專利名稱：一種提高樣本分類準(zhǔn)確性的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種提高樣本分類準(zhǔn)確性的方法、 以及一種用于檢測(cè)樣本中YKL40和MASP2蛋白的試劑盒。
背景技術(shù)：
肝癌(HCC)是一種常見的且致命的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年約新增500,000肝癌患者， 并且近500,000人死于該疾病(參見Parkin, D. M., Bray， F., Ferlay, J.， and Pisani, P. (2001) Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. Int J Cancer 94, 153-156.)?，F(xiàn)有的肝癌診斷 手段包括超聲波檢測(cè)和甲胎蛋白(alpha-fetoprotein， AFP)檢測(cè)，兩者通常結(jié)合使用(參見 Spangenberg， H. C., Thimme， R., and Blum, H. E. (2006) Serum markers of hepatocellular carcinoma. Semin Liver Dis 26， 385-390.)。當(dāng)以甲胎蛋白為生物標(biāo)志物通過(guò)ROC曲線進(jìn)行肝 癌診斷時(shí)，其檢測(cè)陽(yáng)性閾值通常為20ng/ml (參見陳季武、范培昌，快速檢測(cè)甲胎蛋白的免 疫層析試條的研制，《分析科學(xué)學(xué)報(bào)》，2002年第4期第273-276頁(yè))。超聲和甲胎蛋白聯(lián) 合檢測(cè)的靈敏度和特異性分別是50-85%和70-90%，但它的假陽(yáng)性和假陰性率高達(dá)40% (參 見Tu, D. G.， Wang, S. T., Chang, T. T.， Chiu， N. T., and Yao, W. J. (1999) The value of serum tissue polypeptide specific antigen in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Cancer 85, 1039-1043; Buscarini, L., Sbolli, G., Cavanna, L., Civardi, G., Di Stasi, M., Buscarini, E.， and Fornari, F. (1987) Clinical and diagnostic features of 67 cases of hepatocellular carcinoma. Oncology 44， 93-97.)。因此，人們迫切需要科技工作者開發(fā)出檢測(cè)更方便、靈敏度和特異性 更高、而且準(zhǔn)確率高的肝癌診斷手段。
YKL-40是人類軟骨糖蛋白39(HcGP-39)(或稱為類幾丁質(zhì)酶蛋白，chitinase 3-like 1)的 簡(jiǎn)寫，又簡(jiǎn)寫為CHI3L1、 YKL40。人們經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，血清中YKL-40的水平與許多疾病狀況 比如在骨關(guān)節(jié)炎、原發(fā)性大腸癌、乳腺癌、復(fù)發(fā)的卵巢癌有關(guān)，因而可用于一些疾病的診斷、 預(yù)后評(píng)估、治療效果監(jiān)測(cè)及病情發(fā)展監(jiān)測(cè)。例如，可用于卵巢癌的診斷和預(yù)后(參見程明 剛，等。血清YKL-40在卵巢癌患者診斷和預(yù)后中的應(yīng)用?！稄V東醫(yī)學(xué)》2008年29巻2期第 255-256頁(yè))。耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究人員在2007年11月15日出版的《新英格蘭醫(yī)學(xué)期刊》 (The New England Journal of Medicine)上發(fā)表文章稱，臨床試驗(yàn)結(jié)果表明該分子可能在決定
4嚴(yán)重哮喘病生理反應(yīng)時(shí)發(fā)揮重要作用，與常人相比，哮喘病患者的YKL-40循環(huán)血清會(huì)更多，
同時(shí)也與哮喘的嚴(yán)重程度有關(guān)。(參見生物通網(wǎng)址
http:〃www.ebiotrade.com/newsf/2007-l 1/20071116165039.htm)。美國(guó)圣迭戈加州大學(xué)Johansen 等稱，YKL-40是獨(dú)立于癌胚抗原(CEA)和乳酸脫氫酶的生物標(biāo)志物，普通人群血清YKL-40 水平高者，其胃腸道腫瘤患病風(fēng)險(xiǎn)增加2.7倍，且診斷為胃腸道腫瘤后預(yù)后欠佳(參見中國(guó) 醫(yī)學(xué)論壇報(bào)網(wǎng)絡(luò)版。網(wǎng)址http:〃www.cmt.com.cn/article/080221/a08022 lb0301.htm)。人們還 發(fā)現(xiàn)，血清YKL-40水平還可作為肝纖維化指標(biāo)(參見Johansen, J. S., Christoffersen, P.， Moller, S., Price, P. A., Henriksen， J. H., Garbarsch, C.， and Bendtsen， F. (2000) Serum YKL-40 is increased in patients with hepatic fibrosis. Journal of hepatology 32, 911-920.)。然而，迄今未檢 索到關(guān)于YKL-40檢測(cè)應(yīng)用于肝癌診斷的報(bào)道。
