專利名稱：一類分子檢測(cè)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子檢測(cè)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一類分子檢測(cè)系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
生物分子和其他待檢物可以通過(guò)能與其反應(yīng)的選擇性或特異性探針?biāo)鶛z測(cè)，已經(jīng) 有基于生物傳感器陣列技術(shù)原理，將探針點(diǎn)排列在基質(zhì)或芯片上的策略，以實(shí)施上述 檢測(cè)，例如M. Schena和R. W. Davis在DNA Microarrays: A Practical Approach (M. Schena ed., Oxford University Press 1999)—書(shū)中闡述了多種策略，陣列用于檢 測(cè)和發(fā)現(xiàn)基因序列，以選擇和測(cè)試候選藥物分子、研究毒理和藥理反應(yīng)以及其他用途。 靶點(diǎn)可以通過(guò)多種相互作用方式與探針結(jié)合，包括核酸堿基配對(duì)或雜交、蛋白與蛋白 的相互作用、蛋白與配基的相互作用、酶和底物的相互作用、受體與配基的相互作用 和其他化學(xué)反應(yīng)。
生物傳感器允許同時(shí)檢測(cè)大量的生物分子間的反應(yīng)，如用微陣列檢測(cè)蛋白或者核 酸，這種技術(shù)成為利用來(lái)自于人類基因組計(jì)劃和其他物種基因組測(cè)序的大量序列的有 力工具。
來(lái)自于待檢物的信號(hào)通常很小，同時(shí)因?yàn)楦鞣N來(lái)源的背景造成此類檢測(cè)方法信噪 比相對(duì)較低，低信號(hào)導(dǎo)致低信噪比和待檢物難以檢出。 一種解決方法是加強(qiáng)待檢物的 信號(hào)以提高其固有的檢測(cè)信噪比，提高信噪比有利于降低對(duì)待檢物的檢測(cè)局限，使檢 到更低濃度待檢物和開(kāi)拓新的分子檢測(cè)應(yīng)用成為可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一為提供一類分子檢測(cè)系統(tǒng)，其包括
a)化學(xué)或生物分子；b)聚合物； C)交聯(lián)分子；以及 d)圖像傳感器，
其中，所述聚合物與所述光電傳感器共價(jià)連接，所述化學(xué)或生物分子與所 述聚合物橫向連接，所述聚合物通過(guò)交聯(lián)分子在分子內(nèi)、分子間共價(jià)和/或非共 價(jià)連接。
優(yōu)選地，所述圖像傳感器為CMOS圖像傳感器。
優(yōu)選地，在所述光電傳感器之上設(shè)有透明薄層支持物，所述聚合物布于透明薄 層支持物。
本發(fā)明的目的之一是提供一種使用傳感器檢測(cè)待測(cè)物用的共聯(lián)聚合物。
根據(jù)本發(fā)明的共聯(lián)聚合物包括a)化學(xué)或生物分子；b)聚合物，以及C)交 聯(lián)分子，所述化學(xué)或生物分子與所述聚合物橫向連接，所述聚合物通過(guò)交聯(lián)分 子在分子內(nèi)、分子間共價(jià)和/或非共價(jià)連接，其中所述聚合物為天然或合成的聚合
物，優(yōu)選地，所述天然聚合物為可以線性或支鏈的多聚糖、分支DNA或水凝膠，
所述線性多聚糖為右旋糖酐，所述支鏈多聚糖為支鏈淀粉糖酐，所述合成聚合物 為甲基乙烯基醚/馬來(lái)酸酐共聚物。
