專利名稱::一種檢測(cè)牛免疫球蛋白g的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及一種檢測(cè)牛免疫球蛋白G的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。技術(shù)背景牛初乳是指乳牛產(chǎn)犢后3天內(nèi)所分泌的乳汁,是母牛為了供給牛犢在新生環(huán)境下,可以抗外來(lái)病毒及細(xì)菌而合成的,它富含在體內(nèi)自然合成的天然抗體。牛初乳中除了含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分外,還富含免疫蛋白球(主要為IgG)、生長(zhǎng)因子等活性功能組分,能攻擊侵入人體的致病原,抑制病菌繁殖,是一種能增強(qiáng)人體免疫力、促進(jìn)組織生長(zhǎng)的健康功能性食品。目前多種功能性食品中都添加牛初乳以增強(qiáng)免疫力,但是市面上的產(chǎn)品混雜,很難辨別其中是否含有牛初乳及其中的牛初乳真正含量是多少。因此,一種能夠檢測(cè)保健食品中牛初乳含量的方法顯得特別重要。目前多是通過(guò)檢測(cè)其中的牛免疫球蛋白G(IgG)含量高低來(lái)確定食品中是否含有真正的牛初乳的。國(guó)內(nèi)外主要采用瓊脂雙向或單向免疫擴(kuò)散法,此外還有免疫電泳法、高壓液相色譜法等等。由于上述方法所用技術(shù)難以系統(tǒng)化和標(biāo)準(zhǔn)化、儀器設(shè)備復(fù)雜和操作繁瑣等因素,不適合現(xiàn)場(chǎng)查驗(yàn)和大量樣本篩查。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)牛免疫球蛋白G的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測(cè)牛免疫球蛋白G的酶聯(lián)免疫試劑盒,包括牛免疫球蛋白G的Fc片段和牛免疫球蛋白GFc片段的特異性抗體;所述特異性抗體為所述牛免疫球蛋白GFc片段的多克隆抗體或單克隆抗體。其中,所述牛免疫球蛋白G的Fc片段和牛免疫球蛋白GFc片段的特異性抗體可以以下述任一種形式存在1)所述牛免疫球蛋白G的Fc片段為包被原,所述特異性抗體進(jìn)行酶標(biāo)記后作為酶標(biāo)記物;2)所述特異性抗體為包被原,所述牛免疫球蛋白G的Fc片段進(jìn)行酶標(biāo)記后作為酶標(biāo)記物。所述試劑盒還可以包括抗抗體;所述抗抗體可以為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體;所述牛免疫球蛋白G的Fc片段和抗抗體可以以下述任一種形式存在1)所述牛免疫球蛋白G的Fc片段為包被原,所述抗抗體進(jìn)行酶標(biāo)記后作為酶標(biāo)記物;2)所述抗抗體為包被原,所述牛免疫球蛋白G的Fc片段進(jìn)行酶標(biāo)記后作為酶標(biāo)記物。其中,所述單克隆抗體具體是由保藏號(hào)為CGMCCNo.2436的牛IgG高效單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-1-4分泌產(chǎn)生的抗體。所述牛IgG多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體。所述試劑盒還可包括牛免疫球蛋白G標(biāo)準(zhǔn)品溶液、顯色液、濃縮洗滌液、終止液、濃縮復(fù)溶液;所述終止液為l-2mol/L的硫酸、鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液;所述濃縮洗滌液為含有0.8-1.2%吐溫-20、0.02-0.05%疊氮化鈉防腐劑、pH為6.5-7.4的0.1-0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液;所述濃縮復(fù)溶液為含有0.05-0.2%的牛血清白蛋白和pH值為5.3-6.0、0.05-0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液;所述百分含量為質(zhì)量百分含量。所述酶標(biāo)記中所用的標(biāo)記酶可為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酯酶;當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶時(shí),所述顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成,顯色液A液為過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲,顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺,終止液為l-2mol/L硫酸或鹽酸溶液;當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酯酶時(shí),顯色劑為硝基磷酸鹽緩沖液,終止液為l-2mol/L氫氧化鈉溶液。所述濃縮洗滌液為含有1.0%吐溫-20、0.05%疊氮化鈉防腐劑、pH值為7.4的0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液;所述濃縮復(fù)溶液為含有O.1%牛血清白蛋白、pH值為5.6的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液;所述百分含量為質(zhì)量百分含量。所述抗抗體進(jìn)行酶標(biāo)記的方法是采用過(guò)碘酸鈉法將所述標(biāo)記酶與所述抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到酶標(biāo)抗抗體;所述過(guò)碘酸鈉方法中,所述標(biāo)記酶與所述抗抗體的摩爾濃度比為2:1。