MASP2是甘露聚糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶2 (mannan-binding lectin associated serineprotease-2)的縮寫，與人的免疫缺損病有關(guān)，在機(jī)體的固有性免疫防御中發(fā)揮重要作 用(參見蔡學(xué)敏，等。人甘露聚糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶2N端片段的原核表達(dá)， 《免疫學(xué)雜志》，2007年03期第235-238頁(yè))。其在肝癌診斷中的應(yīng)用尚未有報(bào)道。
本發(fā)明人的研究表明，MASP2基因是一種在肝臟中特異表達(dá)的基因。經(jīng)過(guò)大量的研究， 本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白都與肝癌癥狀有關(guān)，其中YKL-40在肝癌患者血清中的含量 明顯高于正常樣本，而MASP2在肝癌患者體內(nèi)的表達(dá)量則低于正常樣本。于是，我們提出 一個(gè)假說(shuō)將一種癌癥中高表達(dá)的蛋白(這個(gè)蛋白可以不是對(duì)某一癌癥特異，可以在不同的 癌癥中都高表達(dá))和一個(gè)組織或器官特異表達(dá)蛋白在該組織或器官的低表達(dá)(由于癌癥造成 執(zhí)行組織或器官特異功能的特異蛋白的下調(diào))聯(lián)系起來(lái)，可以作為診斷癌癥的聯(lián)合生物標(biāo)記 物，提高癌癥檢測(cè)的靈敏度和特異性。我們以YKL-40和MASP2這兩種蛋白為例，看它們可 否作為肝癌臨床應(yīng)用的生物標(biāo)志物、以及其聯(lián)合檢測(cè)可否提高疾病診斷和預(yù)后的準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的首要目的在于提供一種通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)樣本中YKL40和MASP2 蛋白來(lái)提高樣本分類準(zhǔn)確性的方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于檢測(cè)樣本中YKL40和MASP2蛋白的試劑盒。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)樣本中癌癥高表達(dá)蛋白和組織或器官特異 表達(dá)蛋白來(lái)提高樣本分析敏感度的方法。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種用于檢測(cè)樣本中癌癥高表達(dá)蛋白和組織或器官特異表達(dá) 蛋白的試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)手段
一種提高樣本分類準(zhǔn)確性的方法，其特征在于，聯(lián)合檢測(cè)樣本中的蛋白YKL-40和 MASP2。
上述聯(lián)合檢測(cè)包括
(1) 檢測(cè)樣本中YKL-40和MASP2的含量；
(2) 對(duì)測(cè)得的YKL-40和MASP2含量進(jìn)行數(shù)學(xué)分析；以及
(3) 根據(jù)數(shù)學(xué)分析結(jié)果，對(duì)測(cè)定樣本進(jìn)行分類。 一種上述方法在疾病包括癌癥的診斷、預(yù)后評(píng)估、治療效果監(jiān)測(cè)及病程監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。 一種用于檢測(cè)樣本中YKL40和MASP2蛋白的試劑盒，其包含
(1 )能夠結(jié)合YKL40和MASP2的抗體；以及
(2)當(dāng)YKL40禾口/或MASP2結(jié)合于(1)中限定的抗體時(shí)，能夠結(jié)合于YKL40和MASP2
的標(biāo)記抗體。
一種提高個(gè)體癌癥檢測(cè)敏感度的方法，包括
(1) 測(cè)試個(gè)體樣本內(nèi)癌癥高表達(dá)的蛋白含量；
(2) 測(cè)試個(gè)體樣本內(nèi)特定組織或器官特異表達(dá)的蛋白含量；
G)對(duì)測(cè)得的樣本內(nèi)癌癥高表達(dá)蛋白含量和組織或器官特異表達(dá)的蛋白含量進(jìn)行數(shù)學(xué)分 析；以及
(4) 根據(jù)數(shù)學(xué)分析結(jié)果，將個(gè)體分為癌癥或健康。 一種用于檢測(cè)樣本中癌癥高表達(dá)蛋白和組織或器官特異表達(dá)蛋白的試劑盒，其包含
