專利名稱：一種豬鏈球菌2型膠體金檢測(cè)試紙條、其制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種豬鏈球菌2型膠 體金檢測(cè)試紙條、其制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬鏈球菌(S^內(nèi)ococcwm^)可引起豬的腦膜炎，關(guān)節(jié)炎以及敗
血癥等疾病，并可致青年豬猝死。該菌亦可引起人類的感染，導(dǎo)致腦 膜炎等嚴(yán)重疾患，是一種重要的人獸共患病的病原體。豬鏈球菌共分
為35個(gè)血清型，其中豬鏈球菌2型呈全球分布，且臨床分離的比例 最高。在豬鏈球菌2型中，存在強(qiáng)毒、弱毒以及無(wú)毒三種不同毒力的 菌株。強(qiáng)毒株與無(wú)毒株的最大差別是前者呈MRP+，而后者呈MRF。 MRP+的豬鏈球菌往往可引起嚴(yán)重的臨床癥狀，MRP-的菌株則不致任 何癥狀，可見(jiàn)MRP是該菌重要的毒力因子。
1. 流行特點(diǎn)鏈球菌廣泛分布于自然界。人和多種動(dòng)物都有易 感性，豬的易感性較高。各種年齡的豬都可發(fā)病，但敗血癥型和腦炎 型多見(jiàn)于仔豬，化膿性淋巴結(jié)炎型多見(jiàn)于中豬。病豬、臨床康復(fù)豬和 健康豬均可帶菌，當(dāng)它們互相接觸時(shí)，可通過(guò)口、鼻、皮膚傷口而傳 染。 一般呈地方性流行，本病傳人之后，往往在豬群中陸續(xù)地出現(xiàn)。
2. 臨床癥狀自然感染的潛伏期在ld左右。最急性型突然發(fā)病， 體溫升高到41-42。C，在數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡。死亡率高達(dá)50%以上。上述癥 狀如治療不當(dāng)可轉(zhuǎn)為亞急性或慢性型，病程長(zhǎng)達(dá)十多天，表現(xiàn)為體溫 時(shí)高時(shí)低，食欲不振，關(guān)節(jié)明顯腫大.跛行嚴(yán)重，消痩，治療護(hù)理得 當(dāng)可逐漸康復(fù)，否則，惡化轉(zhuǎn)歸死亡。另外，還有一種單純的慢性感 染，表現(xiàn)在頸部或其它部位多處長(zhǎng)，膿胞，淋巴結(jié)腫脹，多個(gè)關(guān)節(jié)發(fā) 炎，腫痛出現(xiàn)跛行，若是關(guān)節(jié)炎治療不當(dāng)可導(dǎo)致關(guān)節(jié)變形.影響出口
和種用，或生長(zhǎng)遲緩降低伺料報(bào)酬。
3.實(shí)驗(yàn)室檢查根據(jù)不同的病型釆取相應(yīng)的病料，如膿腫、化 膿灶、肝、脾、關(guān)節(jié)囊液、腦脊髓液及腦組織等，制成涂片，用堿性 美藍(lán)染色液和革蘭氏染色液染色。顯微鏡檢査。見(jiàn)到單個(gè)、成對(duì)、短 鏈或呈長(zhǎng)鏈的球菌.革蘭氏染色呈紫色(陽(yáng)性)，可以確認(rèn)為本病。 也可進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定。
豬鏈球菌2型抗原的診斷主要是涂片鏡檢，取病豬血液、肝、脾、 淋巴結(jié)涂片染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)單個(gè)、3-4個(gè)、4-5個(gè)短鏈或7-8個(gè)長(zhǎng)鏈的革 蘭氏陽(yáng)性球菌；馬丁肉湯培養(yǎng)，將病料接種肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h發(fā) 現(xiàn)呈混濁并有大量白色絮狀沉淀，培養(yǎng)物鏡檢，發(fā)現(xiàn)同樣有革蘭氏陽(yáng) 性球菌；生化檢測(cè)將分離物做生化反應(yīng)，與葡萄糖、麥芽糖、乳糖、 果糖、蔗糖培養(yǎng)基均不產(chǎn)酸，而木糖、衛(wèi)矛醇、山梨醇和菊糖培養(yǎng)基 不發(fā)酸。但操作繁瑣復(fù)雜，時(shí)間長(zhǎng)。
快速檢測(cè)中，多應(yīng)用乳膠凝集試驗(yàn)。Davies用熒光抗體技術(shù)， Serhir曾用雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)病豬樣品中的豬鏈球菌2型抗 原，該方法靈敏度和特異性達(dá)98-100%。
