專利名稱：一種布魯氏菌IgM抗體膠體金快速檢測試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種布魯氏菌IgM抗體檢 測試紙條及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
布魯氏菌病(brucellosis)是由布氏桿菌(Brucella)引起的人獸共患 的傳染病，俗稱波浪熱。臨床特點為長期發(fā)熱、多汗、關(guān)節(jié)疼痛、疲 乏、肝脾腫大等，此病在世界各國均有不同程度的流行。
人主要通過皮膚、黏膜、消化道和呼吸道感染，尤其以感染羊種 布魯氏菌、牛種布魯氏菌最為嚴(yán)重。豬種布魯氏菌感染人較少見，犬 種布魯氏菌感染人罕見，綿羊附睪種布魯氏菌、沙林鼠種布魯氏菌基 本不感染人。
布魯氏菌病易誤診為風(fēng)濕性疾病、傷寒、結(jié)核病、病毒感染、或 作為長期發(fā)熱原因待查診治。其長期誤診的主要原因為(1)臨床 醫(yī)生對布氏桿菌病的認(rèn)識不足是導(dǎo)致誤診的主要原因。(2)流行病 學(xué)資料詢問不詳細(xì)，特別是病史、接觸史、職業(yè)、飲食習(xí)慣、居住地 區(qū)及流行地區(qū)等。(3)臨床表現(xiàn)多樣化且臨床癥狀不典型。(4)缺乏 操作簡單、快速、特異、敏感的檢測手段。
目前對布魯氏菌感染的檢測主要在實驗室進(jìn)行。主要有 (1)病原學(xué)診斷
顯微鏡檢查采集流產(chǎn)胎衣、絨毛膜水腫液、肝、脾、淋巴 結(jié)、胎兒胃內(nèi)容物等組織，制成抹片，用柯茲羅夫斯基染色法染色， 鏡檢，布魯氏菌為紅色球桿狀小桿菌，而其它菌為藍(lán)色。
分離培養(yǎng)新鮮病料可用胰蛋白麻瓊脂面或血液瓊脂斜面、肝湯 瓊脂斜面、3%甘油0.5%葡萄糖肝湯瓊脂斜面等培養(yǎng)基培養(yǎng)；37'C培 養(yǎng)7~ IO天后，進(jìn)行菌落特征檢查和單價特異性抗血清凝集試驗。
(2) 血清學(xué)診斷主要以下幾種，虎紅平板凝集試驗(RBPT) 全乳環(huán)狀試驗(MRT)，試管凝集試驗(SAT),補體結(jié)合試驗(CFT)等。 近年來，人們用布魯氏菌的粗提抗原研制ELISA法檢測試劑盒，檢測 感染血清中的抗體，取得了良好的效果。
(3) 其它如PCR,檢測布魯氏菌特異性的特異性核苷酸等。 bp26蛋白是布魯氏菌外膜蛋白的一種，已有的研究表明，bp26
蛋白具有良好的免疫原性，而且從基因水平上看，各種布魯氏菌 (5. * ， 5. ov^和5. me/"醒:s等)的bp26基因序列幾乎完全 一致，只是核苷酸有微小差異，但氨基酸序列無差別。因此屬于各 種布魯氏菌的共同抗原，可作為布魯氏菌的檢測抗原，用于檢測診斷。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明的目的是提供一種使用方便、快捷，用于檢測乙腦病毒特異 性抗體的試紙條，檢測感染患者標(biāo)本中布魯氏菌特異性IgM抗體， 用人布魯氏菌感染的輔助診斷。
本發(fā)明的另 一 目的在于提供上述試紙條的制備方法。 本發(fā)明試紙條包括反應(yīng)膜和結(jié)合物釋放墊，所述反應(yīng)膜具有包被 布魯氏菌特異性抗原bp26蛋白的檢測帶和包被二抗IgG的質(zhì)控帶； 所述結(jié)合物釋放墊包被有膠體金標(biāo)記的抗人IgM單克隆抗體。
其中，反應(yīng)膜可為硝酸纖維膜，結(jié)合物釋放墊可為玻璃纖維膜。 本發(fā)明通過基因工程手段獲得bp26的基因工程抗原，這可以顯
著提高試紙條的特異性。
本發(fā)明還提供一種制備上述檢測試紙條的方法，其包括如下步
驟
1) 制備布魯氏菌特異性抗原bp26;
2) 將步驟l)制備的布魯氏菌特異性抗原bp26以及二抗IgG在 反應(yīng)膜上分別形成檢測帶和質(zhì)控帶，備用；
3 )用膠體金標(biāo)記抗人IgM單克隆抗體，包被到結(jié)合物釋放墊中；4)將制備好的反應(yīng)膜以及結(jié)合物釋放墊與樣本墊、吸水墊和反 應(yīng)支持物組裝成試紙條。
