專利名稱：一種鉤端螺旋體屬特異性抗體膠體金快速檢測(cè)試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及鉤端螺旋體屬特異性抗體檢 測(cè)試紙條及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鉤端螺旋體病是由致病性鉤端螺旋體(簡(jiǎn)稱鉤體)所引起的急性 傳染病。鼠類、豬及其它家畜為主要傳染源。鉤體隨帶菌動(dòng)物尿排出， 污染水源，人在接觸疫水時(shí)，通過皮膚、粘膜而感染。發(fā)病多在夏秋
割稻季節(jié)或在大雨洪水之后。人感染鉤體病后，潛伏期多在1~3周。 首先形成敗血癥，可有多種臨床表現(xiàn)，包括普通型、肺出血型、黃疸 出血型、腦膜腦炎型。約在發(fā)病l周左右，發(fā)病，進(jìn)入免疫反應(yīng)期， 表現(xiàn)諸多神經(jīng)癥狀。其診斷除依據(jù)流行病學(xué)及臨床癥狀外，實(shí)驗(yàn)室檢 測(cè)是必不可少的，其涉及到的特異性檢測(cè)有 l.病原體分離
鉤體不易著色， 一般顯微鏡很難觀察到，必須釆用黑底映光法直 接查找鉤體。在發(fā)病10天內(nèi)可從血液及腦脊液中分離出鉤體。第二 周尿中可檢出鉤體。鉤體從體液或組織中分離需要特殊的實(shí)驗(yàn)室技術(shù) 和培養(yǎng)基。
最近用超速離心集菌后直接鏡檢法、熒光抗體染色法、原血片鍍 銀染色法及甲苯藍(lán)染色等方法直接檢查病原體，可達(dá)到快速診斷目 的，陽性率在50%左右，有助于早期診斷。
動(dòng)物接種是一種分離病原體的可靠方法，將患者的血液或其他體 液接種于動(dòng)物(幼年豚鼠和金黃地鼠)腹腔內(nèi)，晚期病例可用尿液接 種于動(dòng)物腹部皮下。接種3~5天，用暗視野檢查腹腔液，亦可在接 種3-6天時(shí)取心血檢查。動(dòng)物接種的陽性率較高，但所需時(shí)間較長(zhǎng)， 所需費(fèi)用大。2. 血清學(xué)試驗(yàn)
(1) 凝集溶價(jià)試驗(yàn)(凝溶試驗(yàn))有較高的特異性和敏感性，但需 不同型別活菌操作，凝集素一般在病后7-8天出現(xiàn)，逐漸升高，以 超過1 :400效價(jià)為陽性，可持續(xù)數(shù)月到數(shù)年。間隔兩周雙份血清， 效價(jià)增高4倍以上為陽性。
(2) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA):比凝溶試驗(yàn)陽性出現(xiàn)時(shí)間更早 和更靈敏。發(fā)現(xiàn)顯微鏡凝集試驗(yàn)與ELISA的總符合率達(dá)86.2%。近年 來國(guó)外已普遍采用鉤體IgM抗體技術(shù)，有高度特異性。
(3) 間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)將從鉤體菌體中提取的一種抗原成分， 將其吸附于人"O"型紅細(xì)胞表面致敏，遇到同種抗體，即發(fā)生紅細(xì)胞 凝集現(xiàn)象，本試驗(yàn)具鉤體感染的屬特異性而無群或型的特異性，較凝 溶試驗(yàn)陽性出現(xiàn)早，操作簡(jiǎn)便，不需特殊設(shè)備，適合基層推廣應(yīng)用。
(4) 間接紅細(xì)胞溶解試驗(yàn)用鉤體抗原物質(zhì)將新鮮綿羊紅細(xì)胞致 敏，在補(bǔ)體存在的條件下與含有抗體的血清混合時(shí)發(fā)生溶血，較間接 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)的靈敏性為高。
(5) 間接熒光抗體法此法是將標(biāo)準(zhǔn)鉤體菌株作成涂片，然后將 檢測(cè)病人的血清滴在已知菌株的玻片上，經(jīng)洗滌，如病人血清中具有 抗體，抗原抗體結(jié)合，再用抗人球蛋白熒光抗體與此復(fù)合物結(jié)合，發(fā) 生熒光，即為陽性，此法無型特異法。本法檢出抗體時(shí)間及陰轉(zhuǎn)時(shí)間 均較顯凝試驗(yàn)抗體為早，具有一定的早期診斷意義。
上述各項(xiàng)檢測(cè)，均是用已知鉤體抗原檢測(cè)血中出現(xiàn)的相應(yīng)抗體， 不能做到早期診斷。近年來開展了乳膠凝集抑制試驗(yàn)，反向間接血凝 試驗(yàn)與間接熒光抗體染色試驗(yàn)等可以測(cè)出血中早期存在的鉤體，已取 得了早期診斷的初步成果。
3. 其它診斷
(l)鉤端螺旋體DNA探針技術(shù)早已應(yīng)用于臨床，schoone等1984 年證實(shí)，用黃疸出血群哥本哈根型Wijnberg株DNA制備探針，可在