隨著免疫技術(shù)的不斷發(fā)展，先后出現(xiàn)了指紋圖譜、核酸擴(kuò)增法 (PCR)但均存在需要昂貴的儀器、操作復(fù)雜、時(shí)間長(zhǎng)、需專業(yè)人員 等問(wèn)題。
膠體金免疫層析法(Immunochromatography Assay )始于上世紀(jì) 90年代中期，是在免疫滲濾法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。它是免疫親和技 術(shù)、印跡技術(shù)、免疫標(biāo)記技術(shù)和層析技術(shù)的組合。將包被抗原、膠體 金標(biāo)記抗體固相化，與樣本吸附材料等組合在一起，制備為免疫層析 診斷試條/板，使用時(shí)只需要把試紙條下插入樣本溶液，數(shù)分鐘就可 以判斷結(jié)果。與免疫滲濾法比較，穩(wěn)定性好，操作更簡(jiǎn)便、快速，且 由于為試條/試板形式，無(wú)需低溫保存，儲(chǔ)運(yùn)方便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種使用方便、快捷，用于檢測(cè)豬鏈球菌2 型膠體金試紙條，檢測(cè)人類中豬鏈球菌2型特異性抗原，用于豬鏈球 菌的輔助診斷。
本發(fā)明的另一目的是提供一種豬鏈球菌2型膠體金檢測(cè)試紙條 的制備方法。
本發(fā)明的再一目的是提供一種豬鏈球菌2型膠體金檢測(cè)試紙條 在檢測(cè)豬鏈球菌2型中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種豬鏈球菌2型膠體金檢測(cè)試紙條，其包括含 有包被有豬鏈球菌2型特異性抗原MRP的單克隆抗體或抗豬鏈球菌 2型特異性抗原的多克隆抗體和二抗IgG兩個(gè)條帶的硝酸纖維膜，及 含有膠體金標(biāo)記的豬鏈球菌2型特異性抗原MRP的單克隆抗體的玻 璃纖維膜。
其中，所述的豬鏈球菌2型特異性抗原MRP通過(guò)原核表達(dá)制備 獲得。
所述硝酸纖維膜中所述二抗IgG為抗鼠IgG抗體。 所述玻璃纖維膜中膠體標(biāo)記的豬鏈球菌2型特異性抗原MRP的
單克隆抗體的pH值為7.6~8.0，膠體金和抗體的配比為24pg/ml膠體金。
所述硝酸纖維膜中豬鏈球菌2型特異性抗原MRP的單克隆抗體 或抗豬鏈球菌2型特異性抗原的多克隆抗體的濃度為1.2mg/ml，所述 抗鼠IgG的濃度為2mg/ml，釆用0.01MPBS進(jìn)行稀釋。
本發(fā)明所述豬鏈球菌2型膠體金檢測(cè)試紙條，還包括反應(yīng)支持 物、金標(biāo)抗體保護(hù)膜和吸水墊，所述反應(yīng)支持物上依次相互搭接粘貼 的金標(biāo)抗體保護(hù)膜、玻璃纖維膜、硝酸纖維膜和吸水墊。
所述反應(yīng)支持物優(yōu)選PVC板；所述吸水墊優(yōu)選濾油紙；所述金 標(biāo)抗體保護(hù)膜同時(shí)具有吸水功能，優(yōu)選用聚脂膜、玻璃纖維或?yàn)V紙纖 維。
本發(fā)明豬鏈球菌2型膠體金檢測(cè)試紙條的制備方法，包括以下步
1) 分別制備豬鏈球菌2型特異性抗原MRP的單克隆抗體；
2) 硝酸纖維膜的制備將豬鏈球菌2型特異性抗原MRP的單克隆 抗體用PBS稀釋成L2mg/ml，將抗鼠IgG用PBS稀釋成2mg/ml，噴于硝 酸纖維膜上，分別形成檢測(cè)線和對(duì)照線，且于37"C中干燥2小時(shí)，備 用；
3) 玻璃纖維膜的制備將膠體金調(diào)整pH值為7.6 8.0，膠體金 和抗體的配比為24pg/ml膠體金，經(jīng)穩(wěn)定劑(含0.5。/。BSA， pH8.0， O.OMTris緩沖液)處理后，按每平方厘米65pl的量均勻吸附于玻璃纖 維膜上，冷凍干燥，備用；
4) 最后在反應(yīng)支持物上依次相互搭接粘貼金標(biāo)抗體保護(hù)膜、玻 璃纖維膜、硝酸纖維膜和吸水墊。
本發(fā)明所述試紙條在檢測(cè)豬鏈球菌2型中的應(yīng)用。 本發(fā)明釆用純化的豬鏈球菌2型特異性抗原MRP的單克隆抗體 或抗豬鏈球菌2型特異性抗原的多克隆抗體和抗鼠IgG分別固相于硝 酸纖維膜上(NC膜)，結(jié)合膠體金標(biāo)記的豬鏈球菌2型特異性抗原 MRP的單克隆抗體，應(yīng)用膜層析雙抗體夾心法的原理檢測(cè)標(biāo)本中的 豬鏈球菌。