本發(fā)明試紙條可用于檢測人標(biāo)本中的布魯氏菌IgM抗體。 本發(fā)明的技術(shù)方案是采用純化的布魯氏菌特異性抗原bp26蛋 白和抗鼠IgG分別固相于硝酸纖維膜上(NC膜)，結(jié)合膠體金標(biāo)記 的抗人IgM單克隆抗體，應(yīng)用膜層析間接夾心法的原理檢測人標(biāo)本 中的布魯氏菌IgM抗體。
本發(fā)明的試紙條利用膠體金標(biāo)記技術(shù)和膜層析技術(shù)，用于快速定 性半定量檢測樣本中可能存在的布魯氏菌特異性IgM抗體，達(dá)到快 速篩檢病人，及時診斷治療的目的?？晒?jié)省大量人力物力，方便、快 速、簡捷，不需特殊儀器設(shè)備，不需專業(yè)培訓(xùn)，結(jié)果清晰易辨，操作 簡單，易于推廣，適合基層，適合于現(xiàn)場檢測和早期診斷，對布魯氏 菌的感染診斷起到輔助作用。


圖1: A本發(fā)明試紙條的正面示意圖；B本發(fā)明試紙條的側(cè)面 示意圖。其中，1:吸水墊；2:硝酸纖維膜(T:布魯氏菌特異性抗 原bp26蛋白；C:包被抗鼠IgG的質(zhì)控條帶)；3:含有膠體金標(biāo)記 的抗人IgM單克隆抗體的玻璃纖維膜；4:金標(biāo)抗體保護(hù)膜；5:反 應(yīng)支持物。
圖2:檢測結(jié)果示意圖。其中，從左至右依次為T、 C兩條線 陽性；C一條線陰性；T、 C兩條線陰性，無效。
具體實施例方式
以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的 限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或 條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟 知的常規(guī)手段。
實施例l:布魯氏菌外膜蛋白bp26基因工程抗原的制備
(1) 目的基因的獲得
根據(jù)目的基因片段序列(GenBank登錄號為AY166769)及 pGEX-4T-1 (Pharmacia)表達(dá)載體的特點設(shè)計兩端含有限制性內(nèi)協(xié)酶 Ecoi l、屈ol酶切位點的引物
5 ， gaattcatgaacactcgtgct 3， 5 ' gcctcgagttacttgatttcaa 3' 然后，從布魯氏菌基因組中擴(kuò)增出目的基因片斷bp26，擴(kuò)增條 件95。C變性5min; 95。Clmin， 49.8。Clmin, 70。Clmin,進(jìn)行35個循 環(huán)；最后70。C延伸10min。
(2) 目的基因的克隆和陽性重組子的篩選 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后切膠回收，與PMD-18T克隆載體16'C過夜連
接后，轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆菌株，37。C過夜培養(yǎng), 提取質(zhì)粒后，以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR鑒定陽性克隆菌株，測定序列。
(3) bp26融合表達(dá)載體的構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶五coi I、 Iol分別酶切T/bp26和pGEX-4T-l ， 1% 瓊脂糖電泳切膠回收bp26目的片段和pGEX-4T-1雙酶切后的大片段， 用T4連接酶將兩者16'C過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞， LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)8 10小時，挑取單菌落培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒，用 PCR及限制性內(nèi)切酶&oi I、 ^TzoI雙酶切分別鑒定，PCR產(chǎn)物和酶切 產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳進(jìn)行分析，篩選陽性克隆，將重組的質(zhì)粒測序。
