲線進(jìn)行三次試驗(yàn)，求出平均濃度值作為本試劑盒的靈敏度。經(jīng)三次實(shí)驗(yàn)其平均靈敏度為0.4ng/mL。方法的準(zhǔn)確性向lmL正常人血清(測(cè)定值為20.Ong/mL)中分別加入已知濃度為1000ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)原料8nL，30uL，60pL，150yL,然后用同一批號(hào)的藥盒，分別進(jìn)行新生產(chǎn)的試劑盒和37°C已經(jīng)存放10天試劑盒的重復(fù)檢測(cè)。結(jié)果表明理論濃度值與實(shí)測(cè)濃度值的偏倚不超過(guò)土10%,在不同劑量水平所做樣品的回收率均符合檢測(cè)要求(100±10%),其結(jié)果見表3.表3準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>特異性將80ng/mL的Tg4mL分成4份各lmL，每份各加入lmL250ng/mL的T4、7.5ng/mL的T3lmL、3.2ng/mL的rT3lmL和lmL的Tg零標(biāo)準(zhǔn)(對(duì)照)，同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表5。表5T3、T"rT3對(duì)Tg檢測(cè)的干擾情況<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>以上結(jié)果表明"曱狀腺球蛋白化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒，，的精密性、準(zhǔn)確性、靈敏度、穩(wěn)定性和特異性是完全符合要求的。實(shí)施例7使用本發(fā)明的試劑盒與DRG公司的Tg酶聯(lián)免疫試劑盒的比較為驗(yàn)證本發(fā)明試劑盒的應(yīng)用實(shí)際性，特與DRG公司酶聯(lián)試劑盒進(jìn)行了對(duì)比，對(duì)比結(jié)果如表6所示。表6本發(fā)明試劑盒與DRG酶聯(lián)免疫試劑盒的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>上述結(jié)果表明，本發(fā)明試劑盒的靈敏度和精密度優(yōu)于酶聯(lián)試劑盒。權(quán)利要求1、一種甲狀腺球蛋白化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括甲狀腺球蛋白校準(zhǔn)品；甲狀腺球蛋白抗體包被的固相載體；酶標(biāo)記的甲狀腺球蛋白抗體；化學(xué)發(fā)光底物液；以及濃縮洗滌液。2、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述曱狀腺球蛋白包被的固相載體是微孔板、塑料珠或塑料管。3、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒使用的固相載體材料為透明聚苯乙烯、聚乙烯或者聚丙烯。4、一種制備權(quán)利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于，包括以下步驟以曱狀腺球蛋白純品配制校準(zhǔn)品；以甲狀腺球蛋白抗體包被固相載體；制備酶標(biāo)記的曱狀腺球蛋白抗體；配制化學(xué)發(fā)光底物液；配制濃縮洗滌液；分裝上述組分并組裝為試劑盒。5、如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述酶為堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶。6、如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物液的發(fā)光劑為1，2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾。7、如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述l,2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-l，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-曱氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-l,2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。8、如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述發(fā)光劑為魯米諾或異魯米諾，化學(xué)發(fā)光底物液包括A液和B液其中，基于1000mL所述化學(xué)發(fā)光底物A液，包括l.7716g魯米諾、0.051g4-羥基聯(lián)苯、0.012g4-碘苯硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂，其pH值為8.0~10.0;基于1000mL所述化學(xué)發(fā)光底物B液，包括0.329g過(guò)氧化脲、lmLTween20、51.58gNa2HP0412眼8.74gNaH2P04.2H20,其pH值為7.0~7.6。9、如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述曱狀腺球蛋白抗體包被固相載體的步驟，釆用以下方法用0.020MpH值為4.2的磷酸緩沖液與適當(dāng)濃度的曱狀腺球蛋白抗體混合制成包被液，并將其負(fù)載于固相載體上，用封閉液封閉后，干燥封板。10、如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述濃縮洗涂液組分包括Na2HP04,12H20，87g;NaH2P04.2H20,3g;NaCl,240g;Tween-20,1.5mL;Proclin300,1.5mL;雙蒸水，定溶至lOOOmL;調(diào)整pH至7.2~7.4。使用時(shí)用雙蒸水稀釋30倍。全文摘要本發(fā)明的試劑盒應(yīng)用酶催化發(fā)光底物，通過(guò)檢測(cè)發(fā)光底物產(chǎn)生的光信號(hào)代替酶聯(lián)免疫分析中的顯色底物的吸光度，具有與之同等的特異性，而檢測(cè)光信號(hào)的靈敏度要高于檢測(cè)顯色底物的吸光度，可為甲狀腺球蛋白的診斷提供更為特異、快速、可靠的依據(jù)。本發(fā)明提供了一種能夠簡(jiǎn)便、快速、靈敏、穩(wěn)定地檢測(cè)甲狀腺球蛋白的試劑盒及其制備方法。文檔編號(hào)G01N33/68GK101377512SQ20081010414公開日2009年3月4日申請(qǐng)日期2008年4月16日優(yōu)先權(quán)日2008年4月16日發(fā)明者于尚永,宋勝利,應(yīng)希堂,胡國(guó)茂,鄭金來(lái),輝靳申請(qǐng)人:北京科美東雅生物技術(shù)有限公司