專利名稱：一種試劑盒以及用其檢測atp含量、酶和藥物的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒以及用該試劑盒檢測ATP含量、酶和藥物的方 法，所述的酶是對ATP有水解作用的酶或在生化過程中利用ATP的酶， 所述的藥物是對酶有抑制作用的藥物。
背景技術：
對于生物大分子的4企測受到各國科學家的廣泛關注，因為生物大分子在 人體內的含量與構象是與人類疾病息息相關的。在眾多的帶負電荷的磷酸化 合物中，三磷酸腺苷(ATP)是一種多功能的核苷酸，作為在細胞內的"能 量貨幣"轉移細胞內的化學能用于新陳代謝的各種反應DNA復制、轉錄、 細胞分裂、細胞內生物合成、各種酶促反應等。ATP分子不能儲存，合成后 短時間內即被消耗,很多疾病的發(fā)生與體內ATP的不正常水解有很密切的關 系，比如局部貧血、低血糖癥、帕金森氏綜合癥等。正因為ATP分子在生命 過程中扮演了如此重要的角色，所以，開發(fā)出能夠快捷靈敏檢測出ATP的新 方法越發(fā)受到科學家的關注。
比較經典的檢測ATP的手段是"熒光素酶-熒光素"方法。螢火蟲具有特殊 的發(fā)光物質——蟲熒光素及熒光素酶，熒光素易被氧化，它在熒光素酶催化 下，由ATP激活，使之與氧結合，轉化為氧化熒光素，氧化熒光素發(fā)出與ATP 量成正比的可見光信號?，F在，已經依照此種方法的原理制作出快速檢測試 劑盒，但是，此方法的靈敏度有時達不到要求。
在2007年第129期J. AM. CHEM. SOC雜志的1042-1043頁公開了中科院 上海應用物理所研制出的一種基于電化學生物傳感器沖企測ATP的方法，研究 人員應用aptamer作為ATP分子識別元件他們將ATP apt amer—端修飾在金電 極上，另一端利用化學修飾的手段，標記上二茂鐵。在初始狀態(tài)，ATPaptamer 與其互補鏈形成具有剛性的雙鏈結構，二茂鐵遠離電極表面，電子傳遞過程 無法進行，于是沒有電信號輸出；當ATP存在時，aptamer與ATP分子相互作 用形成三級結構，釋放出它的互補鏈，此時，二茂鐵與電極表面靠近，進行電子傳遞過程，有電信號輸出。即此傳感器是利用aptamer在識別ATP前后其分子構象會發(fā)生顯著變化，利用電化學方法可以沖全測這一構象改變所導致的電子傳遞能力變化，從而可以非常靈敏的檢測ATP分子，并且選擇性也很強。但是此傳感器的檢測過程需要對ATP aptamer進行化學標記，從而使成本變高，操作變復雜。
所以，開發(fā)出高靈敏度、操作簡單、低成本、基于化學傳感器的ATP含量以及磷酸酶的檢測方法對于一些重大疾病的早期臨床診斷和病情監(jiān)測是至關重要的，尤其是在模擬的生理條件下對ATP含量及對ATP有水解作用的酶或在生化過程中利用ATP的酶的檢測。

發(fā)明內容
本發(fā)明一目的是提供一種試劑盒。
本發(fā)明的另一目的是提供利用該試劑盒檢測ATP含量的方法。
本發(fā)明的再一目的是提供利用該試劑盒檢測酶的方法，所述的酶是對ATP有水解作用的酶或在生化過程中利用ATP的酶。
本發(fā)明的再一目的是提供了利用該試劑盒檢測藥物的方法，所述的藥物是對酶有抑制作用的藥物，所述的酶是對ATP有水解作用的酶或在生化過程中利用ATP的酶。
本發(fā)明 一方面提供了 一種試劑盒，該試劑盒包括由噻咯季銨鹽和緩沖液組成的混合溶液以及ATP，所述的緩沖液選自Tris-HCl (三羥曱基氨基氨基曱烷-鹽酸)緩沖液、PBS (磷酸鹽緩沖液)、Tris-EDTA (三羥曱基氨基氨基曱烷-乙二胺四乙酸)緩沖液、Mes (2- (N-嗎啉基)乙磺酸)緩沖液和HEPES (4-羥乙基哌。秦乙磺酸)緩沖液中的一種，所述的噻咯季銨鹽在所述的混合溶液中的濃度為3xl0-5-lxl(r4mol/l。