本發(fā)明的試紙條利用膠體金標(biāo)記技術(shù)和膜層析技術(shù)，用于快速定 性半定量檢測(cè)樣本中可能存在的豬鏈球菌，達(dá)到快速篩檢病人，及時(shí) 控制疫情的目的。同時(shí)也可用于外環(huán)境樣本增菌后的快速篩查。為下 一步的分離鑒定創(chuàng)造成了有利條件，節(jié)省了大量人力物力，方便、快 速、簡(jiǎn)捷，不需特殊儀器設(shè)備，不需專業(yè)培訓(xùn)，結(jié)果清晰易辨，操作 簡(jiǎn)單，易于推廣，適合基層，適合于突發(fā)事件的大批量現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，適 合流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)豬鏈球菌的感染診斷起到輔助作用。


圖1A為本發(fā)明所述豬鏈球菌2型檢測(cè)試紙條的正面示意圖IB為本發(fā)明所述豬鏈球菌2型檢測(cè)試紙條的側(cè)面示意圖； 其中，1:吸水墊；
2:硝酸纖維膜(T:豬鏈球菌2型特異性抗原MRP的單克隆抗 體或抗豬鏈球菌2型特異性抗原的多克隆抗體的條帶；C:包被抗鼠 IgG的質(zhì)控條帶)；
3:含有膠體金標(biāo)記豬鏈球菌2型特異性抗原MRP的單克隆抗 體的玻璃纖維膜；
4:金標(biāo)抗體保護(hù)膜；
5:反應(yīng)支持物。
圖2為本發(fā)明所述試紙條檢測(cè)結(jié)果示意圖。 其中，從左至右依次為T、 C兩條線陽(yáng)性；C 一條線陰性；T、 C 兩條線陰性，無(wú)效。
具體實(shí)施例方式
通過(guò)下面給出的本發(fā)明的具體實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例可以進(jìn)一步清楚 地理解本發(fā)明，但不是對(duì)本發(fā)明的限定。
若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟 知的常規(guī)手段。
實(shí)施例1豬鏈球菌2型特異性抗原MRP的克隆表達(dá) (1) MRP基因的擴(kuò)增 PCR引物設(shè)計(jì)
根據(jù)所要擴(kuò)增的片段，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引物兩端分別添加&zc I
和歷'"d m酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基，引物pi和P2可擴(kuò)增豬鏈球菌2
型MRP基因開(kāi)放閱讀框(ORF)298 827bp間529bp的片段。(MRP 基因GenBank登陸號(hào)為EF520110 )
引物序列分別為
上游引物P1 : 5'2 GTAGAGCTCGAACAGGTAACATCAGA3'; 下游引物P2 : 5'2 CAGAAGCTTAAGAGTAACGAATGTAGG3'。 PCR擴(kuò)增
按下列順序和條件依次加入各反應(yīng)物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。模板 DNA 2pL， 10 xbuffer 10(iL, 25mmol/L MgCl28|iL， 215 mmol/L dNTPs 8pL，引物Pl和P2(0.1pmol/L)各lpL， ddH20 68nL, 7b《酶(5UIVL) 3pL 。擴(kuò)增的條件為94。C5min, 94 。C30s ， 55 。C30s， 72 。C60s， 30個(gè)循環(huán)；72 。ClOmin。 PCR產(chǎn)物的回收和酶切
PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳，后以DNA回收試劑盒回收目 的片段，并以&c I和歷wdin酶切2h， 65 。C15min終止反應(yīng)。 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定
在含有100昭/mL Amp的LB肉湯中接種攜帶pETWa ( + )空質(zhì) 粒的DH5a大腸桿菌單菌落，37t:搖振培養(yǎng)12-16h,以質(zhì)粒抽提試 劑盒抽提質(zhì)粒，^ c I和///"(1111雙酶切后，以DNA回收試劑盒回收 酶切產(chǎn)物。將PCR雙酶切回收產(chǎn)物與空質(zhì)粒雙酶切回收產(chǎn)物進(jìn)行連 接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5(x宿主菌。感受態(tài)細(xì)菌的制備、轉(zhuǎn)化均按常 規(guī)方法進(jìn)行，利用Amp的抗性和限制性內(nèi)切酶進(jìn)行重組菌的篩選和 鑒定。初步鑒定獲得了陽(yáng)性克隆10株。 重組質(zhì)粒的測(cè)序和序列分析