(1) 能夠結(jié)合癌癥高表達(dá)蛋白和組織或器官特異表達(dá)蛋白的抗體；以及
(2) 當(dāng)癌癥高表達(dá)的蛋白和/或組織或器官特異表達(dá)蛋白結(jié)合于(1)中限定的抗體時(shí)， 能夠結(jié)合于癌癥高表達(dá)蛋白和組織或器官特異表達(dá)蛋白的標(biāo)記抗體。
研究表明，采用本發(fā)明的方法及試劑盒對(duì)個(gè)體的樣本中蛋白YKL40和MASP2進(jìn)行聯(lián)合 檢測(cè)，可以有效提高癌癥診斷的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確率，并且可以推廣至許多疾病的診斷、 預(yù)后評(píng)估、治療效果評(píng)估及病程監(jiān)測(cè)。


圖1是對(duì)肝癌患者血清樣本進(jìn)行YKL-40檢測(cè)的ROC曲線界面。 圖2是對(duì)肝癌患者血清樣本進(jìn)行MASP2檢測(cè)的ROC曲線界面。 圖3是對(duì)肝癌患者血清樣本進(jìn)行YKL40和MASP2聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線界面。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限定本發(fā)明的范圍。
眾所周知，當(dāng)個(gè)體開始罹患癌癥、或處于癌癥臨床階段時(shí)，癌癥病毒或癌癥基因會(huì)高表 達(dá)，這種高表達(dá)的蛋白比如YKL-40可以作為癌癥的生物標(biāo)志物；另一方面，該個(gè)體的有關(guān) 組織或器官功能會(huì)下降，致使在該組織或器官中特異表達(dá)的蛋白、比如在肝臟中特異表達(dá)的 MASP2的表達(dá)水平降低，因此組織或器官特異表達(dá)蛋白的低表達(dá)水平同樣具有用作癌癥生物 標(biāo)志物的潛力。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，單一生物標(biāo)志物的測(cè)試有時(shí)會(huì)造成假陽(yáng)性或假陰性的 增加，降低了測(cè)試的準(zhǔn)確率。因此，同時(shí)測(cè)試個(gè)體樣本內(nèi)癌癥高表達(dá)的蛋白比如YKL-40含 量和特定組織或器官特異表達(dá)的蛋白比如在肝臟中特異表達(dá)的MASP2低表達(dá)水平，即，在 原有的配對(duì)標(biāo)記物的基礎(chǔ)上進(jìn)一步增加新標(biāo)記物以提高檢測(cè)敏感度，將會(huì)提高癌癥測(cè)試的敏 感度，這已在下述的實(shí)施例中得以驗(yàn)證。
毫無(wú)疑問(wèn)，本發(fā)明提高個(gè)體癌癥檢測(cè)敏感度的方法及相關(guān)試劑盒可以應(yīng)用于各種癌癥和 器官病變的診斷、預(yù)后評(píng)估、治療效果評(píng)估及病程監(jiān)測(cè)。
比如，以血液樣本的聯(lián)合檢測(cè)為例，針對(duì)某一特定組織或器官的癌癥或疾病的應(yīng)用，其 包括如下步驟測(cè)定個(gè)體血液樣本中癌癥或疾病高表達(dá)的蛋白或基因；測(cè)定特定組織或器官 特異的蛋白或基因在血液中的低表達(dá)；對(duì)測(cè)得的蛋白含量或基因表達(dá)結(jié)果進(jìn)行數(shù)學(xué)分析；以 及根據(jù)數(shù)學(xué)分析結(jié)果，對(duì)測(cè)定個(gè)體樣本進(jìn)行分類，做出癌癥或疾病的診斷結(jié)果。這種結(jié)果可 分為健康、癌癥或疾病前期、癌癥或疾病中期、癌癥或疾病晚期等。
應(yīng)理解，本說(shuō)明書中術(shù)語(yǔ)"聯(lián)合檢測(cè)"的含義為不僅包括檢測(cè)樣本中特定蛋白的含量； 還可以包括對(duì)測(cè)得的蛋白含量進(jìn)行數(shù)學(xué)分析；并且還可以進(jìn)一步包括根據(jù)數(shù)學(xué)分析結(jié)果，對(duì) 測(cè)定樣本進(jìn)行分類。
ELISA
本發(fā)明使用ELISA技術(shù)對(duì)個(gè)體的樣本進(jìn)行癌癥高表達(dá)蛋白比如YKL40和組織或器官特 異表達(dá)蛋白比如MASP2的檢測(cè)。
酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)上分子生物學(xué)領(lǐng)域常 用的蛋白質(zhì)含量分析方法，其可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。根據(jù)試劑的來(lái)源、樣本 的性狀以及檢測(cè)的具備條件，本發(fā)明可以采用多種不同類型，比如雙抗體夾心法、雙位點(diǎn) 一步法、間接法測(cè)抗體、競(jìng)爭(zhēng)法、捕獲法測(cè)IgM抗體、以及應(yīng)用親和素和生物素的ELISA等。試劑盒