優(yōu)選地，所述的瘞咯季銨鹽在所述的混合溶液中的濃度為5xlO-5-8xl(T5mol/l。
更優(yōu)選地，所述的嘍咯季銨鹽在所述的混合溶液中的濃度為8xl(T5mo1/1。
在本發(fā)明試劑盒的混合溶液中，噻咯季銨鹽的濃度范圍是3xl0-5-lxl0-4mol/l,在此濃度范圍內的噻咯季銨鹽與待測物中的ATP的結合能力強，檢測時的靈敏度高。以濃度為5xl(r6mol/n々ATP為例，如果試劑盒的混合溶液中的噻咯季銨鹽濃度低于3xl0-Smol/l，噻咯季銨鹽與ATP的結合能力減弱，在370nm紫外光下，焚光強度與僅含有噻咯季銨鹽的空白溶液的熒光強度接近，影響檢測的靈敏度。如果試劑盒的混合溶液中瘞咯季銨鹽濃度高于lxl(y4mol/l,噻咯季銨鹽在溶液中不穩(wěn)定，易于沉淀，使得測試結果不可信。
在本發(fā)明試劑盒的混合溶液中，噻咯季銨鹽的濃度范圍是5xlO-S-8xlO-Smol/l，在此濃度范圍內的噻咯季銨鹽與ATP的結合能力更強，檢測靈敏度更高。以濃度為5xl0-6 mo1/1的ATP為例，如果試劑盒的混合溶液中的噻咯季銨鹽濃度為5xl(T5mol/l，在370nm紫外光下，熒光強度為50;如果試劑盒的混合溶液中p塞咯季銨鹽的濃度為8xl(T5mol/l，在370nrn紫外光下，熒光強度為500。
在本發(fā)明試劑盒的混合溶液中，當噻咯季銨鹽的濃度為8 x 1 (T5 mo1/1時，噻咯季銨鹽與ATP的結合能力最強，檢測靈敏度最高。
優(yōu)選地，所述的p塞咯季銨鹽具有如下式(I)所示分子式
式中X為C1、 Br、 I,取代基R為Crdo的直鏈烷基。
優(yōu)選地，式(I)中X為I，的取代基R為CrCs的直鏈烷基。更優(yōu)選地，式(I)中的取代基R為曱基。
優(yōu)選地，所述的混合溶液中p塞咯季銨鹽和所述的緩沖液的摩爾比為1:100-3500。
更優(yōu)選地，所述的混合溶液中噻咯季銨鹽和所述的Tris-HCl緩沖液的
摩爾比為1: 125。
優(yōu)選地，所述的混合溶液中緩沖液的pH值為5-9。更優(yōu)選地，所述的混合溶液中的緩沖液的pH值為7-9。最優(yōu)選地，所述的混合溶液中的緩沖液的pH值為9。本發(fā)明另一方面提供了利用該試劑盒檢測待測物中ATP含量的方法，該
方法包括以下步驟
U)，a. 將所述試劑盒中的由噻咯季銨鹽和所述緩沖液組成的混合溶液與ATP進行混合，得到ATP濃度在8.0xl(T6mol/l以內的多個濃度的ATP混合溶液，優(yōu)選濃度在1.0xlO-6mol/l-8.0xl(T6mol/l的多個濃度的ATP混合溶液；
b. 測定步驟a得到的多個濃度的ATP混合溶液的熒光強度值，繪制ATP溶液濃度與熒光強度之間的標準關系曲線；
c. 提取待測物中的ATP，將得到的ATP加入到所述試劑盒中的由噻咯季銨鹽和所述緩沖液組成的混合溶液中，測定所得溶液的熒光強度值，根據步驟b中繪制的標準關系曲線獲得待測物中ATP的含量。因為噻咯季銨鹽和所述緩沖液組成的混合溶液不僅能夠4企測ATP,同時對于DNA等其它物質也有熒光顯色的作用，所以為了避免待測物中其它物質的干擾，可以將待測物中的ATP進行提取，再將提取后的ATP進行檢測。
本發(fā)明再一方面還才是供了一種利用該試劑盒4企測酶的方法，所述的酶是對ATP有水解作用的酶或在生化過程中利用ATP的酶，該方法包括以下步驟