酶標(biāo)記牛IgG抗原是將牛IgG的Fc片段與標(biāo)記酶采用戊二醛法或過(guò)碘酸鈉法偶聯(lián)得到的;酶標(biāo)記特異性抗體是將牛IgG特異性抗體與標(biāo)記酶通過(guò)戊二醛法或過(guò)碘酸鈉法偶聯(lián)得到。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)牛免疫球蛋白G的方法本發(fā)明所提供的檢測(cè)牛免疫球蛋白G的方法,包括以下步驟1)樣品前處理將樣品溶于氯化鈉溶液中,混勻得到溶液I;用上述任一種濃縮復(fù)溶液稀釋所述溶液I,取稀釋液進(jìn)行分析;2)利用上述任一酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)l)中所述稀釋液。由保藏號(hào)為CGMCCNo.2436的牛IgG高效單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-1-4分泌產(chǎn)生的牛免疫球蛋白G的單克隆抗體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。保藏號(hào)為CGMCCNo.2436的牛IgG高效單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-1-4也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用了工作液形式,其使用方便,穩(wěn)定性好,成本低廉。利用發(fā)明試劑盒檢測(cè)保健食品中牛免疫球蛋白G(牛IgG)含量的方法,具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度、精確度高、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn),可用于多種樣本的檢測(cè),尤其適合于現(xiàn)場(chǎng)查驗(yàn)及對(duì)大量樣本的篩查。圖1為牛IgG的Fc片段為包被原、酶標(biāo)抗抗體為酶標(biāo)記物的試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖2為純化的牛IgG的Fc片段的電泳圖。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、以牛IgG單價(jià)抗原(牛IgG的Fc片段)為包被原的試劑盒的組成及其制備與應(yīng)用一、以牛IgG單價(jià)抗原為包被原的試劑盒的檢測(cè)原理如下-本發(fā)明的檢測(cè)原理為當(dāng)在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)先包被牛IgG單價(jià)抗原時(shí),加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后,再加入牛IgG特異性抗體溶液。樣本中的牛IgG或牛IgG標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)板上包被的牛IgG競(jìng)爭(zhēng)牛IgG特異性抗體,加入酶標(biāo)記抗抗體進(jìn)行放大作用,用顯色液顯色,樣本吸光值與樣本中牛IgG的含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中牛IgG的含量。同時(shí)也可根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺,通過(guò)與系列濃度牛IgG標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較粗略判斷樣本中牛IgG的濃度范圍。二、以牛IgG單價(jià)抗原為包被原的試劑盒的組成(一)以牛IgG單價(jià)抗原為包被原的試劑盒的一般組成如下(1)包被牛IgG的Fc片段的酶標(biāo)板;(2)酶標(biāo)記物酶標(biāo)抗抗體工作液,用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體,或者堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體均可以;(3)牛IgG特異性抗體工作液可以為牛IgG單克隆抗體工作液或多克隆抗體工作液;抗體稀釋液為含有O.1%牛血清白蛋白、pH值為5.6的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液。(4)牛lgG標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶(Sigma化學(xué)公司,貨號(hào)15506),濃度分別為OPg/L,0.2g/L,0.8g/L,3.2g/L,12.Pg/L,5.12^g/L;(5)底物顯色液當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶時(shí),所述顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成,顯色液A液為過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲,顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺,終止液為l2mol/L硫酸或鹽酸溶液;當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酯酶時(shí),顯色劑為硝基磷酸鹽緩沖液(4-硝基酚磷酸鹽緩沖液),終止液為l2mol/L氫氧化鈉溶液。