本發(fā)明的ELISA優(yōu)選使用試劑盒完成，這樣可以實(shí)現(xiàn)快捷操作，從而避免常規(guī)實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 的繁瑣。本發(fā)明的ELISA試劑盒包括YKL40的免疫酶標(biāo)試劑盒、MASP2免疫酶標(biāo)試劑盒、 YKL40和MASP2檢測(cè)試劑盒。為提高疾病診斷的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確率，優(yōu)選使用YKL40 和MASP2檢測(cè)試劑盒，其可以分別或同時(shí)測(cè)得兩組檢測(cè)結(jié)果，以達(dá)到快捷功效。
本發(fā)明的YKL40和MASP2檢測(cè)試劑盒至少包含
(1) 能夠結(jié)合YKL40和MASP2的抗體；以及
(2) 當(dāng)YKL40禾卩/或MASP2結(jié)合于(1)中限定的抗體時(shí)，能夠結(jié)合于YKL40和MASP2 的標(biāo)記抗體。
上述試劑盒還可包含
(3) 由含有已知量YKL40和MASP2的溶液組成的標(biāo)準(zhǔn)樣，該標(biāo)準(zhǔn)樣可以來(lái)源于基因 工程菌表達(dá)、動(dòng)物或人的體液；以及
(4) 用于檢測(cè)的抗體標(biāo)記物，例如，作為報(bào)告方法的酶標(biāo)簽比如辣根過(guò)氧化物酶，或者 熒光標(biāo)記，其可以與抗體結(jié)合形成偶聯(lián)物。
更有選試劑盒還可進(jìn)一步包括下屬物品中的至少之一(5)攜帶工具，其空間劃分為可 以收容一種或多種容器、96孔板或板條的限定空間，該容器例如是藥瓶、試管、和類似物， 每樣容器都含有一個(gè)單獨(dú)的用于本發(fā)明方法的組分；(6)輔助試劑，比如，顯色劑、酶抑制 劑、緩沖液、穩(wěn)定劑、稀釋劑、洗滌試劑以及類似物；(7)說(shuō)明書，其可以寫在瓶子、試管 和類似物上，或者寫在一張單獨(dú)的紙上，或者在容器的外部或內(nèi)部；也可以是多媒體的形式， 比如CD、電腦光盤、錄像等等。
優(yōu)選抗體可以固定于固相載體上，形成捕獲抗體。
所含抗體包括任何能夠結(jié)合YKL40和MASP2的抗體片段，并且可以是重組體、嵌合抗 體、人源化抗體和鼠源性抗體。所述抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體，優(yōu)選單克隆抗體。 優(yōu)選抗體偶聯(lián)物能夠用ELISA閱讀機(jī)，比如，酶標(biāo)儀進(jìn)行光度測(cè)定。 樣本
本發(fā)明所用樣本可以包含多種形式，比如全血、血漿、血清、尿液、腦脊液、唾液、或 眼淚。其中優(yōu)選血清。
樣本制備可根據(jù)普通方法比如離心等進(jìn)行，例如，參見如下文獻(xiàn)Young, D. S. & Bermes, E. W. "Specimen collection and processing" in Tietz Textbook of Clinical Chemistry 2nd Edition" Eds. Burtis, C. A. & Ashwood, E. R., Saunders (1994); Methods in Enzymology, H. Van Vunakisand J, J. Langone (Eds), 1981， 72(B); Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, P Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, R. J. Burden and P. H. Van Knippenberg (Eds), Elsevier, 1985; Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, T. Chard, ibid, 3rd Edition, 1987; Methods in Enzymology， H. Van Vunakis and J. J. Langone (Eds) 1981, 74(C)。 ROC曲線
在用ELISA檢測(cè)出樣本中癌癥高表達(dá)蛋白比如YKL40和組織或器官特異表達(dá)蛋白比如 MASP2的濃度后，可用數(shù)學(xué)分析方法對(duì)測(cè)得的樣本中癌癥高表達(dá)蛋白比如YKL40和組織或 器官特異表達(dá)蛋白比如MASP2濃度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，在此基礎(chǔ)上獲得具有樣本分類意義的 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。這樣的數(shù)學(xué)方法優(yōu)選由計(jì)算機(jī)完成，比如用這些數(shù)據(jù)繪制ROC曲線，從而對(duì)個(gè)體 的樣本進(jìn)行分類。