a. 將所述試劑盒中的由噻咯季銨鹽和所述緩沖液組成的混合溶液與ATP進行混合；
b. 向步驟a得到的混合溶液中添加待測酶，檢測加入后多個時間的熒光強度值；
c. 如果熒光強度^直隨著時間的推移不斷減少，這表明步驟b中添加的待測酶是對ATP有水解作用的酶或在生化過程中利用ATP的酶。
本發(fā)明再 一 方面還提供了利用該試劑盒檢測藥物的方法，所述的藥物是對酶有抑制作用的藥物，所述的酶是對ATP有水解作用的酶或在生化過程中利用ATP的酶，該方法包括以下步驟
a.將所述試劑盒中的由噻咯季銨鹽和所述緩沖液組成的混合溶液與ATP進行混合；
b. 向步驟a得到混合溶液中同時添加待測藥物和所述的酶，檢測加入后多個時間的熒光強度值；
c. 如果熒光強度值隨著時間的推移不發(fā)生變化，這表明步驟b中添加的待測藥物是對所述酶有抑制作用的藥物。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明利用了帶正電荷的噻咯季銨鹽化合物的有機小分子的聚集誘導熒光的特性，當其與帶負電荷的ATP分子結合之后，利用正負電荷的相互作用和疏水作用使噻咯季銨鹽化合物聚集，進而誘導產生強熒光，在遂咯季銨鹽與本發(fā)明所述緩沖液組成的混合溶液中瘞咯
季銨鹽濃度在3x10-5-1 xl(T4mol/l范圍內，ATP的濃度為0-8 |u M的范圍內，熒光強度與ATP濃度成正比，而且在該比例范圍內的繪制的標準曲線線性關系最優(yōu)，如圖1，此時熒光的激發(fā)波長為370nm，從而構建了檢測ATP含量的試劑盒。正因為如此，本發(fā)明制備的檢測ATP含量的試劑盒簡單，只需要包括噻咯季銨鹽和所述緩沖液組成的混合溶液和ATP固體或ATP溶液即可，并用熒光光譜儀進行熒光測定即可以得到待測物中的ATP含量，當待測物中含有ATP時，在370nm的紫外光照射下呈藍色，并且通過標準關系曲線和熒光強度就可得出待測物中的ATP含量。由于噻咯季銨鹽和所述緩沖液組成的混合溶液與多種物質結合都可以發(fā)出焚光，所以本發(fā)明在檢測ATP舍量時，需要首先提取待測物中的ATP，再檢驗ATP的含量。并且，本發(fā)明所涉及的試劑盒制備方法簡單，成本低廉，并且具有聚集誘導熒光的特性，因此不需要對其進行化學標記，減少了很多化學標記繁瑣的步驟。而且，本發(fā)明試劑盒檢測ATP的靈敏度很高，特異性較強，從圖3可以看出，本發(fā)明的試劑盒可以才企測待測物中ATP的含量，對于待測物中的ADP、 AMP以及焦磷酸鹽反應性差。本發(fā)明的試劑盒靈敏度高,可以達到檢測含有幾十個納摩爾/l濃度級別的ATP。檢測限(LOD)的計算是根據如下方程LOD = 3S0/S ,在此方程中，S。的定義是背離基線的程度，S的定義是靈敏度；參見文獻B. R. Eggins, Chemical Sensors andBiosensors, Wiley, Chichester, England, 2002。
本發(fā)明的試劑盒用于對ATP有水解作用的酶或在生化過程中利用ATP的酶檢驗時，只需將酶的待測物添加到ATP溶液與p塞咯季銨鹽和所述緩沖液組成的混合溶液中，檢測在加入后多個時間熒光強度值，如果熒光強度值隨著時間的增加不斷減少，說明待測酶是對ATP有水解作用的酶或在生化過程中利用ATP的酶。該檢驗方法簡單，只需保證酶的最佳反應溫度就可完成。