硝酸纖維素濾膜上檢出2pg的同源DNA。且致病性鉤體不同血清群
Patoc I株呈交義雜交現(xiàn)象。作者認(rèn)為DNA探針雜交技術(shù)是一種敏感 性高的早期診斷方法。
(2)DNA基因擴(kuò)增技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的DNA擴(kuò)增技術(shù) 目前已引入鉤體病的診斷領(lǐng)域。因PCR只要有引物便可進(jìn)行試驗(yàn)， 且方法簡(jiǎn)便，并適用于大數(shù)量標(biāo)本的流行病學(xué)調(diào)查。VanEys等1989 年用PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)哈焦型鉤體感染的牛尿作了檢測(cè)研究，提出 PCRDNA擴(kuò)增技術(shù)完全可作鉤體病診斷的一個(gè)新型方法。
4.鉤端螺旋體膜蛋白的研究已有研究證明，ompLl和Lip32是 鉤端螺旋體的主要膜蛋白，特別是Lip32是已知膜蛋白中含量最高的。 ELISA研究證實(shí)，ompLl和Lip32在感染動(dòng)物的體內(nèi)有大量的表達(dá)， 均具有良好的免疫原性。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明的目的是提供一種使用方便、快捷，用于檢測(cè)鉤端螺旋體屬 特異性抗體的試紙條，檢測(cè)人類或動(dòng)物標(biāo)本中鉤端螺旋體屬特異性抗 體，用于鉤端螺旋體感染的輔助診斷。
本發(fā)明的另 一 目的在于提供上述試紙條的制備方法。 本發(fā)明試紙條包括反應(yīng)膜和結(jié)合物釋放墊，所述反應(yīng)膜具有同時(shí) 包鉤端螺旋體屬特異性抗原ompLl和LipL32的檢測(cè)帶和包被兔抗鉤 端螺旋體屬特異性抗原的多克隆抗體的質(zhì)控帶；所述結(jié)合物釋放墊包 被有膠體金標(biāo)記的鉤端螺旋體屬特異性抗原ompLl和LipL32。
其中，反應(yīng)膜可為硝酸纖維膜，結(jié)合物釋放墊可為玻璃纖維膜。 本發(fā)明通過基因工程手段分別獲得ompLl和LipL32的基因工程
抗原，這可以顯著提高試紙條的特異性。
本發(fā)明還提供一種制備上述檢測(cè)試紙條的方法，其包括如下步
驟
1)制備鉤端螺旋體屬特異性抗原ompLl和LipL32;
2) 將步驟1)制備的鉤端螺旋體屬特異性抗原ompLl和LipL32
以及兔抗鉤端螺旋體屬特異性抗原的多克隆抗體在反應(yīng)膜上分別形 成檢測(cè)帶和質(zhì)控帶，備用；
3) 用膠體金分別標(biāo)記鉤端螺旋體屬特異性抗原ompLl和 LipL32，被包被到結(jié)合物釋放墊中；
4) 將制備好的反應(yīng)膜以及結(jié)合物釋放墊與樣本墊、吸水墊和反 應(yīng)支持物組裝成試紙條。
本發(fā)明的技術(shù)方案是采用純化的鉤端螺旋體屬特異性抗原 ompLl/LipL32和兔抗鉤端螺旋體屬特異性抗原的多克隆抗體分別固 相于硝酸纖維膜上(NC膜)，結(jié)合膠體金標(biāo)記的鉤端螺旋體屬特異性 抗原，應(yīng)用膜層析雙抗原夾心法的原理檢測(cè)標(biāo)本中的鉤端螺旋體屬特 異性抗體。
本發(fā)明試紙條可用于檢測(cè)鉤端螺旋體屬特異性抗體。 本發(fā)明的試紙條利用膠體金標(biāo)記技術(shù)和膜層析技術(shù)，用于快速定 性半定量檢測(cè)樣本中可能存在的鉤端螺旋體屬特異性抗體，達(dá)到快速 篩檢病人和受染動(dòng)物，及時(shí)控制疫情的目的。節(jié)省了大量人力物力， 方便、快速、簡(jiǎn)捷，不需特殊儀器設(shè)備，不需專業(yè)培訓(xùn)，結(jié)果清晰易 辨，操作簡(jiǎn)單，易于推廣，適合基層，適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào) 查，對(duì)鉤端螺旋體的感染診斷起到輔助作用。


圖1:A本發(fā)明試紙條的正面示意圖；B本發(fā)明試紙條的側(cè)面 示意圖。其中，1:吸水墊；2:硝酸纖維膜(T:被鉤端螺旋體屬特 異性抗原ompLl和LipL32; C:抗鉤端螺旋體的多克隆抗體的質(zhì)控 條帶);3:含有膠體金標(biāo)記鉤端螺旋體屬特異性抗原ompLl和LipL32 的玻璃纖維膜；4:金標(biāo)抗體保護(hù)膜；5:反應(yīng)支持物。