重組質(zhì)粒的序列測(cè)定釆用Sanger雙脫氧末端終止法，由寶生物工 程(大連)有限公司完成，以驗(yàn)證其閱讀框架，并以BLAST軟件進(jìn)行 同源性分析，結(jié)果表明所獲得的陽(yáng)性克隆與目的序列完全一致。 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)和純化
將重組質(zhì)粒按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌BL21,利用Amp 抗性篩選重組菌，挑單菌落接種LB肉湯中(含100嗎/mLAmp), 37 °C 劇烈搖振培養(yǎng)2 4h,當(dāng)菌液濃度達(dá)Aoo 0.5-0.6時(shí),加IPTG至終濃
度lmmol/L, 37 。C繼續(xù)劇烈搖振培養(yǎng)2-4h。 6000rPmin離心5min,沉 淀以pH7.2 1Ommol/L的PBS洗滌3次，加等體積的電泳上樣緩沖液 煮沸10min, SDSPAGE檢測(cè)。含空pET32a( + )的大腸桿菌BL21亦 同樣經(jīng)IPTG誘導(dǎo)處理后，SDS PAGE檢測(cè)表達(dá)情況。以超聲波破碎 誘導(dǎo)的重組菌，收集上清，以QIAgen鎳親和層析柱進(jìn)行親和層析， 具體步驟按使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 重組蛋白免疫檢定試驗(yàn)
分別用收集的重組蛋白和豬鏈球菌2型全菌免疫小鼠，制備免疫 血清。包被MRP酶標(biāo)板，分別檢測(cè)MRP與全菌免疫血清和MRP免疫 血清的反應(yīng)性。結(jié)果證實(shí)，所表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性和免疫 反應(yīng)性。
實(shí)施例2:抗豬鏈球菌2型MRP蛋白單克隆抗體細(xì)胞株的研制 (1 )免疫小鼠
制備的基因工程抗原以 一 定的劑量免疫B ALB/C小鼠。免疫效果 用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。
(2) 骨髓瘤細(xì)胞
SP2/0骨髓瘤細(xì)胞將存儲(chǔ)在液氮罐中的SP2/0細(xì)胞復(fù)蘇，在含有 10。/。小牛血清DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48-72小時(shí)，待細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì) 胞渾圓、透亮、大小均一、排列整齊、呈對(duì)數(shù)分裂，準(zhǔn)備融合。
(3) 細(xì)胞融合
制備好的SP2/0細(xì)胞和免疫的BALB/C小鼠的脾淋巴細(xì)胞分別配 制成2xl07/ml和lxl0Vml。各取lml室溫下混合。用0.8ml， 50。/。的PEG (分子量1500)作為融合劑；培養(yǎng)液用10。/。小牛血清DMEM。
(4) 陽(yáng)性孔的檢測(cè)和篩選
ELISA法檢測(cè)。包被MRP蛋白和豬鏈球菌2型全菌抗原兩種酶標(biāo) 板。對(duì)融合細(xì)胞的培養(yǎng)上清液進(jìn)行檢測(cè)，選擇ELISA效價(jià)OD值大于 l.O的陽(yáng)性孔進(jìn)行亞克隆。共檢出陽(yáng)性克隆21株，選擇9株進(jìn)行亞克隆
操作。
(5) 單抗細(xì)胞株的亞克隆 用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性克隆細(xì)胞株進(jìn)行克隆化篩選。對(duì)篩選的的陽(yáng)
性克隆經(jīng)過(guò)凍存、復(fù)蘇、傳代等過(guò)程，最終獲得6株可穩(wěn)定分泌特異
性抗豬鏈球2型MRP的單克隆抗體細(xì)胞株。
(6) 單克隆抗體細(xì)胞株檢定