本發(fā)明的試劑盒可以應用到藥物篩選，可以通過檢驗ATP含量的變化篩選出對酶有抑制作用的藥物，這種酶是對ATP有水解作用的酶或在生化過程中利用ATP的酶。另外，我們都知道很多疾病的發(fā)生是與體內ATP含量的不正常導致的，所以本試劑盒有望通過ATP含量的變化檢測到疾病發(fā)生。同樣，許多藥物也是針對ATP有水解作用的酶或在生化過程中利用ATP的酶，所以本試劑盒也可以檢測到具有此類性質的藥物。并且本發(fā)明試劑盒具有目前很多檢測手段所不具有的優(yōu)點靈敏度高，操作簡單，紫外燈下肉眼可以看到明顯的熒光，可以進行原位實時監(jiān)控，即直接向試劑盒中的混合溶液中加入酶溶液，不需要再進行取出，稀釋的步驟，直接隨時進行熒光光鐠的測試，在原位進4亍實時跟蹤。


以下，結合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施例，其中
圖1表示ATP的溶液濃度和熒光強度之間的標準關系曲線。
圖2表示向本發(fā)明試劑盒中的混合溶液分別加入ATP、 ADP、 AMP和
焦磷酸鹽(Pyrophosphate)待測物后，得到的這幾種待測物的濃度和熒光強
度之間的關系。
圖3表示向本發(fā)明試劑盒的混合溶液中加入牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)和ATP溶液，隨著加入時間的變化，p塞咯季銨鹽化合物發(fā)出的熒光強度的變化。
圖4表示向本發(fā)明試劑盒的混合溶液中同時加入牛小腸石咸性磷酸酶(CIAP)、鴒酸鈉藥物和ATP溶液后，隨著加入時間的變化，p塞咯季銨鹽化合物發(fā)出的熒光強度的變化。
具體實施例方式
實施例1
瘞咯季銨鹽化合物的制備
1. l-曱基-l- (3-氨基)丙基-2, 3， 4, 5-四苯基硅雜環(huán)戊二烯的制備將曱基氳噻咯(l.Og， 2.5mmo1 )、烯丙胺(0.36ml， 5.0mmo1 )、H2PtCl6.xH20(2.5mg， 5jumo1)和蒸餾得到的曱苯(10ml)置于Ar氣體環(huán)境中，回流20小時。將得到的溶液冷卻，通過燒結玻璃濾器，蒸發(fā)干燥。得到的產品溶解在乙醚中，并且用己烷沉淀過濾。收集得到的黃色粉末沉淀物，共l.l克，收率90%。經核磁檢驗，所得的產物是l-曱基-l- (3-氨基)丙基-2, 3， 4，5國四苯基硅雜環(huán)戊二烯。l-曱基-l- (3-氨基)丙基-2， 3, 4, 5-四苯基硅雜環(huán)戊二烯的制備方法參見JACS 2005年第127巻，題目為"Luminescent SiloleNanoparticles as Chemoselective Sensors for Cr(VI)(熒光p塞p各納米4立子作為^f匕學感應器用于Cr(VI)離子的4企測)"2.瘞咯季銨鹽化合物的制備
在干燥氮氣保護下，將l-曱基-l- (3-氨基)丙基-2， 3， 4, 5-四苯基硅雜環(huán)戊二烯((K25g， 0.54mmo1)溶解于曱醇溶劑中，向溶液中加入無水碳酸鉀(0.75g, 5.4mmo1)和碘曱烷(5mL， 80mmo1)，反應混合物在惰性氣體下回流6小時，去除溶劑，將去除溶劑后的反應液體用硅膠柱分離，硅膠柱的洗脫劑為二氯曱烷和曱醇，二氯曱烷和曱醇的體積比15: 1，洗脫后得到260mg黃色固體，此黃色固體熔點230°C。