本發(fā)明的共聯(lián)聚合物中所包含的聚合物可以是固體、膠體和非定型等狀態(tài)，片狀、 珠狀、盤(pán)狀或以上的混合形式，也可以由線狀、枝狀、側(cè)鏈枝狀、梳狀、星狀或者樹(shù) 枝狀等同種或異種組成，多聚物分枝包括長(zhǎng)枝和短枝，是由化學(xué)合成或者從天然物質(zhì) 中提取出來(lái)而獲得的。例如此類多聚物包括碳水化合物、糖類、同多糖、雜多糖、瓊 脂糖、直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原、葡聚糖、纖維素、幾丁質(zhì)、脫乙酰幾丁質(zhì)、肽聚 糖和粘多糖等，具體的說(shuō)如高度分枝的葡聚糖、水合葡聚糖或瓊脂糖，就像水凝膠和聚丙烯酰胺凝膠，此類用于構(gòu)成共聯(lián)物的多聚物也包括寡核苷酸、多肽、肽核酸、蛋 白聚糖、糖蛋白、糖脂，甚至還包括抗體或抗體的片段。
用于構(gòu)成共聯(lián)物的多聚物還包括含有二醇基團(tuán)的多聚物，如含有g(shù)am-diol和鄰 二醇基團(tuán)的多聚物，也包括含有臨近的羥基和酯基的多聚物，如RNA內(nèi)的磷酸二酯鍵。
此類共聯(lián)物還包括含有多個(gè)羥基的多聚物，本發(fā)明的描述包括以上多種多聚物的 各種組合。
合成的多聚物可以用于共聯(lián)聚合物的骨架，如聚(甲基乙烯基醚共聚馬來(lái)酐)，
共聯(lián)探針，又如甲醛與(氯甲基)環(huán)氧乙烷和2-甲基苯酚的聚合物，其重復(fù)單體為
基，然后被Nal04氧化成醛基，氧化后的多聚物就可以通過(guò)還原氨基化連接帶有一位 氨基的分子。
本發(fā)明的共聯(lián)聚合物(Meshed Polymer)是一種多聚衍生物，由一種或幾種化 學(xué)或生物分子交聯(lián)在這一多聚骨架上形成。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的共聯(lián)聚合物中交聯(lián)的化學(xué)或生物分子是捕獲分子，能選擇性地、 特異地結(jié)合到靶分子時(shí)，所述共聯(lián)聚合物為共聯(lián)探針(Mesh Probe)。
另一方面，所述化學(xué)或生物分子可以是捕獲分子，具有識(shí)別和產(chǎn)生信號(hào)的功能， 可以是化學(xué)或自然的生物分子，交聯(lián)在多聚骨架上，因此以物理方式緊密聯(lián)結(jié)，識(shí)別 分子可特異地、選擇性地結(jié)合"分子標(biāo)簽"(tag),這一標(biāo)簽常與靶分子相聯(lián)；信號(hào) 分子的功能是產(chǎn)生信號(hào)，用以檢測(cè)，可以是直接或間接產(chǎn)生信號(hào)，如熒光或化學(xué)發(fā) 光，從而此時(shí)本發(fā)明的共聯(lián)聚合物為共聯(lián)報(bào)告物(Mesh Reporter)。
，其帶有的酐基易于和蛋白或衍生寡核苷酸帶有的氨基形成
其帶有的環(huán)氧基在堿性pH下首先開(kāi)環(huán)形成鄰二醇交連分子是交聯(lián)劑介導(dǎo)多聚骨架分子內(nèi)或分子間的聯(lián)結(jié)。它們通常是雙功能的 交聯(lián)劑，其功能基團(tuán)只對(duì)多聚骨架或被引入的衍生基團(tuán)起反應(yīng)，當(dāng)然也有例外，如 在一端具有反應(yīng)基團(tuán)的G-豐富的寡核苷酸，此端可交聯(lián)在多聚骨架上，寡核苷酸內(nèi)由 此產(chǎn)生的Hoogsteeri堿基配對(duì)，使其在多聚物內(nèi)或多聚物之間形成非共價(jià)的交聯(lián)。
本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述共聯(lián)聚合物的方法，該方法包括以下步
驟
1) 用高碘酸鈉氧化多糖，形成含有大量的醛基團(tuán)的直鏈或分支多聚物；
2) 添加具有氨基反應(yīng)基的化學(xué)或者生物分子；
3) 與NaCNBrBH3同步還原結(jié)合完成耦合反應(yīng)。
本發(fā)明的共聯(lián)聚合物是通過(guò)把多聚物和化學(xué)或生物分子耦聯(lián)制備而成，很多時(shí)候 這種耦聯(lián)依靠于化學(xué)或生物分子上的功能或反應(yīng)基團(tuán)，例如醛基、羥基、胺基、氨基、 羧基、巰基以及以上的組合。