(6)終止液為l2mol/L硫酸或鹽酸溶液;或l2mol/L氫氧化鈉溶液。(7)濃縮洗滌液為含有0.8-1.2%吐溫-20、0.02-0.05%疊氮化鈉防腐劑、pH為6.5-7.4的0.1-0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液;所述百分含量為質(zhì)量百分含量。(8)濃縮復(fù)溶液為含有O.05-0.2y。的牛血清白蛋白和pH值為5.3-6.0、0.05-0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液;所述百分含量為質(zhì)量百分含量。(二)、以牛lgG單價(jià)抗原(牛IgG的Fc片段)為包被原的試劑盒的具體舉例1、試劑盒的組成如下(1)包被牛IgG單價(jià)抗原(牛IgG的Fc片段)的酶標(biāo)板;(2)酶標(biāo)抗抗體工作液用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體;(3)牛IgG單克隆抗體工作液?jiǎn)慰寺】贵w是由保藏號(hào)為CGMCCNo.2436的牛IgG高效單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-1-4分泌產(chǎn)生??贵w稀釋液為含有O.1%牛血清白蛋白、pH值為5.6的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液。(4)牛IgG標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma化學(xué)公司,貨號(hào)15506)溶液6瓶,濃度分別為OPg/L,0.2g/L,0.8g/L,3,2g/L,12,/L,5.辟g/L;(5)底物顯色液由A液和B液組成,底物顯色液A液為過(guò)氧化脲,底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺;(6)終止液為2mol/L鹽酸;(7)濃縮洗滌液為含有1.0%吐溫-20、0.05%疊氮化鈉防腐劑、pH值為7.4的0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液;所述百分含量為質(zhì)量百分含量。(8)濃縮復(fù)溶液為含有O.1%牛血清白蛋白、pH值為5.6的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液;所述百分含量為質(zhì)量百分含量。三、試劑盒中相關(guān)組分的制備1、包被有包被原牛IgG單價(jià)抗原(牛IgG的Fc片段)的酶標(biāo)板的制備(1)牛免疫球蛋白G(IgG)單價(jià)抗原(牛IgG的Fc片段)的制備a、將木瓜蛋白酶按照2mg/mL的濃度溶解于含有0.05M半胱氨酸、0.OIM、pH值為7.4的PBS溶液中,37。C溫育30min;b、將牛IgG按照5mg/mL的濃度溶于0.OIM、pH值為7.4的PBS溶液中,然后加所配制的木瓜蛋白酶溶液使酶和牛IgG質(zhì)量比為1:20,37"C溫育4h進(jìn)行酶切反應(yīng);c、向步驟(2)的反應(yīng)溶液中加入固體碘乙酰胺,使其最終濃度為0.03M,中止反應(yīng);d、將步驟(3)的混合溶液進(jìn)行4'C透析過(guò)夜,所用的透析溶液為0.2M、pH值為8.0的PBS溶液;e、將透析反應(yīng)液用經(jīng)0.2M、pH值為8.0的PBS溶液平衡過(guò)的蛋白G柱(HiTraprProteinGHP,通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部,貨號(hào)17-0404-01)進(jìn)行層析純化,除去Fab片段,再用100mM、pH值為6.0的檸檬酸鹽洗脫柱子,得到Fc段和未反應(yīng)的牛IgG混合液;f、將混合液用經(jīng)0.02M、pH值為8.0的PBS溶液平衡過(guò)的SEC凝膠過(guò)濾柱(Bio-SilectSEC凝膠過(guò)濾HPLC柱,Bio-Rad公司,貨號(hào)125-0476)(sizeexclusionchromatography)進(jìn)行層析分離,收集分子量為50KDa的Fc片段;g、用1(m的SDS-PAGE鑒定最終產(chǎn)物Fc片段的純度。結(jié)果如圖2所示(泳道1表示Marker,泳道2表示點(diǎn)30)4樣品的結(jié)果,泳道3為點(diǎn)15W樣品的結(jié)果),純化產(chǎn)物的分子量為50Kda,表明純化得到的產(chǎn)物為目的Fc片段。(2)酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液將包被原稀釋成0.050.1ug/mL,每孔加入100uL,37。C溫育2h或4'C過(guò)夜,傾去包被液,用稀釋20倍的濃縮洗滌液洗滌2次,每次30秒,拍8干,然后向每孔中加入150200uL封閉液,37r溫育l2h,傾去孔內(nèi)液體拍干,干燥后用鋁膜真空密封保存。2、牛免疫球蛋白G(IgG)的單克隆抗體的制備a.動(dòng)物免疫以步驟1中制得的牛免疫球蛋白G(IgG)單價(jià)抗原為免疫原。將免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi),免疫劑量為100iig/只,使其產(chǎn)生多克隆抗體。b.細(xì)胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞,按5:1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,得到單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。