圖2:檢測(cè)結(jié)果示意圖。其中，從左至右依次為T、 C兩條線 陽性；C一條線陰性；T、 C兩條線陰性，無效。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的 限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或 條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟 知的常規(guī)手段。
實(shí)施例1鉤端螺旋體屬特異性抗原ompLl和LipL32的克隆表達(dá)
(1 )ompLl (登錄號(hào)為EU022021 )和LipL32(登錄號(hào)為AM936999 ) 基因的擴(kuò)增
根據(jù)目的基因片段序列設(shè)計(jì)引物 LipL32引物序列
5 , GCCGAATTCATGAAAAAACTTTCGATTTTG 3, 5 ' GCCCTCGAGTTACTTAGTCGCGTCAGAAGC 3'
PCR參數(shù)95°C 5min; 95。Clmin， 5(TC30s， 70。Clmin， 30個(gè) 循環(huán)；最后70度延伸10min。 ompLl引物序列
5 ' GCCGATATCATGAGAAAATTATCTTCTCTA 3' 5 ' GCACTCGAGTTACTTTGCGTTGCTTTCGTC 3' PCR參數(shù)95°C 5min; 95。Clmin, 55。C30s, 72。Clmin, 30個(gè) 循環(huán)；最后72度延伸10min。
(2) 目的基因的克隆和陽性重組子的篩選 將兩種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后切膠回收，與PMD-18T克隆載體16度
過夜連接后，轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆菌株，37度過 夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后，以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR鑒定陽性克隆菌株，測(cè) 定序列。
(3) 融合表達(dá)載體的構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶五coAl、 ^Tzol分別酶切T/ompLl和LipL32和
pGEX-4T-l, 1%瓊脂糖電泳切膠回收目的片段和pGEX-4T-l雙酶切后 的大片段，用T4連接酶16度過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì) 胞，LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)8 10小時(shí)，挑取單菌落培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒， 用PCR及限制性內(nèi)切酶EcoRI、 Xhol雙酶切分別鑒定，PCR產(chǎn)物和酶 切產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳進(jìn)行分析，篩選陽性克隆，將重組的質(zhì)粒測(cè) 序。
(4) 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 篩選出的陽性克隆菌在LB培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)過夜后，將過夜菌按
照l: 100的比例接種至1000mlLB液體培養(yǎng)基中，37度搖床培養(yǎng)?；?因轉(zhuǎn)化菌在接種后2小時(shí)為最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)(OD600nm0.5)，對(duì)于ompLl, IPTG濃度0.3mmol/L,對(duì)于LipL32, IPTG濃度為0.5mmol/L,均于29 度誘導(dǎo)表達(dá)8小時(shí)。
(5) 表達(dá)蛋白的純化、鑒定
將(4)中1000ml菌液12000r/m、 4度離心，棄上清，將菌體用 細(xì)胞裂解液裂解，使用含有GST標(biāo)簽的親和層析柱子純化融合蛋白， 用GST-融合蛋白純化試劑盒(B-PER細(xì)菌GST標(biāo)簽融合蛋白柱式純 化Kit貨號(hào)78200賽默飛世爾科技)，按試劑盒推薦步驟和體系進(jìn) 行純化，純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳以判斷純化效果，通過紫外 薄層測(cè)得產(chǎn)率在95%以上。