當(dāng)化學(xué)或生物分子與多聚物耦聯(lián)或反應(yīng)來(lái)制備共聯(lián)聚合物時(shí)，多聚物可以通過(guò)多 個(gè)位點(diǎn)的反應(yīng)基團(tuán)直接或通過(guò)連接體間接的結(jié)合化學(xué)或生物分子的功能或反應(yīng)基團(tuán)， 這種反應(yīng)基團(tuán)包括醛基、羥基、胺基、氨基、羧基、巰基、硫氰酸基、N—羥基琥珀 酰亞胺酯基、酮基、乙二醛基、環(huán)氧基、環(huán)氧乙烷基、酰亞胺酯基、碳二亞胺基、垸 磷酸基、酐基、馬來(lái)酰亞胺基、氮雜環(huán)丙烷、丙烯酰基、氟苯基、重氮乙酰基、N-羧 酰咪唑基、琥珀酰亞胺基碳酸酯基、羧甲基、異氰酸基、酰肼基以及以上的組合。
多聚物可以帶有一個(gè)氨基反應(yīng)基團(tuán)，如脫乙酰幾丁質(zhì)帶有的氨基，也可以帶有硫 酸基、羧基和磷酸基等功能反應(yīng)基團(tuán)，如硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸肝素、硫酸 角質(zhì)素帶有的硫酸基，和從多糖衍生出的唾液酸、醛糖酸、糖醛酸、氧代醛糖酸、抗 壞血酸帶有的羧基。帶有磷酸基的多聚物如DNA和RNA，這類多聚物可以通過(guò)具有不同功能的連接物 與化學(xué)或生物分子連接，如一個(gè)多聚核苷酸和另一個(gè)多聚核苷酸形成的共聯(lián)探針，或 一個(gè)RNA被氧化提供出醛基以與化學(xué)或生物分子形成共聯(lián)物。
多種化學(xué)或生物分子可以與多聚物連接形成能結(jié)合多種靶物質(zhì)的共聯(lián)探針，換句 話說(shuō)就是一個(gè)多聚物鏈可以連接多種化學(xué)或生物分子而形成一個(gè)共聯(lián)探針，這種混合 共聯(lián)探針也是本發(fā)明的一種應(yīng)用。
例如，為連接多聚物和化學(xué)或生物分子的氨基使用二硫代二 (丙酸琥珀酰亞胺 酯)、酒石酸二琥珀酰亞胺酯或戊二酸二琥珀酰亞胺酯，為連接化學(xué)或生物分子的巰 基和多聚物的氨基使用N-琥珀酰亞胺3- (2-吡啶基二硫代)丙酸酯或N-羥基琥珀酰 亞胺-M-馬來(lái)酰亞胺基苯甲酸酯，為連接化學(xué)或生物分子的巰基和多聚物的醛基使用 4- (N-馬來(lái)酰亞胺基甲酯)環(huán)己烷-l-羧基-酰肼或3- (2-嘧啶二硫)丙酰肼，為連接 化學(xué)或生物分子的巰基和多聚物的羧基使用4- (p-疊氮水楊酰胺)丁胺。
化學(xué)或生物分子和多聚物的氨基也可以用異種交聯(lián)物連接，如N-5-疊氮基-2-氧 琥珀酰亞胺硝基芐酯或N-羥基硫代琥珀酰亞胺-4-疊氮苯甲酸。
有時(shí)候多聚物帶有的羥基可以與羰基化試劑反應(yīng)，如N， N'-羰基二咪唑，變成 中間體氨基甲酸二氮雜茂酯，然后可以與N-親核試劑如胺、帶氨基的如多肽和蛋白， 而形成N-氨基甲酸烷酯連接物。
帶有羥基的多聚物還可以與N， N' -二琥珀酰亞胺基碳酸酯反應(yīng)，然后和一個(gè)帶 氨基的如一個(gè)寡核苷酸上的一個(gè)氨基反應(yīng)，這個(gè)氨基可以是在寡核苷酸一端的，也可 以是接近末端的。這種多聚物還可以與3-馬來(lái)酰亞胺基丙酸反應(yīng)，然后與寡核苷酸上 的氨基反應(yīng)。這種多聚物還可以與化學(xué)或生物分子的末端鹵化烷基團(tuán)反應(yīng)通過(guò)醚基構(gòu) 成共聯(lián)聚合物。
當(dāng)多聚物在相鄰碳原子上帶有羥基如多糖或糖蛋白，可以與高碘酸鈉反應(yīng)產(chǎn)生醛
基官能團(tuán)，從而與帶有氨基的化學(xué)或生物分子形成Schiff' s鍵構(gòu)成共聯(lián)探針，