小鼠血清測(cè)定結(jié)果較高后,取其脾細(xì)胞,按5:1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定細(xì)胞上清液,篩選陽(yáng)性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化,直到得到能穩(wěn)定分泌牛免疫球蛋白G(IgG)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。將該細(xì)胞株命名為牛IgG高效單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-l-4,該細(xì)胞株已于2008年04月03日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC,地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路,中國(guó)科學(xué)院微生物研究所,郵編100101),保藏編號(hào)為CGMCCNo.2436。c.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇將牛IgG高效單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-1-4用凍存液制成1X106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管,立即放入37"C水浴中速融,離心去除凍存液后,移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。d.單克隆抗體的制備與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.4mL/只,7天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞株C-卜45X105個(gè)/只,7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行純化,純化后的腹水放入-2(TC環(huán)境保存。3、多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物,以牛IgG單價(jià)抗原為免疫原,免疫劑量為1.8mg/kg,首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑,頸背部皮下多點(diǎn)注射,間隔34周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化,加強(qiáng)免疫一次,共免疫5次,最后一次不加佐劑。最后一次免疫10天后采血,測(cè)定血清抗體效價(jià),心臟采血,用硫酸銨分級(jí)沉淀得到純化的多克隆抗體。4、抗抗體的制備及酶標(biāo)記(1)、抗抗體制備羊抗鼠抗抗體的制備過(guò)程以山羊作為免疫動(dòng)物,以鼠源抗體為免疫原對(duì)無(wú)病原體山羊進(jìn)行免疫,得到羊抗鼠抗抗體;羊抗兔抗抗體的制備以山羊作為免疫動(dòng)物,以兔源抗體為免疫原對(duì)無(wú)病原體山羊進(jìn)行免疫,得到羊抗兔抗抗體。(2)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗抗體的制備將抗抗體與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)采用改良后的過(guò)碘酸鈉法進(jìn)行偶聯(lián)。傳統(tǒng)的過(guò)碘酸鈉法要求反映體系中酶與抗抗體的摩爾濃度比為4:1;由于辣根過(guò)氧化物酶在強(qiáng)氧化的作用下產(chǎn)生許多與抗抗體結(jié)合的位點(diǎn),這樣活化的辣根過(guò)氧化物酶分子充當(dāng)了連接各分子的橋梁,降低了酶標(biāo)記物的酶活性,使制備的偶聯(lián)物中混有許多聚合體。本發(fā)明利用攻良的過(guò)碘酸鈉法進(jìn)行了抗體的酶標(biāo),其省去了氨基的封閉過(guò)程,因?yàn)槟墚a(chǎn)生自身氨基連接的氨基實(shí)際很少。降低了辣根過(guò)氧化物酶抗抗體的摩爾濃度比率至2:1,改良后的方法比傳統(tǒng)的方法簡(jiǎn)便,對(duì)酶的活性的損失減少。四、以牛IgG單價(jià)抗原為包被原的試劑盒的應(yīng)用1、樣品前處理稱取需檢測(cè)的勻質(zhì)樣本(如牛乳、牛乳粉、牛奶片等含牛免疫球蛋白的保健食品)0.02g溶于20mL5%的(質(zhì)量百分含量)氯化鈉溶液中,用渦旋儀渦動(dòng)2min混勻樣品溶液(樣品的終濃度為lmg/mL);將上述溶液按照l(shuí):19體積比用濃縮復(fù)溶液進(jìn)行稀釋(20(iL樣本溶液+380^iL復(fù)溶液),用渦旋儀渦動(dòng)2min混勻樣品稀釋液,取40pL稀釋液用于分析。2、用試劑盒檢測(cè)向酶標(biāo)板的各孔中加入稀釋20倍的洗滌液,250pL/L,洗滌2min,拍干;再向酶標(biāo)板各孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液40^iL,加入抗體工作液60|iL,輕輕振蕩搖勻,蓋上蓋板膜置37。C避光環(huán)境反應(yīng)10min;小心揭開蓋板膜,直接加入酶標(biāo)抗抗體工作液50pL/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置37。C避光環(huán)境中反應(yīng)30min;取板倒出孔內(nèi)液體,每孔加入150^1稀釋20倍的洗滌液,30s后倒出孔內(nèi)液體,如此重復(fù)操作共洗板4-5次,用吸水紙拍干;每孔加入底物液A液50iiL,再加入底物液B液50pL,輕輕振蕩搖勻,蓋上蓋板膜置37r避光環(huán)境顯色15min;每孔加入終止液50pL,輕輕振蕩搖勻,設(shè)酶標(biāo)儀波長(zhǎng)于450nm處,在5min內(nèi)讀取檢測(cè)數(shù)據(jù),測(cè)定每孔吸光度值(OD值)。