ROC曲線全稱為受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve),又稱為接 收者操作特性曲線，主要用于臨床生化診斷試驗(yàn)。ROC曲線是反映真陽(yáng)性率(靈敏度，又稱 敏感性，sensitivity)和假陽(yáng)性率(l-特異性，specificity)連續(xù)變量的綜合指標(biāo)，是用構(gòu)圖法 揭示靈敏度和特異性的相互關(guān)系。它通過(guò)設(shè)定一系列不同的的分界值(閾值或臨界值，cut-off value,是劃分診斷試驗(yàn)結(jié)果正常與異常的界值)作為連續(xù)變量，從而計(jì)算出一系列靈敏度和 特異性，再以靈敏度為縱坐標(biāo)、1-特異性為橫坐標(biāo)繪制的曲線，曲線下面積(AUC)越大， 診斷準(zhǔn)確性越高。在ROC曲線上，最靠近坐標(biāo)圖左上方的點(diǎn)為靈敏度和特異性均較高的臨界 值。ROC曲線AUC值在1.0和0.5之間。在AUC〉0.5的情況下，AUC越接近于1，說(shuō)明診 斷效果越好。AUC在0.5 0.7時(shí)有較低準(zhǔn)確性，AUC在0.7 0.9時(shí)有一定準(zhǔn)確性，AUC在 0.9以上時(shí)有較高準(zhǔn)確性。
ROC曲線的評(píng)價(jià)方法與傳統(tǒng)的評(píng)價(jià)方法不同，根據(jù)實(shí)際情況，允許有中間狀態(tài)，可以把 試驗(yàn)結(jié)果分為多個(gè)有序分類，比如正常、大致正常、可疑、大致異常和異常五個(gè)等級(jí)。
上述有序分類，對(duì)于疾病的診斷而言，可分為陰性、不確定、陽(yáng)性。進(jìn)一步地，對(duì)于
癌癥診斷而言，可分為癌癥、健康。
因此，以檢測(cè)樣本中蛋白YKL40和MASP2為例，本發(fā)明提高樣本分類準(zhǔn)確性的方法， 可以包括如下步驟
(1 )分別測(cè)定樣本中蛋白YKL-40和MASP2的含量；
(2)以YKL40與MASP2蛋白含量的比值為變量，根據(jù)不同的閾值對(duì)癌癥診斷的靈敏 度和特異性繪制出ROC曲線，并計(jì)算曲線下面積AUC;以及(3)按照期望的靈敏度和特異性，對(duì)測(cè)定樣本進(jìn)行分類(癌癥或健康)。 ROC曲線的繪制可以使用現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域的軟件或系統(tǒng)，比如MedCalc 9.2.0.1醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì) 軟件、SPSS 9.0、 ROCPOWER.SAS、 DESIGNROC.FOR、 MULTIREADER—POWER.SAS、 CREATE一ROC.SAS、 GB STAT VI0.0 (Dynamic Microsystems, Inc. Silver Spring, MD, USA)等等。
肝癌的診斷、預(yù)后評(píng)估、治療效果監(jiān)測(cè)或病程監(jiān)測(cè)
本發(fā)明在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的具體應(yīng)用，主要體現(xiàn)在肝癌的診斷、預(yù)后評(píng)估、治療效果監(jiān)測(cè)或病 程監(jiān)測(cè)方面，包括操作方法以及實(shí)現(xiàn)該方法的器具一試劑盒。眾所周知，肝炎的病程與肝癌 轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，典型的病程為肝炎(比如乙肝、丙肝)—肝硬化4肝癌。本發(fā)明人的研究 發(fā)現(xiàn)，肝炎病毒的表達(dá)也可以作為肝癌檢測(cè)的生物標(biāo)志，其與YKL40和MASP2的表達(dá)結(jié)合 起來(lái)，進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)可以顯著提高肝癌診斷的成功率。因此，本發(fā)明還提供了一種用于肝癌 的診斷、預(yù)后評(píng)估、治療效果監(jiān)測(cè)或病程監(jiān)測(cè)的方法，其包括檢測(cè)個(gè)體血液樣本中肝炎病 毒的表達(dá)；檢測(cè)個(gè)體血液樣本中YKL40和MASP2的表達(dá)；對(duì)測(cè)得的肝炎病毒表達(dá)水平和 YKL40和MASP2的表達(dá)水平進(jìn)行數(shù)學(xué)分析；以及根據(jù)數(shù)學(xué)分析結(jié)果，對(duì)測(cè)定血液樣本進(jìn)行 分類，做出肝癌的判斷結(jié)果。這種結(jié)果可分為肝癌前期、肝癌中期、肝癌晚期等。
其中，肝炎病毒的表達(dá)可以采用本技術(shù)領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行，比如標(biāo)準(zhǔn)的血樣檢測(cè)試紙 法、血樣檢測(cè)試劑盒法，以及常規(guī)的血樣化驗(yàn)方法，等等。
顯而易見，將血液樣本中肝炎病毒表達(dá)、YKL40和MASP2的表達(dá)整合在一個(gè)試劑盒中 檢測(cè)，將會(huì)帶來(lái)肝癌檢測(cè)的便利性、時(shí)效性、經(jīng)濟(jì)性。因此，本發(fā)明還提供了一種用于肝癌
的診斷、預(yù)后評(píng)估、治療效果監(jiān)測(cè)或病程監(jiān)測(cè)的聯(lián)合測(cè)試試劑盒，其至少包含(1)能夠結(jié)