8Schiff' s鍵通過(guò)如硼氫化鈉或硼氫化氰鈉等還原劑產(chǎn)生在多聚物和化學(xué)或生物分子 之間的仲胺或叔胺連接。
共聯(lián)聚合物可以通過(guò)光反應(yīng)交聯(lián)，如多聚物和化學(xué)或生物分子的氨基即可通過(guò)光 反應(yīng)交聯(lián)，從而形成一個(gè)連接基團(tuán)，例如多聚物的氨基連接于1羥基琥珀酰亞胺-4-疊氮水楊酸，然后化學(xué)或生物分子的氨基通過(guò)光分解與其形成共聯(lián)。
又如，化學(xué)或生物分子的巰基能與1- (p-疊氮水楊酰胺)-4-(碘代乙酰胺)丁 胺連接，然后多聚物的氨基通過(guò)光分解與其形成共聯(lián)。
又如，多聚物的醛基能與P-疊氮苯甲酰肼連接，然后化學(xué)或生物分子的氨基通過(guò) 光分解與其形成共聯(lián)。
為了實(shí)際應(yīng)用，有必要甚至可能是必須引入一些多聚物本身分子間和分子內(nèi)的物 理連接，由于大小的原因共聯(lián)聚合物本身可能受到移液管或攪拌器等產(chǎn)生的機(jī)械剪切 力而被破壞骨架結(jié)構(gòu)，對(duì)應(yīng)線狀骨架結(jié)構(gòu)的多聚物這種破壞尤其顯著，通過(guò)給多聚物 骨架引入物理連接(包括分子內(nèi)連接)可以減輕這一問(wèn)題。實(shí)際上物理連接可以是共 價(jià)的也可以是非共價(jià)的，同種雙功能交聯(lián)例子如4， 7， 10-三惡-l， 13-十三垸二胺 可以產(chǎn)生共價(jià)連接.另一例類似的互連分子是常用的乙?；?。其他強(qiáng)的分子相互 作用可以產(chǎn)生非共價(jià)連接，如鳥(niǎo)嘌呤之間的Hoogsteen堿基對(duì)導(dǎo)致4條鏈狀的DNA 形成?；诙嗑畚镞@種特性，其在水溶液中形成相當(dāng)緊密的隨機(jī)線團(tuán)，其骨架連接更 主要體現(xiàn)于分子間而非分子內(nèi)。但在碳水化合物參與的許多情況下，分子力如氫鍵 (分子間和分子內(nèi))能幫助穩(wěn)定基片的探針連接。
本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測(cè)分析物用的具有圖像傳感器的陣列，該陣列包 括上述的共聯(lián)探針。所述圖像傳感器可以是CMOS圖像傳感器。所述共聯(lián)探針布于所 述圖像傳感器表面上，或者布于與所述圖像傳感器相鄰的基底上。
本發(fā)明的另一種體現(xiàn)是共聯(lián)探針交聯(lián)點(diǎn)樣于很薄而且透明的支持物上，這一基質(zhì)
可以是多孔的滲水物質(zhì)也可以是致密的固體。如透明的蓋玻片。這一透明的支持物可以與數(shù)字化傳感器直接接觸的或固定在其表面，固定可以通過(guò)機(jī)械原理或透明粘合 實(shí)現(xiàn)，這種薄的支持物易碎，不大可能用于芯片技術(shù)為基礎(chǔ)的實(shí)際應(yīng)用，然而，這種 潛在的超薄易碎特性可以被緊貼在數(shù)字化傳感器表面而得以改善，在這一設(shè)計(jì)中，用 新的置換用過(guò)的透明支持物。實(shí)際應(yīng)用中，這一設(shè)計(jì)非常有益，數(shù)字化傳感器并非耗 材的一部分可重復(fù)使用，因此，此發(fā)明中利用超薄透明的支持物是很關(guān)鍵的。光感應(yīng) 點(diǎn)(pixels)和光源(共聯(lián)探針)之間的距離增加或采用厚一些的物體，會(huì)降低這一 系統(tǒng)的功能，因?yàn)?，被光感?yīng)點(diǎn)(pixels)收集的光信號(hào)與它們之間距離的立方成反 比。常規(guī)的玻片由于太厚，而被排斥在此應(yīng)用之列。