3、檢測(cè)結(jié)果分析用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(O標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(BQ)再乘以IOO,得到百分吸光度值。百分吸光度值(%)=-^-xl00%B0公式中B為標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液的平均吸光度值,B。為OPg/L標(biāo)準(zhǔn)品溶液的平均吸光度值。以牛IgG標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/L)值為X軸,百分吸光度值為Y軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(圖l)。用同樣的方法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值,相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度,則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本中牛IgG的量。本發(fā)明中檢測(cè)結(jié)果的分析也可以采用回歸方程法,計(jì)算出樣品溶液濃度。本發(fā)明中檢測(cè)結(jié)果的分析還可以利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件,此法更便于大量樣品的快速分析,整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需l小時(shí)可以完成。五、試劑盒精密度、靈敏度、準(zhǔn)確度和保存期試驗(yàn)(一)標(biāo)準(zhǔn)品精密度試驗(yàn)取步驟二中(二)所述試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn),分別從三個(gè)不同時(shí)間段制備的不同批次(Ol批、02批、03批)的試劑盒中各抽取10個(gè)試劑盒,從每個(gè)試劑盒的酶標(biāo)板中各抽出20個(gè)微孔,測(cè)定3.2[xg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值(OD值),計(jì)算變異系數(shù)。結(jié)果如表1所示,表明每批試劑盒各測(cè)定10次標(biāo)準(zhǔn)品變異系數(shù)均在3.6-16.8%之間,符合精密度小于或等于20%的規(guī)定。表l、標(biāo)準(zhǔn)品可重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(二)樣本精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn):1、樣本精密度試驗(yàn):向不含牛IgG的陰性牛乳粉和陰性牛奶片樣本中添加牛IgG標(biāo)準(zhǔn)品,使牛IgG在樣本中的終濃度為20%(200mg/g),按照步驟四中方法進(jìn)行樣品前處理。取步驟二中(二)所述試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn),分別從三個(gè)不同時(shí)間段制備的不同批次(Ol批、02批、03批)的試劑盒中各抽取3個(gè)試劑盒,進(jìn)行實(shí)驗(yàn),每個(gè)樣本重復(fù)5次,分別計(jì)算變異系數(shù)(CV%)。結(jié)果如表2和表3所示。結(jié)果表明,在牛乳粉樣本可重復(fù)性試驗(yàn)中樣本回收率在82.0%-121.5%,牛奶片樣本可重復(fù)性試驗(yàn)中樣本回收率在81.5%-117.0%。以上樣本中的變異系數(shù)均低于20%。表2、牛lgG含量為20o/。的牛乳粉樣本可重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表3、牛IgG含量為20%的陰性牛奶片樣本可重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2、樣本準(zhǔn)確度試驗(yàn)分別向不含牛IgG的陰性牛乳粉、陰性牛乳和陰性牛奶片樣本中添加牛IgG標(biāo)準(zhǔn)品,使牛IgG在樣本中的終濃度為分別為20。/。(200mg/g)和40%(400mg/g),按照步驟四中方法進(jìn)行樣品前處理。取步驟二中(二)所述試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn),檢測(cè)樣本中牛IgG的濃度,每個(gè)濃度做4個(gè)平行,根據(jù)公式計(jì)算準(zhǔn)確度。結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明,試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度在81.5%-120.0%之間。實(shí)際檢測(cè)值(%)準(zhǔn)確度(%)=-X100%添加樣本濃度(%)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>50%抑制濃度、牛IgG添加實(shí)際測(cè)定值均在正常范圍之內(nèi)??