合肝炎病毒、YKL40和MASP2的抗體；以及(2)當(dāng)肝炎病毒和/或YKL40禾Q/或MASP2結(jié) 合于(1)中限定的抗體時(shí)，能夠結(jié)合于肝炎病毒和域YKL40和MASP2的標(biāo)記抗體。優(yōu)選 試劑盒還包含(3)由含有已知量肝炎病毒、YKL40和MASP2的溶液組成的標(biāo)準(zhǔn)樣，該標(biāo) 準(zhǔn)樣可以來(lái)源于基因工程菌表達(dá)、動(dòng)物或人的體液；以及(4)用于檢測(cè)的抗體標(biāo)記物，例如， 作為報(bào)告方法的酶標(biāo)簽比如辣根過(guò)氧化物酶，或者熒光標(biāo)記，其可以與抗體結(jié)合形成偶聯(lián)物。 以下以個(gè)體的血清為樣本進(jìn)行肝癌診斷為例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例l
樣本的采集
在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院一附院隨機(jī)采取25例50-60歲肝癌患者的血清1 mL;作為陽(yáng)性對(duì)照， 另采取15例50-60歲健康志愿者的正常血樣1 mL，進(jìn)行YKL40和MASP2濃度測(cè)試。
10測(cè)YKL-40含量
根據(jù)廠商的指導(dǎo)，使用Quidel公司(San Diego, CA,美國(guó))的YKL-40試劑盒、并且使 用Bio-Rad 680型酶標(biāo)儀(美國(guó))進(jìn)行ELISA操作，包括
1、 取出冷藏儲(chǔ)存的試劑盒，放置，恢復(fù)溫度至室溫(20-25 °C)。計(jì)算要檢測(cè)的標(biāo)本總數(shù) 和質(zhì)控?cái)?shù)。每個(gè)標(biāo)本需要一個(gè)抗原包被孔。每次實(shí)驗(yàn)都要做陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和校準(zhǔn)品。 確定需要的微孔數(shù)量。當(dāng)板條溫度至室溫時(shí)，打開板條的保護(hù)袋，拿出抗原包被的微孔板條。 本次實(shí)驗(yàn)不需要使用的試劑條應(yīng)放入這個(gè)可重新密封的袋子，密封，重新存放在2-8。C。
2、 依次在微孔板上加入20^L的標(biāo)準(zhǔn)液、對(duì)照液和血清樣本。此過(guò)程務(wù)必在三十分鐘內(nèi) 完成。
3、 在每個(gè)微孔中加入100pL的捕獲液，用移液器在孔中反復(fù)吹打進(jìn)行混勻。
4、 用微孔板蓋蓋好板，在室溫下(18-25。C)進(jìn)行溫育55 — 65分鐘。
5、 按下述步驟手工洗板3次
A、 劇烈搖動(dòng)并倒掉板中的液體；
B、 在孔中加滿洗液。保證孔中無(wú)殘余氣泡。
C、 再重復(fù)前兩步驟兩次。
D、 搖動(dòng)并去除孔中的洗液。把板翻轉(zhuǎn)，在紙巾上輕拍，以便能拍干所有洗液。觀察微 孔板，確保無(wú)殘留的洗液。
6、 在酶標(biāo)抗體復(fù)合物的瓶子里加入7mL的再生緩沖液，存放于室溫下待用。
7、 按照同樣的次序把稀釋好的酶復(fù)合物加100 pL到微孔板上
8、 用微孔板蓋蓋好板，在室溫下(18-28 。C)進(jìn)行溫育55—65分鐘。
9、 配制底物，在底物緩沖液中加入一片底物固體，30-60分鐘后溶解，強(qiáng)烈搖晃，使溶 液完全混合。
10、 按照步驟5中A到D的方法進(jìn)行洗板。
11、 以同樣的速度和次序把底物液加100pL到每孔中。
12、 微孔板在室溫下(18-28 。C)進(jìn)行溫育55_65分鐘。
13、 以同樣的速度和次序在每個(gè)孔中加入100)aL的終止液。加了終止液后應(yīng)輕輕敲打微 孔板，確保樣品全部混勻。
14、 設(shè)置酶標(biāo)儀的檢測(cè)波長(zhǎng)在405 rim處。檢測(cè)每個(gè)孔的OD值。應(yīng)在加了終止液的15 鐘之內(nèi)進(jìn)行讀數(shù)。
15、 用一線性校準(zhǔn)曲線"Y=mx+b"來(lái)分析YKL-40或MASP2的結(jié)果。16、通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)讀出血清樣本和對(duì)照液中YKL-40或MASP2的濃度。 結(jié)果
經(jīng)上述步驟，得到的檢測(cè)結(jié)果如表1所示。表l
_血淸中蛋白濃度(ng/mL)
樣品編號(hào) 診斷結(jié)果 YKL-40 MASP-2 YKL-40/MASP2的比值
782.2359.957.52
76.8250.230.70
705195.7360.25
1444.690.31599.78
165.3281.7558.67
98,7248.439.73
317.258.5542.22
354.181.6433.95
211.7167.2126.61
87.833.9259.00
734.4292.9250.73
184.4935.99.70
94.6206,445.83
313208.3150.26
137.3124,7110.10
475.3241.6196.73
66.5282.723.52
177.62244.5472.63
59.96426.6714.05
44.9680.2956.00