融合蛋白的Western-Blot鑒定
切取一半膠用BioRad公司生產(chǎn)的半干電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)于硝酸纖維素膜 上，進(jìn)行印跡試驗(yàn)， 一抗為鉤端螺旋體單抗(北京博奧森生物技術(shù)有 限公司)，TMB顯色后，結(jié)果有特異性蛋白條帶出現(xiàn)。
上述步驟(2)、 (3)、 (4)和(5)所述的步驟中，ompLl和 LipL32是平行的。即，ompLl和LipL32均采用上述步驟進(jìn)行了表達(dá)和 鑒定。
實(shí)施例2 ompLl及LipL32多克隆抗體的制備(1) 動(dòng)物免疫
選擇l-2kg的新西蘭白兔，用ompLl蛋白于背部皮下多點(diǎn)注射， 免疫劑量為lmg/kg。共免疫4次。
(2) 免疫效價(jià)檢測(cè)
包被ompLl蛋白的酶標(biāo)板，每孔4jiig。按間接ELISA法檢測(cè)免疫 血清的效價(jià)。血清效價(jià)達(dá)到l: 20000以上，可釆集血清。
(3) 抗體提純及檢定
釆用常規(guī)辛酸法提純。純度用非變性PAGE電泳檢定，顯示蛋白 一條帶。活性釆用ELISA檢定，效價(jià)大于l: 20000。 LipL32多克隆抗體的制備與ompLl方法相同
實(shí)施例3鉤端螺旋體抗體膠體金快速檢測(cè)試紙條(參見圖1)
(1) 膠體金-抗原結(jié)合物的制備
經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定，將混合的表達(dá)蛋白(ompLl和LipL32按l:l混合) 膠體標(biāo)記的其最佳結(jié)合pH值為8.4，膠體金和抗原的配比為50ng/ml 膠體金。標(biāo)記膠體金經(jīng)穩(wěn)定劑(0.5%BSA， pH8.0， 0.01MTris緩沖液) 處理后，按每平方厘米65pl的量，取膠體金-抗體結(jié)合物溶液，均勻 吸附于玻璃纖維上，冷凍干燥，并在干燥環(huán)境中保存。
(2) 包被抗原于硝酸纖維膜
將混合的表達(dá)蛋白(ompLl和LipL32按l:l混合)用0.01MPBS稀 釋成3mg/ml。將抗ompLl和LipL32的多克隆抗體用0.01MPBS稀釋成 2mg/ml。用噴膜機(jī)將二者以lW/cm的速度噴于硝酸纖維膜上，分別形 成檢測(cè)線和對(duì)照線。兩條線之間的間隔為0.5cm。
把固定有抗原抗體的硝酸纖維置37'C烤箱中干燥2小時(shí)。干燥環(huán)
境中保存?zhèn)溆谩?br> (3) 鉤端螺旋體抗體檢測(cè)試劑盒組成
反應(yīng)支持物為6.5cm x 0.4cmPCV板；吸水墊為2cm x 0.4cm的濾 油紙；1.8cm x 0.4cm的硝酸纖維膜依次包被ompLl和LipL32的多克隆
抗體，鉤端螺旋體屬特異性表達(dá)蛋白o(hù)mpLl和LipL32， 0.4cm x 0.4cm 的含有膠體金標(biāo)記的人ompL 1和LipL32的玻璃纖維；金標(biāo)抗體保護(hù)膜 (樣品墊)為2.7cm x 0.4cm的濾紙纖維；即形成了鉤端螺旋體抗體檢 測(cè)試紙條(膠體金法)。
(4)鉤端螺旋體抗體檢測(cè)試劑盒特異性及敏感度實(shí)驗(yàn)
特異性檢測(cè)用本品檢測(cè)正常人血清，傷寒病人血清、流感病人 血清、呼吸道感染病人血清、血吸蟲病人血清、腹瀉病人血清，均為 陰性。
敏感度檢測(cè)ELISA法篩選IgG陽性血清，共10份。檢測(cè)結(jié)果如下
表1與ELISA法的對(duì)比
血清編號(hào)ELISA效價(jià)膠體金法檢測(cè)結(jié)果
11: 3201: 40
21: 1601: 40
31: 320k 20
41: 3201: 20
1: 6401: 20
61: 3201: 20
71: 1601: 40
81: 1601: 20
實(shí)施例4 檢測(cè)方法(參見圖2)
將待檢標(biāo)本(全血、血漿或血清)直接滴加入實(shí)施例2試紙條"4" 處，樣品液沿膜上行，10-15分鐘判讀結(jié)果。 結(jié)果
如樣本中含有鉤端螺旋體抗體，則與試紙條上膠體金標(biāo)記的鉤端 螺旋體屬特異性抗原形成相應(yīng)的復(fù)合物，上行與包被在硝酸纖維膜上 的鉤端螺旋體屬特異性抗原結(jié)合，形成紅色線條，即在T處形成紅 色條帶。
無論是否含有鉤端螺旋體抗體，膠體金標(biāo)記鉤端螺旋體屬特異性
抗原繼續(xù)向上爬行與包被在膜上的鉤端螺旋體屬多克隆抗體形成紅 色沉淀線，即在"C"處形成紅色條帶。此線是質(zhì)控線，如膠體金失 效，此線就不會(huì)出現(xiàn)，說明試紙條失效。 序列表