細(xì)胞株核型分析對(duì)上述雜交瘤細(xì)胞染色體進(jìn)行檢測(cè)為96條；證 明他們是SP2/0骨髓瘤與小鼠細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞。
細(xì)胞株穩(wěn)定性對(duì)6株產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)連續(xù)克 隆化檢測(cè)單克隆抗體陽(yáng)性率100%，并經(jīng)反復(fù)凍存復(fù)蘇均能達(dá)到保持 穩(wěn)定的分泌抗體要求。
實(shí)施例3:抗豬鏈球菌2型MRP單克隆抗體的檢定
(1) 單抗腹水制備
小鼠SPF級(jí)小鼠，經(jīng)檢査無(wú)鼠源病毒污染，在腹水生產(chǎn)過(guò)程中 如發(fā)現(xiàn)動(dòng)物不健康、咬傷、感染者應(yīng)棄掉。
細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)取生產(chǎn)批細(xì)胞管l支復(fù)蘇，加營(yíng)養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)， l支生產(chǎn)細(xì)胞只用一次，不再凍存。
雜交瘤細(xì)胞株接種制備腹水均需在無(wú)菌條件下進(jìn)行，注射雜交 瘤細(xì)胞之前，每只小鼠腹腔注射液體石蠟0.5ml。 一周后每只小鼠腹 腔注射雜交瘤細(xì)胞l 3xl0V0.2ml。
腹水釆集注射細(xì)胞株7 10天，或小鼠瀕死前一次釆集腹水，置 -2(TC保存。
(2) 單克隆抗體的提純
采用硫酸銨沉淀法粗提，進(jìn)而用HiTraprProteinA柱純化，經(jīng) SDS-PAGE電泳檢定，僅顯示單一蛋白帶。
(3) 抗體親合力測(cè)定采用NaSCN竟?fàn)嶦LISA實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其EDso 的下降值，來(lái)間接反映其抗體親合力的大小。選擇其中親和力較好的
6株，進(jìn)行亞型檢定。
(4) 亞型檢定釆用免疫擴(kuò)散法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清的單抗進(jìn)行Ig 亞類的檢測(cè)。上述6株單克隆抗體的Ig亞類分別是IgGl有三株； IgG2a有二株。
(5) 抗原位點(diǎn)檢定用相加ELISA法對(duì)6株單抗的抗原結(jié)合位點(diǎn) 進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，這6株中有四種不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)。 實(shí)施例4:豬鏈球菌2型MRP蛋白多克隆抗體制備
(1) 動(dòng)物免疫
選擇l 2kg的新西蘭白兔，用豬鏈球菌2型MRP蛋白于背部皮下 多點(diǎn)注射，免疫劑量為0.5 lmg/kg。共免疫3 5次。
(2) 免疫效價(jià)檢測(cè) 包被豬鏈球菌2型MRP蛋白酶標(biāo)板，每孔4嗎。按間接ELISA法檢
測(cè)免疫血清的效價(jià)。血清效價(jià)達(dá)到l: 20000以上，可采集血清。
(3) 抗體提純及檢定
釆用常規(guī)辛酸法提純。純度用非變性PAGE電泳檢定，顯示蛋白 一條帶?；钚圆捎肊LISA檢定，效價(jià)大于l: 16000。
實(shí)施例5:豬鏈球菌2型膠體金檢測(cè)試紙條的研制(參見(jiàn)圖l)
(1 )膠體金-MRP單克隆抗體結(jié)合物的制備 經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定，抗MRP單克隆抗體膠體標(biāo)記的其最佳結(jié)合pH值為 8.0，膠體金和抗體的配比為以24昭蛋白/ml膠體金加入抗MRP單克隆 抗體。標(biāo)記膠體金經(jīng)穩(wěn)定劑(含0.5。/。BSA， pH8.0, O.OMTris緩沖液) 處理后，按每平方厘米65pl的量，取膠體金-抗體結(jié)合物溶液，均勻吸 附于玻璃纖維上，冷凍干燥，并在干燥環(huán)境中保存。
(2)包被抗體于硝酸纖維膜
將MRP的另 一株單抗(與膠體金標(biāo)記的單克隆抗體的抗原結(jié)合位 點(diǎn)不同)用0.01MPBS稀釋成1.2mg/ml。將抗鼠IgG多克隆抗體用 0.01MPBS稀釋成2mg/ml。用噴膜機(jī)將二者以lpl/cm的速度噴于硝酸