(4) pGEX-bp26融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 篩選出的陽性克隆菌在LB培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)過夜后，將過夜菌按
照l: 100的比例接種至1000mlLB液體培養(yǎng)基中，37。C搖床培養(yǎng)。bp26 基因轉(zhuǎn)化菌在接種后2小時為最佳誘導(dǎo)時機(OD600nm0.5)， IPTG濃 °C 0.3mmol/L， 29。C誘導(dǎo)8小時，目的蛋白存在于細(xì)胞裂解液上清中。
(5) pGEX-bp26融合蛋白的純化、鑒定
將(4)中1000ml菌液12000r/m、 4'C離心，棄上清，將菌體用 細(xì)胞裂解液裂解，使用含有GST標(biāo)簽的親和層析柱子純化融合蛋白， 用GST-融合蛋白純化試劑盒(B-PER細(xì)菌GST標(biāo)簽融合蛋白柱式純 化Kit貨號78200賽默飛世爾科技)，按試劑盒推薦步驟和體系進(jìn) 行純化，純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳以判斷純化效果，通過紫外 薄層測得產(chǎn)率在95%以上。
融合蛋白的Western-Blot鑒定
切取一半膠用BioRad公司生產(chǎn)的半干電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)于硝酸纖維素膜 上，進(jìn)行印跡試驗， 一抗為布魯氏菌單抗(北京博奧森生物技術(shù)有限 公司)，TMB顯色后，結(jié)果有特異性蛋白條帶出現(xiàn)。
實施例2:布魯氏菌IgM抗體膠體金快速檢測試紙條(參見圖1)
(1) 膠體金-抗人IgM結(jié)合物的制備
經(jīng)實驗確定，抗人IgM單克隆抗體膠體標(biāo)記的其最佳結(jié)合pH值 為8.0，膠體金和抗體的配比為28pg/ml膠體金。標(biāo)記膠體金經(jīng)穩(wěn)定劑 (0.5%BSA, pH8.0， 0.01MTris緩沖液)處理后，按每平方厘米65pl 的量，取膠體金-抗體結(jié)合物溶液，均勻吸附于玻璃纖維上，冷凍干 燥，并在干燥環(huán)境中保存。
(2) 包被抗原于硝酸纖維膜
將bp26用0.01M PBS稀釋成3mg/ml。將抗鼠IgG用0.01M PBS稀釋 成2mg/ml。用噴膜機將二者以lpl/cm的速度噴于硝酸纖維膜上，分別 形成檢測線和對照線。兩條線之間的間隔為0.5cm。
把固定有抗原抗體的硝酸纖維置37。C烤箱中干燥2小時。干燥環(huán) 境中保存?zhèn)溆谩?br> (3) 試劑條組成
反應(yīng)支持物為6. 5cm x 0.4cmPCV板；吸水墊為2cm x 0.4cm的 濾油紙；1.8cmx0.4cm的硝酸纖維膜依次包被抗鼠IgG，布魯氏菌特 異性抗原bp26，含有0.4cm x 0.4cm膠體金標(biāo)記的抗人IgM的單克隆
抗體玻璃纖維膜；金標(biāo)抗體保護(hù)膜為2.7cm x 0.4cm的玻璃纖維；即 形成了布魯氏菌IgM抗體膠體金快速檢測試紙條 (4 )布魯氏菌IgM抗體檢測試劑盒特異性及敏感度檢測
特異性實驗用本品檢測正常的牛、羊、豬、犬血清，正常人血 清，豬瘟血清，豬空腸彎曲菌血清，兔抗鼠傷寒沙門氏菌血清，兔抗 土拉倫菌血清、兔抗耶爾森氏菌血清、兔抗大腸桿菌血清。結(jié)果均為 陰性，表明布魯氏菌IgM抗體檢測試劑盒有良好的特異性。
敏感度實驗用本品分別檢測布氏菌患者IgM陽性血清。對陽性 血清用ELISA試劑盒進(jìn)行效價檢測，并稀釋成不同的滴度，檢測結(jié)果 表明，本品最低檢測出量為l: 32(ELISA)。
實施例3檢測方法(參見圖2)