99.9630.0515.86
115.68215.5653.66
183.47339.7154.01
440.81106.86412.51
36.09244.0614.79
34.418518.59
21.517112.57
57.37247.91
54443.912.16
62.9356.217.66
47.5330.714.36
25.8699.93.69
43.8837.75.23
48.5470.510.31
16.7384.24.35
14.8739.42.00
39.6柳.48.44
11363.23.03
10.4330.13.15
265.8530.150.14
癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌康康康康康康康康康康康康康康康
11,肝F,肝F肝lf肝FP肝肝臥t肝肝肝ww^^健健健健健健健健健健健健健健健
012345678901
222222222233
4
3
7
3
13由表1可以看出，YKL-40的濃度與肝癌癥狀有密切的相關(guān)性，即，肝癌患者血清中 YKL-40蛋白的含量明顯高于健康志愿者血清中的含量。 ROC曲線繪制
使用GB STAT V10.0 (Dynamic Microsystems, Inc. Silver Spring, MD USA)系統(tǒng)，以 YKL-40蛋白含量為變量，根據(jù)不同的閾值對(duì)癌癥診斷的靈敏度和特異性繪制出ROC曲線， 并計(jì)算曲線下面積AUC;繪制出ROC曲線并計(jì)算曲線下面積(AUC)，如圖l所示。
圖1顯示，ROC曲線的AUC為0.98。當(dāng)YKL-40濃度的閾值為0.87 (ng/mL)時(shí)，診斷 肝癌的靈敏度為0.92 (即92%)， l-特異性為0.87 (即87%)，診斷肝癌的成功率為0.9 (即 90%)。
實(shí)施例2
測(cè)MASP2含量
采用與實(shí)施例1項(xiàng)類似的步驟，不同之處在于根據(jù)廠商的指導(dǎo)，使用荷蘭Hycult生物 技術(shù)公司(Uden，荷蘭)的MASP2試劑盒進(jìn)行ELISA操作，檢測(cè)血清樣本中MASP2蛋白 的濃度。結(jié)果如表1所示。
由表1可以看出，MASP2的濃度也與肝癌癥狀有密切的相關(guān)性，即，肝癌患者血清中 MASP2蛋白的含量明顯低于健康志愿者血清中的含量。
ROC曲線繪制
使用GB STAT V10.0系統(tǒng)，以MASP2蛋白含量為變量，根據(jù)不同的閾值對(duì)癌癥診斷的 靈敏度和特異性繪制出ROC曲線，并計(jì)算曲線下面積(AUC)，如圖2所示。
圖2顯示，當(dāng)MASP2濃度的閾值為292.9 ng/mL時(shí)，診斷肝癌的靈敏度為0.87， 1-特異 性為0.77，實(shí)際診斷肝癌的成功率為0.8。
實(shí)施例3
結(jié)合使用YKL40和MASP2,即，使用GB STATV10.0系統(tǒng)，以YKL40和MASP2蛋白
含量的比值為變量，根據(jù)不同的閾值對(duì)癌癥診斷的靈敏度和特異性繪制出ROC曲線，繪制出 ROC曲線并計(jì)算曲線下面積AUC，如圖3所示。
圖3顯示，當(dāng)閾值為12.57 (比值)時(shí)，診斷的靈敏度為100%，實(shí)際診斷肝癌的成功率 為90%。大大高于目前常用的甲胎蛋白檢測(cè)成功率(基本為70%)。
另夕卜，通過(guò)圖3與圖1和2的比較可以看出，當(dāng)閾值為12.57時(shí)，聯(lián)合檢測(cè)YKL40和 MASP2時(shí)的肝癌診斷的靈敏度高于使用任何一種單一標(biāo)記物(結(jié)合使用時(shí)的靈敏度為1，使 用單一 YKL40或MASP2時(shí)靈敏度分別為0.92和0.87)，實(shí)際診斷肝癌的成功率為0.9。雖然以上以各自獨(dú)立的YKL40或MASP2試劑盒進(jìn)行ELISA操作，以肝癌診斷為例，繪 制出聯(lián)合檢測(cè)YKL40和MASP2的ROC曲線，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了闡述，但是根據(jù) 本發(fā)明的公開，本發(fā)明的方法毫無(wú)疑問(wèn)可以推廣至其他一些疾病的診斷、預(yù)后評(píng)估、治療效 果監(jiān)測(cè)及病情發(fā)展監(jiān)測(cè)，這對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的。因此，在不違背本發(fā) 明的思想下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在此基礎(chǔ)上對(duì)本發(fā)明作出的各種改動(dòng)或者修改，同樣應(yīng)屬 于本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種提高樣本分類準(zhǔn)確性的方法，其特征在于，聯(lián)合檢測(cè)樣本中的蛋白YKL-40和MASP2。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述聯(lián)合檢測(cè)包括(1) 檢測(cè)樣本中YKL-40和MASP2的含量；(2) 對(duì)測(cè)得的YKL-40和MASP2含量進(jìn)行數(shù)學(xué)分析；以及(3) 根據(jù)數(shù)學(xué)分析結(jié)果，對(duì)測(cè)定樣本進(jìn)行分類。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述YKL-40和MASP2的含量分別測(cè)定。