纖維膜上，分別形成檢測(cè)線和對(duì)照線。兩條線之間的間隔為0.5cm。 把固定有抗體的硝酸纖維置37-C烤箱中干燥2小時(shí)。干燥環(huán)境中
保存?zhèn)溆谩?br> (3)豬鏈球菌2型檢測(cè)試劑條組成
反應(yīng)支持物5為6.5cm x 0.4cm PCV板；吸水墊l為2cm x 0.4cm的 濾油紙；1.8cmx 0.4cm的硝酸纖維膜2依次包被抗鼠IgG,豬鏈球菌2 型特異性表達(dá)蛋白MRP的單克隆抗體或多克隆抗體，0.4cm x o.4cm 的含有膠體金標(biāo)記的抗MRP的單抗的玻璃纖維膜3;金標(biāo)抗體保護(hù)膜 (樣品墊)4為2.7cm x 0.4cm的濾紙纖維；即形成了豬鏈球菌檢測(cè)試 紙條(膠體金法)。
(4)豬鏈球菌2型抗原檢測(cè)試劑條特異性及敏感度
使用步驟3的檢測(cè)試劑條(檢測(cè)帶為單克隆抗體)進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 特異性實(shí)驗(yàn)本品設(shè)計(jì)如下的陰性質(zhì)控品，包括豬鏈球菌4型、7
型、IO型、25型，豬空腸彎曲菌、豬種布氏菌、豬瘟病毒、豬囊蟲(chóng)病。
檢測(cè)結(jié)果表明，本品與其均無(wú)交叉反應(yīng)。
敏感度實(shí)驗(yàn)用生理鹽水配制不同濃度的豬鏈球菌，檢測(cè)結(jié)果表
明，本品最低檢出量為lx 106菌/1111。
實(shí)施例6檢測(cè)方法(參見(jiàn)圖2)
將待檢標(biāo)本100 150[il直接滴加入實(shí)施例5試紙條"4"處，樣品液 沿膜上行，10 15分鐘判讀結(jié)果。
結(jié)果
如樣本中含有豬鏈球菌抗原，則與試紙條上膠體金標(biāo)記的豬鏈球 菌2型特異性抗原的單克隆抗體形成相應(yīng)的復(fù)合物，上行與包被在硝 酸纖維膜上的豬鏈球菌2型特異性抗原的單克隆抗體或抗豬鏈球菌2 型特異性抗原的多克隆抗體，形成紅色線條，即在T處形成紅色條 帶。
無(wú)論是否含有相對(duì)應(yīng)的抗原，膠體金標(biāo)記豬鏈球菌2型特異性抗
原的單克隆抗體繼續(xù)向上爬行與包被在膜上的抗鼠IgG形成紅色沉 淀線，即在"C"處形成紅色條帶。此線是質(zhì)控線，如膠體金失效，此 線就不會(huì)出現(xiàn)，說(shuō)明試紙條失效。
雖然，上文中已經(jīng)用 一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳 盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本 領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ) 上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
序列表
<110>北京莊笛浩未生物醫(yī)學(xué)科技有限公司
<120> —種豬鏈球菌2型膠體金檢測(cè)試紙條、其制備方法及其應(yīng)用
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〈170> Patentln version 3. 3
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<211〉 26
〈212> DNA <213>人工序列
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gtagagctcg aacaggtaac atcaga 26
<210〉 2
〈211〉 27
<212> DNA <213>人工序列
<400> 2
cagaagctta agagtaacga a/tgtagg 2權(quán)利要求