紤]在運(yùn)輸和使用過(guò)程中,會(huì)有非正常保存條件出現(xiàn),將試劑盒在37'C保存的條件下放置6天,進(jìn)行加速老化試驗(yàn),結(jié)果表明該試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求。考慮到試劑盒冷凍情況發(fā)生,將試劑盒放入-2(TC冰箱冷凍5天,測(cè)定結(jié)果也表明試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒在28'C至少可以保存6個(gè)月以上。六、本發(fā)明檢測(cè)方法與高效液相色譜方法比較從市售的含有牛IgG的不同奶粉中,隨即采集10種,分別用《GB/T5009.194-2003保健食品中免疫球蛋白IgG的測(cè)定》方法(HPLC方法)和本發(fā)明提供的ELISA方法檢測(cè)牛IgG含量,結(jié)果如表6所示。表6、各種功能性食品樣本采用不同方法的檢測(cè)結(jié)果樣本編號(hào)12345678910ELISA結(jié)果(%)0.533.728.413.428.115.620.60.627.920.5HPLC結(jié)果(%)0.930.225.914.025.813.218.90.224.822.5結(jié)果表明,與HPLC方法檢測(cè)結(jié)果相比,對(duì)牛IgG含量低于W的樣本的檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差小于O.3%,對(duì)牛IgG含量在13.2-30.2%的樣本的檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.5%,說(shuō)明本發(fā)明完全可以用于功能性食品中牛IgG含量的檢測(cè)。實(shí)施例2、用于檢測(cè)牛免疫球蛋白G的試劑盒還可以有如下幾種一、包被原為特異性抗體,酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗原(一)本試劑盒的工作原理為當(dāng)在微孔條上預(yù)包被牛IgG特異性抗體時(shí),加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后,再加入酶標(biāo)記牛IgG抗原溶液。樣本中的牛IgG或牛IgG標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)包被在酶標(biāo)板上的牛IgG特異性抗體,用顯色液顯色,樣本吸光值與樣本中牛IgG的含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中牛IgG的含量。同時(shí)也可根據(jù)酶標(biāo)板上的顏色深淺,通過(guò)與系列濃度的牛IgG標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較粗略判斷樣本中牛IgG的濃度范圍。(二)本試劑盒的組成為(l)包被有包被原的酶標(biāo)板包被原為單克隆抗體,由保藏號(hào)為CGMCCNo.2436的牛IgG高效單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-l-4分泌產(chǎn)生。(2)酶標(biāo)記物酶標(biāo)抗原工作液,抗原為牛免疫球蛋白G的Fc片段;標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶。(3)牛IgG標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma化學(xué)公司,貨號(hào)15506)溶液6瓶,濃度分別為0^g/L,0.2g/L,0.8g/L,3.2g/L,Cg/L,5.,g/L。(4)底物顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成,顯色液A液為過(guò)氧化氫,顯色液B液為鄰苯二胺。(5)終止液為1-2mol/L硫酸溶液。(6)濃縮洗滌液為含有1.0%吐溫-20、0.05%疊氮化鈉防腐劑、pH值為7.4的0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液;所述百分含量為質(zhì)量百分含量。(7)濃縮復(fù)溶液為含有O.1%牛血清白蛋白、pH值為5.6的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液;所述百分含量為質(zhì)量百分含量。二、包被原為抗原,酶標(biāo)記物為酶標(biāo)特異性抗體'(一)工作原理當(dāng)在微孔條上預(yù)包被牛IgG的Fc片段時(shí),加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后,再加入酶標(biāo)記牛IgG特異性抗體溶液。樣本中的牛IgG或牛IgG標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)板上包被的牛IgG抗原競(jìng)爭(zhēng)牛IgG特異性抗體,用顯色液顯色,樣本吸光值與樣本中牛IgG的含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中牛IgG的含量。同時(shí)也可根據(jù)酶標(biāo)板上的顏色深淺,通過(guò)與系列濃度牛IgG標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較粗略判斷樣本中牛IgG的濃度范圍。(二)本試劑盒的組成(1)包被有包被原的酶標(biāo)板包被原為牛免疫球蛋白G的Fc片段。(2)酶標(biāo)記物酶標(biāo)特異性抗體工作液,堿性磷酸酶標(biāo)記的單克隆抗體;單克隆抗體是由保藏號(hào)為CGMCCNo.2436的牛IgG高效單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-1-4分泌產(chǎn)生。