對該黃色的固體進4亍核》茲分析，核,茲氫i普顯示1H NMR (400 MHz，DMSO-d6) S = 6.81-7.16 (m， 20H, Ph), 3.21 (m， 2H), 2.93 (s, 9H)， 1.64 (m, 2H),0.93 (m， 2H), 0.50 (s, 3H);核磁碳謙顯示13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) S =154.7， 139.9, 139.1， 138.2, 129.4, 128.4， 128.2, 127.5, 126.4, 125.8, 67.3， 52.1,16.7, 9.1,-6.0; C35H3sSiNT分子量為500.2768;高分辨率質譜測的分子量為500.2786。該落咯季銨鹽的分子式如下
的制備方法詳見2008年的Analytical Chemistry雜志。
實施例2試劑盒的制備
將實施例1得到的噻咯季銨鹽化合物和pH值為9的Tris-HCl緩沖液進行混合，該噻咯季銨鹽在混合溶液中的濃度為8xlO-5mol/l,噻咯季銨鹽化合物和Tris-HCl緩沖液的摩爾比為1: 125。將ATP標準品配制成濃度為lxlCT3mol/l的ATP溶液，ATP標準品的購自Sigma公司，商品號為51963-61-2。
實施例3試劑盒的制備
該試劑盒的制備方法與實施例2的試劑盒的制備方法相同，不同的是
，式中R為曱基，該噻咯季銨鹽化合物將噻咯季銨鹽化合物和pH值為5的Mes緩沖液進行混合，該蓉咯季銨鹽化 合物在混合溶液中的濃度為lxl(T4mol/l,瘞咯季銨鹽化合物和Mes緩沖液 的摩爾比為1: 3500,在該試劑盒中還包括ATP固體標準品。
實施例4 試劑盒的制備
該試劑盒的制備方法與實施例2的試劑盒的制備方法相同，不同的是 將噻咯季銨鹽化合物和pH值為8的磷酸鹽緩沖液進行混合，該p塞咯季銨鹽 化合物在混合溶液中的濃度為3xl(T5mol/l,瘞咯季銨鹽化合物與和磷酸鹽緩 沖液的摩爾比為3: 1000，在該試劑盒中還包括ATP固體標準品。
實施例5 試劑盒的制備
該試劑盒的制備方法與實施例4的試劑盒的制備方法相同，不同的是， 該遙咯季銨鹽化合物和pH值為7的HEPES緩沖液進行混合，該噻咯季銨鹽 在混合溶液中的濃度為5xl(T5mol/l,瘞咯季銨鹽化合物與磷酸鹽緩沖液的 摩爾比為5: 1000 ,在該試劑盒中還包括ATP固體標準品。
實施例6
繪制ATP濃度和熒光強度之間的標準關系曲線
將實施例2中的ATP溶液加入到由p塞咯季銨鹽化合物和pH值為9的 Tris-HCl緩沖液組成的混合溶液中混合，混合后的溶液共lml。并調節(jié)混合 溶液中的ATP濃度分別為1.0xl(T6mol/l 、 2xl(T6mol/l、 3xl(T6mol/l、 4xl(r6mol/l、 5xl(T6mol/l、 6xl()-6mol/l和7xl()-6mol/l這幾種濃度，并且在以 上幾種濃度中的噻咯季銨鹽的濃度均為8xl0_5 mol/l。將該混合溶液進行熒 光光鐠測定，繪制ATP溶液濃度和焚光強度之間的標準關系曲線，見圖1， 在每次檢測待測物中ATP含量時，都需要繪制ATP溶液濃度和熒光強度 之間的標準關系曲線，消除檢測設備帶來的系統誤差。
實施例7
利用實施例2提供的試劑盒，檢測含有ATP待測物。 培養(yǎng)動物細胞或孩t生物樣品ATP的提取方法如下首先配制裂解液，該裂解液含有PH值為8.0的l。/。聚乙二醇辛基苯基醚TritonX-100(5ml)， 0.1%去 氧膽酸鈉(5ml), 100mM氯化鈉(2.93g)， 0.1%疊氮化鈉(1.5ml)和10mM 二硫蘇糖醇(770mg)。去除培養(yǎng)得到的紅細胞中的細胞培養(yǎng)液，再向培養(yǎng)板 上加入足量的磷酸鹽緩沖液，洗滌細胞，傾去洗滌液。再向培養(yǎng)板上加入足 量的細胞裂解液，培養(yǎng)板可在微型振蕩器上震蕩5-10min，用刮刀刮下培養(yǎng) 板上的細胞，將細胞懸液移入1.5ml離心管，在漩渦振蕩器上充分混懸震蕩 30秒。得到含有提取的ATP的裂解細胞懸液。