通常陣列中的探針用于捕獲和結(jié)合待檢物質(zhì)，探針?biāo)东@的或者與其一部分結(jié)合 的靶點(diǎn)包括有核酸、多聚核苷酸、蛋白、肽核酸、小分子以及很大范圍內(nèi)的生物分子， 靶點(diǎn)部分結(jié)合探針包括抗體等。例如，鏈酶親和素可以用來(lái)檢測(cè)帶有生物素標(biāo)記的分 子。
從一方面看，本發(fā)明通過(guò)合成可以增加捕獲待檢物數(shù)量的共聯(lián)探針而提高陣列中 的每個(gè)點(diǎn)檢測(cè)待檢物的數(shù)量。這類共聯(lián)探針包括如多糖共聯(lián)物，此類可以用于放大微 陣列中的點(diǎn)攜帶待檢物數(shù)量的分子。
例如，由一個(gè)多聚物連接有化學(xué)或生物分子所形成的多糖共聯(lián)物，其化學(xué)或生物 分子作為一個(gè)探針或不同的探針，從而構(gòu)成一個(gè)共聯(lián)物探針，作為探針的化學(xué)或生物 分子通過(guò)共價(jià)鍵或如離子相互作用或弱電結(jié)合力等非共價(jià)化學(xué)相互作用與多聚物連 接，多聚物可能是線狀的或分枝狀的，如線狀或分枝狀的多糖或寡核苷酸。
將共聯(lián)探針結(jié)合在傳感器表面可以通過(guò)多種途徑實(shí)現(xiàn)，例如可以在表面引入環(huán)氧 基團(tuán)，以與共聯(lián)探針的羥基或氨基反應(yīng)，還可以將表面用多聚賴氨酸處理，以結(jié)合點(diǎn) 在表面上的共聯(lián)探針或生物分子，紫外照射可以將探針或生物分子結(jié)合在如載玻片或 電子設(shè)備臨近的鈍化層等基質(zhì)上，共聯(lián)探針或寡核苷酸可以被結(jié)合在引入醛基、氨基 或異硫氰酸酯基的傳感器表面。陣列的制造機(jī)制可以是針點(diǎn)、噴點(diǎn)或芯片上直接合成。本發(fā)明的另一目的是提供一種傳感器設(shè)備，該傳感設(shè)備包括光學(xué)數(shù)字圖像傳感 器、低光罩和共聯(lián)探針陣列。
本發(fā)明描述了通過(guò)數(shù)字圖象或者說(shuō)"機(jī)器視覺(jué)"傳感技術(shù)來(lái)讀取陣列上結(jié)合的待 檢物信號(hào)，其具有低背景和相對(duì)高信噪比的特點(diǎn)，是一種強(qiáng)化的檢測(cè)待檢物的生物傳 感器系統(tǒng)。具體的說(shuō)這種生物傳感器系統(tǒng)應(yīng)用了包括有子板上的數(shù)字圖象傳感器、具 有共聯(lián)探針的陣列、帶有傳感器降溫裝置的低光外殼和待檢物信號(hào)的積分方法等的信 號(hào)傳感技術(shù)。
帶有共聯(lián)探針的陣列所產(chǎn)生的光學(xué)信號(hào)可以被數(shù)字圖象傳感器檢測(cè)，其中數(shù)字圖 象傳感器包括光敏元件的矩陣，點(diǎn)制的共聯(lián)探針通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合于數(shù)字圖象傳 感器的表面形成陣列。用另一種方式，共聯(lián)探針可以點(diǎn)制在可以靠近數(shù)字圖象傳感器 的載玻片上，而在載玻片和傳感器直接存在有光纖耦合器。
陣列上單個(gè)探針點(diǎn)的局部區(qū)域可以大于數(shù)字圖象傳感器的單個(gè)光敏元件。
同樣探針點(diǎn)大小可以與單個(gè)光敏元件一致。
數(shù)字圖象傳感器可以是CMOS活性像素傳感器，其每個(gè)像素對(duì)應(yīng)連接有數(shù)字轉(zhuǎn)換 器、放大器和寄存器的光敏二極管。CMOS活性像素傳感器的頂層是鈍化層，如可以充 分透光的二氧化硅，以作為隔絕陣列檢測(cè)的待檢物溶液和半導(dǎo)體線路的屏障。
另外，本發(fā)明涉及通過(guò)直接把陣列構(gòu)建在數(shù)字圖象傳感器上以增強(qiáng)其檢測(cè)的信 號(hào)，這是通過(guò)檢測(cè)形成在數(shù)字圖象傳感器頂部薄的鈍化層上的陣列所發(fā)射的化學(xué)發(fā)光 來(lái)實(shí)現(xiàn)的，信號(hào)可以被接近于陣列的數(shù)字圖象傳感器感光原件方便的增強(qiáng)。