<110>北京莊笛浩未生物醫(yī)學(xué)科技有限公司
<120> —種鉤端螺旋體屬特異性抗體膠體金快速檢測(cè)試紙條
<130〉
<160> 4
<170> Patentln version 3. 3
<210> 1 <211> 30 〈212〉 DNA <213>人工序列 <400〉 1
gccgaattca tgaaaaaact ttcga/ttttg 30
<210> 2 〈211> 30 〈212> 腿 <213>人工序列 〈400> 2
gccctcgagt tacttagtcg cgtcagaagc 30
<210〉 3 〈211> 30 〈212〉 DNA <213>人工序列 <400〉 3
gccgatatca tgagaaaatt atcttctcta 30
<210> 4 <211> 30 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 <400> 4
gcactcgagt tactttgcgt tgctttcgtc 30
權(quán)利要求
1、一種檢測(cè)試紙條，包括反應(yīng)膜和結(jié)合物釋放墊，所述反應(yīng)膜具有同時(shí)包被鉤端螺旋體屬特異性抗原ompL1和LipL32的檢測(cè)帶和包被兔抗鉤端螺旋體屬特異性抗原的多克隆抗體的質(zhì)控帶；所述結(jié)合物釋放墊包被有膠體金標(biāo)記的鉤端螺旋體屬特異性抗原ompL1和LipL32。
2、 如權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，其中所述鉤端螺 旋體屬特異性抗原ompLl和LipL32是應(yīng)用基因工程方法重組表達(dá)獲 得。
3、 如權(quán)利要求l或2所述的試紙條，其特征在于，所述反應(yīng)膜 為硝酸纖維素膜。
4、 如權(quán)利要求l或2所述的試紙條，其特征在于，所述的結(jié)合物釋放墊為玻璃纖維膜。
5、 如權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)所述試紙條，其特征在于，所述的 二抗IgG為抗鼠IgG。
6、 一種制備權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述試紙條的方法，其包括如 下步驟1)制備鉤端螺旋體屬特異性抗原ompLl和LipL32;2 )將步驟1 )制備的鉤端螺旋體屬特異性抗原ompLl和LipL32 以及兔抗鉤端螺旋體屬特異性抗原的多克隆抗體在反應(yīng)膜上分別形 成檢測(cè)帶和質(zhì)控帶，備用；3) 用膠體金分別標(biāo)記鉤端螺旋體屬特異性抗原ompLl和 LipL32,被包被到結(jié)合物釋放墊中；4) 將制備好的反應(yīng)膜以及結(jié)合物釋放墊與樣本墊、吸水墊和反 應(yīng)支持物組裝成試紙條。
7、 權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述的試紙條在檢測(cè)鉤端螺旋體屬特異 性抗體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)鉤端螺旋體抗體的快速檢測(cè)試紙條包括反應(yīng)膜和結(jié)合物釋放墊，所述反應(yīng)膜具有同時(shí)包被鉤端螺旋體屬特異性抗原ompL1和LipL32的檢測(cè)帶和包被兔抗鉤端螺旋體屬特異性抗原的多克隆抗體的質(zhì)控帶；所述結(jié)合物釋放墊包被有膠體金標(biāo)記的鉤端螺旋體屬特異性抗原ompL1和LipL32，應(yīng)用膜層析雙抗原夾心法，檢測(cè)標(biāo)本中鉤端螺旋體屬特異性抗體。應(yīng)用本發(fā)明試紙條檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單、方便、快速、簡(jiǎn)捷，不需特殊儀器設(shè)備，不需專業(yè)培訓(xùn)，結(jié)果清晰易辨，操作簡(jiǎn)單，易于推廣，適合基層，適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)鉤端螺旋體感染診斷起到輔助作用。
文檔編號(hào)G01N33/544GK101363855SQ20081011272
公開日2009年2月11日 申請(qǐng)日期2008年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月26日
發(fā)明者明 劉 申請(qǐng)人:北京莊笛浩禾生物醫(yī)學(xué)科技有限公司