在實施例2中的p塞咯季銨鹽化合物和pH值為9的Tris-HCl i爰沖液配制 的混合溶液中加入含有提取的ATP的裂解細胞懸液，如圖3表示進行熒光光 譜測定其熒光強度值。根據圖1中的ATP溶液濃度和熒光強度之間的標準關 系曲線，得出該待測物紅細胞中的ATP含量為1.8jnmo1/1。
再向含有提取的ATP的裂解細胞懸液、瘞咯季銨鹽化合物和Tris-HCl 緩沖液組成的混合溶液中加入牛小腸堿性磷酸酶，本實施例依次在加入牛小 腸堿性磷酸酶后，每隔1分鐘進行一次熒光強度的測定，記錄p塞咯季銨鹽化 合物發(fā)出的熒光強度的變化。
從圖3可以看出，在以牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)為待測酶時，當沒有 加入牛小腸堿性磷酸酶時，ATP濃度很大，瘞咯季銨鹽化合物分子發(fā)出強烈 焚光，即使隨著時間的變化，熒光強度也沒有變化；當加入牛小腸堿性磷酸 酶時，隨著ATP水解酶加入時間不斷增加，ATP被水解，熒光強度漸漸降 低，直到12分鐘后ATP水解完成，噻咯季銨鹽化合物的熒光強度恢復到未 聚集的水平，見圖3。通過以上實驗，可以看出牛小腸堿性磷酸酶對ATP有 水解作用。
實施例8
向實施例4中試劑盒的由噻咯季銨鹽和磷酸鹽組成的混合溶液中添加含 有含有提取的ATP的裂解細胞懸液，接著再加入血清堿性磷酸酶，本實施例 依次在加入血清堿性磷酸酶后，每隔1分鐘進行一次焚光強度的測定，結果 表明，隨著加入時間的增加，熒光強度值不斷變小，20分鐘后，熒光強度值 恢復為僅含有噻咯季銨鹽的空白溶液的熒光強度值。
實施例9
向實施例3中的試劑盒由瘞咯季銨鹽化合物和磷酸鹽緩沖液組成的混合溶液中添加含有提取的ATP的裂解細胞懸液、接著再加入酸性磷酸酶，本實
施例依次在加入酸性磷酸酶后，每隔1分鐘進行一次熒光強度的測定，結果
表明，隨著加入時間的增加，熒光強度不斷變小，20分鐘后，熒光強度值恢 復為僅含有噻咯季銨鹽的空白溶液的熒光強度值。
實施例10
鎢酸鈉是對CIAP有抑制作用的小分子，如果待測藥物是鵠酸鈉，CIAP 水解ATP的能力被限制，從熒光光譜上可以看出隨著加入CLAP時間的增 長，熒光強度沒有變化，因此也反應不出ATP量的變化，但是如果待測藥 物不是對CIAP有抑制作用的藥物，從熒光光i普上可以看出隨著加入CLAP 時間的增長，熒光強度不斷減小，CIAP水解ATP的能力沒有被限制，從 熒光光謙上反應出熒光強度不斷減小，因此ATP的量也不斷減小，見圖4。
權利要求
1.一種試劑盒，該試劑盒包括由噻咯季銨鹽和緩沖液組成的混合溶液以及ATP，所述的緩沖液選自Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris-EDTA緩沖液、Mes緩沖液和HEPES緩沖液中的一種，所述的噻咯季銨鹽在所述的混合溶液中的濃度為3×10-5-1×10-4mol/l，優(yōu)選地，所述的噻咯季銨鹽在所述的混合溶液中的濃度為5×10-5-8×10-5mol/l，更優(yōu)選地，所述的噻咯季銨鹽在所述的混合溶液中的濃度為8×10-5mol/l。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其中所述的瘞咯季銨鹽具有如下式 U)所示分子式<formula>formula see original document page 2</formula>式中X為C1、 Br、 I,取代基R為d-do的直鏈烷基。