本發(fā)明通過(guò)緊密接觸圖象傳感器與探測(cè)器而降低了本底輻射，從而提高了陣列上 被待檢物光學(xué)信號(hào)測(cè)量的信噪比。如附圖1所示，低光外殼100包容了光學(xué)圖象傳感 器和陣列，其具有一個(gè)頂蓋160和一個(gè)底蓋180，底蓋180承載著光學(xué)圖象傳感器的 印刷電路板、可選的傳感器冷卻元件，并與頂蓋160機(jī)械連接。圖l中光學(xué)圖象傳感器的印刷電路板上包括有第二層外殼150與連接器360相連。當(dāng)頂蓋160扣在底蓋180 上時(shí)，形成一個(gè)圍繞陣列120的為密閉屏障200所界定的低光區(qū)域300，液體受屏障 200界定在這個(gè)低光區(qū)域中接觸陣列。
在頂蓋160上有一個(gè)液體入口通道240，操作時(shí)通過(guò)液體入口通道240注射含有 靶分子的液體并轉(zhuǎn)運(yùn)到陣列120，并匯集到低光區(qū)域300，待檢物是通過(guò)加工在外殼 100內(nèi)的毛細(xì)結(jié)構(gòu)或液體通道從液體入口通道240傳送到陣列120的，液體入口通道 240包括有一個(gè)導(dǎo)入液體的隔膜，并能屏障液體和光。
有時(shí)候在底蓋180上裝有一個(gè)可選的液體入口通道320， 一個(gè)可選的液體通道340 連接可選的液體入口通道320和低光區(qū)域300。
屏障200粘附在載玻片底窗280上，當(dāng)頂蓋160扣在底蓋180上時(shí)，接近于圖象 傳感器，液體也匯集于載玻片底窗280上，同時(shí)陣列也是加工在低光區(qū)域300中的載 玻片底窗280上。
外殼100連接在讀取工作站400上從而可以保持充分的水平，外殼可以連接在讀 取工作站上也可以在任何重力方向上操作，這種情況下液體入口通道和外殼可以在任 何方向上通過(guò)表面張力和毛細(xì)管作用密閉待檢物液體，從而是待檢物陣列信號(hào)可以被 讀取。
如圖1、 2所示，支持有光學(xué)圖象傳感器140的印刷線路板380通過(guò)電路連接器 360與讀取工作站400進(jìn)行電路連接，底蓋180上也可以有開(kāi)口 220以連接光學(xué)圖象 傳感器140的電子線路。
生物傳感器系統(tǒng)通過(guò)積分待檢物信號(hào)而提高其檢測(cè)的信噪比，積分是通過(guò)增加檢
測(cè)來(lái)自于陣列的光的收集時(shí)間和降低圖象傳感器以外的信號(hào)數(shù)據(jù)傳輸比率來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
為了積分待檢物信號(hào)所采用的數(shù)據(jù)傳輸方法是使用CMOS活性像素傳感器，典型的
CMOS活性像素傳感器就是可以用于攝影機(jī)的快速幀頻設(shè)備。CMOS活性像素傳感器可
以以非常慢速的狀態(tài)來(lái)整合(積分)緊密接觸在傳感器上的陣列信號(hào)，積分信號(hào)存入存儲(chǔ)器，然后重復(fù)積分，觀察待檢物信號(hào)隨時(shí)間的變化率。CMOS活性像素傳感器的幀
頻可以控制，例如在零時(shí)間點(diǎn)上清空所有芯片記錄，然后收集固定時(shí)段的待檢物發(fā)射 的信號(hào)，圖象傳感器的單個(gè)光敏元件可以同時(shí)積分不同的周期。待檢物信號(hào)的積分增 加了其信噪比，從而增強(qiáng)了對(duì)待檢物的檢測(cè)，而允許更低濃度的待檢物可以被檢測(cè)。
待檢物信號(hào)可以通過(guò)冷卻低光外殼中CMOS活性像素傳感器降低其固有的"暗電 流"噪聲來(lái)加強(qiáng)，傳感器可以用熱電元件、噴口擴(kuò)展、制冷、冷液浸泡等途徑進(jìn)行冷 卻。 一般來(lái)說(shuō)，將傳感器冷卻7'C可減少一半"暗電流"噪聲。因此將傳感器冷卻到 4'C則可以把這種噪聲降低至室溫水平的1/10，含有或者不含有待檢物的液體注入到 低光外殼中時(shí)也可以冷卻傳感器。