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述數(shù)學(xué)分析為繪制ROC曲線，其中以YKL40 與MASP2蛋白含量的比值為變量，根據(jù)不同的閾值繪制出ROC曲線，并計(jì)算曲線下面積 AUC;并且按照期望的靈敏度和特異性，對(duì)測(cè)定樣本進(jìn)行分類。
5. 如權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述YKL-40和MASP2中的至 少一個(gè)的含量使用ELISA技術(shù)完成。
6. 如權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述樣本選自于由全血、血漿、 血清、尿液、腦脊液、唾液、和眼淚所構(gòu)成的組。
7. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，用于癌癥的診斷、預(yù)后評(píng)估、治療效果監(jiān)測(cè) 及病程監(jiān)測(cè)。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述癌癥是肝癌。
9. 一種用于實(shí)施如權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)所述方法的試劑盒，其包含(1) 能夠結(jié)合YKL40和MASP2的抗體；以及(2) 當(dāng)YKL40禾Q/或MASP2結(jié)合于(1)中限定的抗體時(shí)，能夠結(jié)合于YKL40和MASP2 的標(biāo)記抗體。
10. 如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，還包含(3) 由含有己知量YKL40和MASP2的溶液組成的標(biāo)準(zhǔn)樣；以及(4) 用于檢測(cè)的抗體標(biāo)記物，其可以與抗體結(jié)合形成偶聯(lián)物。
11. 一種對(duì)個(gè)體特定組織或器官的癌癥或疾病進(jìn)行診斷、預(yù)后評(píng)估、治療效果監(jiān)測(cè)或病 程監(jiān)測(cè)的方法，其包括(1) 測(cè)定個(gè)體血液樣本中癌癥或疾病高表達(dá)的蛋白或基因；(2) 測(cè)定特定組織或器官特異的蛋白或基因在血液中的低表達(dá)；(3) 對(duì)測(cè)得的蛋白含量或基因表達(dá)結(jié)果進(jìn)行數(shù)學(xué)分析；以及(4) 根據(jù)數(shù)學(xué)分析結(jié)果，對(duì)測(cè)定個(gè)體樣本進(jìn)行分類，做出癌癥或疾病的診斷結(jié)果。
12. —種用于肝癌的診斷、預(yù)后評(píng)估、治療效果監(jiān)測(cè)或病程監(jiān)測(cè)的方法，其包括(1) 檢測(cè)個(gè)體血液樣本中肝炎病毒的表達(dá)；(2) 檢測(cè)個(gè)體血液樣本中YKL40和MASP2的表達(dá)；(3) 對(duì)測(cè)得的肝炎病毒表達(dá)水平和YKL40和MASP2的表達(dá)水平進(jìn)行數(shù)學(xué)分析；以及(4) 根據(jù)數(shù)學(xué)分析結(jié)果，對(duì)測(cè)定血液樣本進(jìn)行分類，做出肝癌的判斷結(jié)果。
13. —種用于實(shí)施如權(quán)利要求12所述方法的試劑盒，其包含(1) 能夠結(jié)合肝炎病毒、YKL40和MASP2的抗體；以及(2) 當(dāng)肝炎病毒和/或YKL40和/或MASP2結(jié)合于(1)中限定的抗體時(shí)，能夠結(jié)合于 肝炎病毒和/或YKL40和MASP2的標(biāo)記抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)樣本中YKL40和MASP2蛋白來(lái)提高樣本分類準(zhǔn)確性的方法，其包括測(cè)定樣本中YKL-40和MASP2的含量；以YKL40和MASP2蛋白含量的比值為變量，根據(jù)不同的閾值對(duì)癌癥診斷的靈敏度和特異性繪制出ROC曲線，并計(jì)算曲線下面積AUC；按照AUC值、靈敏度和特異性將樣本進(jìn)行分類。本發(fā)明還公開了一種用于檢測(cè)樣本中YKL40和MASP2的試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101587125SQ200810108528
公開日2009年11月25日 申請(qǐng)日期2008年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月21日
發(fā)明者林標(biāo)揚(yáng) 申請(qǐng)人:林標(biāo)揚(yáng)