3. 根據權利要求1或2所述的試劑盒，其中式U)中X為I，取代基R 為d-C5的直鏈烷基。
4. 根據權利要求1-3中任一項所述的試劑盒，其中式(I)中的取代基 R為曱基。
5. 根據權利要求1-4中任一項所述的試劑盒，其中所述的混合溶液中噻 咯季銨鹽和所述的緩沖液的摩爾比為1: 100-3500,優(yōu)選地，所述的混合溶 液中的噻咯季銨鹽和所述的Tris-HCl緩沖液的摩爾比為1: 125。
6. 根據權利要求1-5中任一項所述的試劑盒，其中所述的混合溶液中緩 沖液的pH值為5-9，優(yōu)選7-9。
7. 根據權利要求1-6中任一項所述的試劑盒，其中所述的混合溶液中緩 沖液的pH值為9。
8. —種利用權利要求1-7中任一項所述的試劑盒檢測待測物中ATP 含量的方法，該方法包括以下步驟(1)，a. 將所述試劑盒中的由噻咯季銨鹽和所述緩沖液組成的混合溶液與 ATP進行混合，得到ATP濃度在8.0xl(T6mol/l以內的多個濃度的ATP混合 溶液；b. 測定步驟a得到的多個濃度的ATP混合溶液的焚光強度值，繪制 ATP溶液濃度與熒光強度之間的標準關系曲線；c. 提取待測物中的ATP，將得到的ATP加入到所述試劑盒中的由p塞 咯季銨鹽和所述緩沖液組成的混合溶液中，測定所得溶液的焚光強度值， 根據步驟b中繪制的標準關系曲線獲得待測物中ATP的含量。
9. 一種利用權利要求1-7中任一項所述的試劑盒檢測酶的方法，所述 的酶是對ATP有水解作用的酶或在生化過程中利用ATP的酶，該方法包 括以下步驟a. 將所述試劑盒中的由噻咯季銨鹽和所述緩沖液組成的混合溶液與 ATP進行混合；b. 向步驟a得到的混合溶液中添加待測酶，檢測加入后多個時間的熒 光強度值；c. 如果熒光強度值隨著時間的推移不斷減少，這表明步驟b中添加的 待測酶是對ATP有水解作用的酶或在生化過程中利用ATP的酶。
10. —種利用權利要求1-7中任一項試劑盒檢測藥物的方法，所述的藥 物是對酶有抑制作用的藥物，所述的酶是對ATP有水解作用的酶或在生化 過程中利用ATP的酶，該方法包括以下步驟a. 將所述試劑盒中的由噻咯季銨鹽和所述緩沖液組成的混合溶液與 ATP進行混合；b. 向步驟a得到的混合溶液中同時添加待測藥物和所述的酶，檢測加 入后多個時間的熒光強度值；c. 如果熒光強度值隨著時間的推移不發(fā)生變化，這表明步驟b中添 加的待測藥物是對所述酶有抑制作用的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種試劑盒，該試劑盒包括由噻咯季銨鹽和緩沖液組成的混合溶液以及ATP，所述的緩沖液選自Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris-EDTA緩沖液、Mes緩沖液和HEPES緩沖液中的一種，所述的噻咯季銨鹽在所述的混合溶液中的濃度為3×10^-5-1×10^-4mol/l。本發(fā)明還提供了一種利用該試劑盒檢測ATP含量的方法，本發(fā)明再提供了一種利用該試劑盒檢測對ATP有水解作用的酶或在生化過程中利用ATP酶的方法以及利用該試劑盒檢測藥物的方法。本發(fā)明的試劑盒制備方法簡單，成本低廉，靈敏度很高，特異性較強。
文檔編號G01N21/76GK101644679SQ20081011777
公開日2010年2月10日 申請日期2008年8月5日 優(yōu)先權日2008年8月5日
發(fā)明者劉冬生, 張德清, 銘 汪, 趙曼淳 申請人:國家納米科學中心