將患者全血、血漿或血清標(biāo)本100-150ul直接滴加入實施例2試 紙條"4"處，樣品液沿膜上行，10-15分鐘判讀結(jié)果。 結(jié)果
如檢測樣本中含有布魯氏菌IgM抗體，則與試紙條上膠體金標(biāo) 記的抗人IgM單克隆抗體形成相應(yīng)的復(fù)合物，上行與包被在硝酸纖 維膜上的布魯氏菌特異性抗原結(jié)合，形成紅色線條，即在T處形成 紅色條帶。
無論標(biāo)本中是否含有相應(yīng)的抗體，膠體金標(biāo)記的抗人IgM單克 隆抗體繼續(xù)向上爬行與包被在膜上的抗鼠IgG形成紅色沉淀線，即在 "C"處形成紅色條帶。此線是質(zhì)控線，如膠體金失效，此線就不會 出現(xiàn)，說明試紙條失效。
序列表
<110>北京莊笛浩未生物醫(yī)學(xué)科技有限公司
〈120> —種布魯氏菌IgM抗體膠體金快速檢測試紙條
<130>
〈160〉 2
<170> Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211> 21
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
<400> 1
gaattcatga acactcgtgc t 21
〈210> 2
<211〉 22
<212> DNA <213>人工序列
〈400〉 2
gcctcgagtt acttgatttc aa 2權(quán)利要求
1、一種檢測試紙條，包括反應(yīng)膜和結(jié)合物釋放墊，所述反應(yīng)膜具有包被布魯氏菌特異性抗原bp26蛋白的檢測帶和包被二抗IgG的質(zhì)控帶；所述結(jié)合物釋放墊包被有膠體金標(biāo)記的抗人IgM單克隆抗體。
2、 如權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，其中所述布魯氏 菌特異性抗原bp26蛋白是應(yīng)用基因工程方法重組表達(dá)獲得。
3、 如權(quán)利要求l或2所述的試紙條，其特征在于，所述反應(yīng)膜 為硝酸纖維素膜。
4、 如權(quán)利要求1或2所述的試紙條，其特征在于，所述的結(jié)合物釋放墊為玻璃纖維膜。
5、 如權(quán)利要求1或2任一項所述試紙條，其特征在于，所述的 二抗IgG為抗鼠IgG。
6、 一種制備權(quán)利要求1~5任一項所述試紙條的方法，其包括如 下步驟1) 制備布魯氏菌特異性抗原bp26;2) 將步驟l)制備的布魯氏菌特異性抗原bp26以及二抗IgG在 反應(yīng)膜上分別形成檢測帶和質(zhì)控帶，備用；3 )用膠體金標(biāo)記抗人IgM單克隆抗體，包被到結(jié)合物釋放墊中； 4)將制備好的反應(yīng)膜以及結(jié)合物釋放墊與樣本墊、吸水墊和反應(yīng)支持物組裝成試紙條。
7、 權(quán)利要求1-5之任一所述試紙條在檢測布魯氏菌特異性IgM 抗體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測布魯氏菌IgM抗體的快速檢測試紙條包括反應(yīng)膜和結(jié)合物釋放墊，所述反應(yīng)膜具有包被布魯氏菌特異性抗原bp26蛋白的檢測帶和包被二抗IgG的質(zhì)控帶；所述結(jié)合物釋放墊包被有膠體金標(biāo)記的抗人IgM單克隆抗體，應(yīng)用膜層析間接夾心法，檢測標(biāo)本中布魯氏菌特異性IgM抗體。應(yīng)用本發(fā)明試紙條檢測，操作簡單、方便、快速、簡捷，不需特殊儀器設(shè)備，不需專業(yè)培訓(xùn)，結(jié)果清晰易辨，操作簡單，易于推廣，適合基層，適合于現(xiàn)場檢測和早期診斷，對布魯氏菌感染診斷起到輔助作用。
文檔編號G01N33/577GK101363862SQ20081011272
公開日2009年2月11日 申請日期2008年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月26日
發(fā)明者明 劉 申請人:北京莊笛浩禾生物醫(yī)學(xué)科技有限公司