抗體稀釋液為含有O.1%牛血清白蛋白、pH值為5.6的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液。(3)牛IgG標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma化學(xué)公司,貨號(hào)15506)溶液6瓶,濃度分別為OPg/L,0.2g/L,0.8g/L,3.2g/L,12.Pg/L,5.12Pg/L。(4)顯色劑為硝基磷酸鹽緩沖液(4-硝基酚磷酸鹽緩沖液)。(5)終止液為l2mol/L氫氧化鈉溶液。(6)濃縮洗滌液為0.01M,pH7.4,含有0.81.2%吐溫-20和0.05%疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液;所述百分含量為質(zhì)量百分含量。(7)濃縮復(fù)溶液為0.010.05mol/L、含有O.1%牛血清白蛋白、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液;所述百分含量為質(zhì)量百分含量。三、包被原為抗抗體,酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗原(一)工作原理當(dāng)在微孔條上預(yù)包被抗抗體時(shí),加入牛IgG抗體孵育后,加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液,再加入酶標(biāo)記牛IgG抗原溶液。樣本中的牛IgG或牛IgG標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)記牛IgG抗原競(jìng)爭(zhēng)牛IgG特異性抗體,用顯色液顯色,樣本吸光度值與樣本中牛'IgG的含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中牛IgG的含量。同時(shí)也可根據(jù)酶標(biāo)板上的顏色深淺,通過(guò)與系列濃度牛IgG標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較粗略判斷樣本中牛IgG的濃度范圍。(二)試劑盒組成如下(1)包被有包被原的酶標(biāo)板包被原為羊抗鼠抗抗體;(2)酶標(biāo)記物辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的牛IgG的Fc片段;(3)特異性抗體工作液?jiǎn)慰寺】贵w由保藏號(hào)為CGMCCNo.2436的牛IgG高效單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-1-4分泌產(chǎn)生。(4)牛IgG標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma化學(xué)公司,貨號(hào)15506)溶液6瓶,濃度分別為(^g/L,0.2g/L,0.8g/L,3.2g/L,12.Pg/L,5.12Pg/L;(5)底物顯色液所述顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成,顯色液A液為過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲,顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺;(6)濃縮洗滌液為含有1.0%吐溫-20、0.05%疊氮化鈉防腐劑、pH值為7.4的0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液;所述百分含量為質(zhì)量百分含量。(7)濃縮復(fù)溶液為含有0.1%牛血清白蛋白、pH值為5.6的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液;所述百分含量為質(zhì)量百分含量。(8)終止液終止液為12mol/L硫酸或鹽酸溶液。上述三種試劑盒中,抗原(牛免疫球蛋白G的Fc片段)、單抗、多抗、與實(shí)施例1中所述相同;酶標(biāo)板的制備方法與實(shí)施例1中所述相同。酶標(biāo)板在制備過(guò)程中所用的包被緩沖液為pH值為9.4、0.2M的碳酸鹽緩沖液;所用的封閉液為含有0.5%脫脂奶粉、0.01%疊氮化鈉、0.2%蔗糖的0.1M,pH7.4的磷酸鹽溶液;所述百分含量為質(zhì)量百分含量。酶標(biāo)記牛IgG抗原是將牛IgG的Fc片段與標(biāo)記酶釆用戊二醛法或過(guò)碘酸鈉法偶聯(lián)得到的;酶標(biāo)記特異性抗體是將牛IgG特異性抗體與標(biāo)記酶通過(guò)戊二醛法或過(guò)碘酸鈉法偶聯(lián)得到。權(quán)利要求1、一種檢測(cè)牛免疫球蛋白G的酶聯(lián)免疫試劑盒,包括牛免疫球蛋白G的Fc片段和牛免疫球蛋白GFc片段的特異性抗體;所述特異性抗體為所述牛免疫球蛋白GFc片段的多克隆抗體或單克隆抗體。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于所述牛免疫球蛋白G的Fc片段和牛免疫球蛋白GFc片段的特異性抗體以下述任一種形式存在1)所述牛免疫球蛋白G的Fc片段為包被原,所述特異性抗體進(jìn)行酶標(biāo)記后作為酶標(biāo)記物;2)所述特異性抗體為包被原,所述牛免疫球蛋白G的Fc片段進(jìn)行酶標(biāo)記后作為酶標(biāo)記物。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于所述試劑盒還包括抗抗體;所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體;所述牛免疫球蛋白G的Fc片段和抗抗體以下述任一種形式存在1)所述牛免疫球蛋白G的Fc片段為包被原,所述抗抗體進(jìn)行酶標(biāo)記后作為酶標(biāo)記物;2)所述抗抗體為包被原,所述牛免疫球蛋白G的Fc片段進(jìn)行酶標(biāo)記后作為酶標(biāo)記物。