1、一種豬鏈球菌2型膠體金檢測(cè)試紙條，其特征在于，其包括含有包被有豬鏈球菌2型特異性抗原MRP的單克隆抗體或抗豬鏈球菌2型特異性抗原的多克隆抗體和二抗IgG兩個(gè)條帶的硝酸纖維膜(2)，及含有膠體金標(biāo)記的豬鏈球菌2型特異性抗原MRP的單克隆抗體的玻璃纖維膜(3)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述豬鏈球菌2型膠體金檢測(cè)試紙條，其特 征在于，所述的豬鏈球菌2型特異性抗原MRP通過(guò)原核表達(dá)制備獲 得。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述豬鏈球菌2型膠體金檢測(cè)試紙條， 其特征在于，所述硝酸纖維膜(2)中所述二抗IgG為抗鼠IgG抗體。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述豬鏈球菌2型膠體金檢測(cè)試紙條，其特 征在于，所述抗鼠IgG抗體的濃度為2mg/ml。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述豬鏈球菌2型膠體金檢測(cè)試 紙條，其特征在于，所述玻璃纖維膜(3)中膠體標(biāo)記的豬鏈球菌2 型特異性抗原MRP的單克隆抗體的pH值為7.6~8.0，膠體金和抗體 的配比為24昭/ml膠體金。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述豬鏈球菌2型膠體金檢測(cè)試 紙條，其特征在于，所述硝酸纖維膜中豬鏈球菌2型特異性抗原MRP 的單克隆抗體或抗豬鏈球菌2型特異性抗原的多克隆抗體的濃度為 1.2mg/ml。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)所述豬鏈球菌2型膠體金檢測(cè)試 紙條，其特征在于，還包括反應(yīng)支持物(5)、金標(biāo)抗體保護(hù)膜(4) 和吸水墊(1),所述反應(yīng)支持物(5)上依次相互搭接粘貼的金標(biāo)抗 體保護(hù)膜(4)、玻璃纖維膜(3)、硝酸纖維膜(2)和吸水墊(1)。
8、 一種制備權(quán)利要求7所述的豬鏈球菌2型膠體金檢測(cè)試紙條 的制備方法，包括以下步驟 1) 分別制備豬鏈球菌2型特異性抗原MRP的單克隆抗體；2) 硝酸纖維膜的制備將豬鏈球菌2型特異性抗原MRP的單克隆 抗體用PBS稀釋成1.2mg/ml，將抗鼠IgG用PBS稀釋成2mg/ml，噴于硝 酸纖維膜上，分別形成檢測(cè)線和對(duì)照線，且于37"C中干燥2小時(shí)，備 用；3)玻璃纖維膜的制備將膠體金調(diào)整pH值為7.6 8.0，膠體金 和抗體的配比為24昭/ml膠體金，經(jīng)穩(wěn)定劑處理后，按每平方厘米65|11 的量均勻吸附于玻璃纖維膜上，冷凍干燥，備用；4)最后在反應(yīng)支持物上依次相互搭接粘貼金標(biāo)抗體保護(hù)膜、玻 璃纖維膜、硝酸纖維膜和吸水墊。
9、權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)所述豬鏈球菌2型膠體金檢測(cè)試紙條 在檢測(cè)豬鏈球菌2型中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種豬鏈球菌2型膠體金檢測(cè)試紙條，其是在硝酸纖維膜(NC膜)上包被豬鏈球菌2型特異性抗原MRP的單克隆抗體或抗豬鏈球菌2型特異性抗原的多克隆抗體和質(zhì)控二抗IgG，結(jié)合膠體金標(biāo)記的豬鏈球菌2型特異性抗原MRP的單克隆抗體，應(yīng)用膜層析雙抗體夾心法，檢測(cè)標(biāo)本中豬鏈球菌2型的特異性抗原。應(yīng)用本發(fā)明試紙條檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單、方便、快速、簡(jiǎn)捷，不需特殊儀器設(shè)備，不需專業(yè)培訓(xùn)，結(jié)果清晰易辨，操作簡(jiǎn)單，易于推廣，適合基層，適合于突發(fā)事件的大批量現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，適合流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)豬鏈球菌2型的感染診斷起到輔助作用。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101363863SQ20081011272
公開(kāi)日2009年2月11日 申請(qǐng)日期2008年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月26日
發(fā)明者明 劉 申請(qǐng)人:北京莊笛浩禾生物醫(yī)學(xué)科技有限公司