4、根據(jù)權(quán)利要求l、2或3所述的試劑盒,其特征在于所述單克隆抗體為由保藏號(hào)為CGMCCNo.2436的牛IgG高效單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-l-4分泌產(chǎn)生的抗體。5、根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的試劑盒,其特征在于所述試劑盒還包括牛免疫球蛋白G標(biāo)準(zhǔn)品溶液、顯色液、濃縮洗滌液、終止液、濃縮復(fù)溶液;所述終止液為1-2mol/L的硫酸、鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液;所述濃縮洗滌液為含有0.8-1.2%吐溫-20、0.02-0.05%疊氮化鈉防腐劑、pH為6.5-7.4的0.1-0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液;所述濃縮復(fù)溶液為含有0.05-0.2。/Q的牛血清白蛋白和pH值為5.3-6.0、0.05-0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液;所述百分含量為質(zhì)量百分含量。6、根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的試劑盒,其特征在于所述酶標(biāo)記中所用的標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酯酶;當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶時(shí),所述顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成,顯色液A液為過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲,顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺,終止液為1-2mol/L硫酸或鹽酸溶液;當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酯酶時(shí),顯色劑為硝基磷酸鹽緩沖液,終止液為l-2mol/L氫氧化鈉溶液。7、根據(jù)權(quán)利要求5或6中任一所述的試劑盒,其特征在于所述終止液為2mol/L鹽酸;所述濃縮洗滌液為含有1.0%吐溫-20、0.05%疊氮化鈉防腐劑、pH值為7.4的O.lmol/L的磷酸鹽緩沖液;所述濃縮復(fù)溶液為含有O.1%牛血清白蛋白、pH值為5.6的O.05mol/L磷酸鹽緩沖液;所述百分含量為質(zhì)量百分含量。8、根據(jù)權(quán)利要求l-7中任一所述的試劑盒,其特征在于所述抗抗體進(jìn)行酶標(biāo)記的方法是采用過(guò)碘酸鈉法將所述標(biāo)記酶與所述抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到酶標(biāo)抗抗體;所述過(guò)碘酸鈉方法中,所述標(biāo)記酶與所述抗抗體的摩爾濃度比為2:1。9、一種檢測(cè)牛免疫球蛋白G的方法,包括以下步驟1)樣品前處理將樣品溶于氯化鈉溶液中,混勻得到溶液I;用權(quán)利要求5-7中任一所述濃縮復(fù)溶液稀釋所述溶液I,取稀釋液進(jìn)行分析;2)利用權(quán)利要求1一8中任一所述的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)1)中所述稀釋液。10、由保藏號(hào)為CGMCCNo.2436的牛IgG高效單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-1-4分泌產(chǎn)生的牛免疫球蛋白G的單克隆抗體,或保藏號(hào)為CGMCCNo.2436的牛IgG高效單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-1-4。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測(cè)牛免疫球蛋白G的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明試劑盒包括牛免疫球蛋白G的Fc片段和牛免疫球蛋白GFc片段的特異性抗體;所述特異性抗體為所述牛免疫球蛋白GFc片段的多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用了工作液形式,其使用方便,穩(wěn)定性好,成本低廉。利用發(fā)明試劑盒檢測(cè)保健食品中牛免疫球蛋白(牛IgG)含量的方法,具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度、精確度高、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn),可用于多種樣本的檢測(cè),尤其適合于現(xiàn)場(chǎng)查驗(yàn)及對(duì)大量樣本的篩查。文檔編號(hào)G01N33/53GK101329339SQ20081011752公開日2008年12月24日申請(qǐng)日期2008年7月31日優(yōu)先權(quán)日2008年7月31日發(fā)明者萬(wàn)宇平,余厚美,馮才偉,李丹寧,鄒志飛,陳文銳,馬孝斌,高東微申請(qǐng)人:鄒志飛;萬(wàn)宇平;高東微;余厚美;陳文銳;馮才偉;李丹寧;馬孝斌