適用的光學(xué)檢測(cè)包括檢測(cè)熒光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光和量子點(diǎn)等方法，標(biāo)記物或 信號(hào)分子附著在多聚物或共聯(lián)探針或靶混合物中的待檢物上，包括放射性同位素、熒 光劑、化學(xué)發(fā)光劑、化學(xué)發(fā)光體、生物發(fā)光劑、酶、抗體、顆粒如磁珠和量子點(diǎn)。附 著有熒光染料的帶有氨基的短寡核苷酸也用于標(biāo)記物，其氨基可以和共聯(lián)報(bào)告物的多 聚物連接。用于檢測(cè)待檢物的信號(hào)分子包括放射性同位素，熒光染料如Cy3、Cy5、Alexa Fluor488、熒光素、羅丹明、得克薩斯紅、玫瑰紅、丹磺酰氯、溴化乙啶、萘胺、pyrenes、 卟啉，化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)如魯米諾、發(fā)光氨、吖啶苯酯、釕鹽、生色團(tuán)，和比色探針如膠 體金、偶氮染料、喹啉染料、花青染料。
標(biāo)記物包括拮抗劑和對(duì)抗劑、毒素、抗原決定基、激素、抗體、多肽、酶、寡核 苷酸、肽核酸、凝集素、碳水化合物、蛋白和藥物，例如用于ELISA檢測(cè)的酶可以用 來(lái)進(jìn)行熒光檢測(cè)，另外，熒光標(biāo)記的抗生物素或鏈酶親和素。
對(duì)一種特定的待檢物可以通過(guò)多種標(biāo)記物形成多種檢測(cè)方法，例如共聯(lián)報(bào)告物的 多聚物可以連接多種熒光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，此外，共聯(lián)報(bào)告物也能夠結(jié)合多種靶點(diǎn)， 因此共聯(lián)探針的多聚物可以連接多種靶點(diǎn)結(jié)合分子和多種不同的標(biāo)記物。
13對(duì)于熒光檢測(cè)，熒光物的激發(fā)光可以由靠近陣列或者靠近CMOS傳感器外殼的LED 面板提供，在陣列附近陣列點(diǎn)與光敏二極管之間的窄帶濾光片可以從陣列的讀取信號(hào) 中去除激發(fā)信號(hào)，而對(duì)發(fā)射光進(jìn)行檢測(cè)。
另一種方法是待檢物信號(hào)可以通過(guò)光學(xué)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光來(lái)讀取測(cè)定信息?；瘜W(xué)發(fā)光 來(lái)自于化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光，可以被沒(méi)有濾光片的寬帶探測(cè)器所檢測(cè)，如CM0S活性像 素傳感器，陣列點(diǎn)發(fā)出的光直接被檢測(cè)，背景信號(hào)主要來(lái)自于"暗電流"。待檢物可 以標(biāo)記上化學(xué)發(fā)光標(biāo)簽用于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，如堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶。檢測(cè)效 率一部分依賴于對(duì)標(biāo)記的選擇性或特異性附著效率，標(biāo)記識(shí)別物可以是生物素或地高 辛抗體此類的能被酶檢測(cè)系統(tǒng)識(shí)別的物質(zhì)，然后發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)通過(guò)化學(xué)鍵斷裂釋 放能量產(chǎn)生離散波長(zhǎng)的光子。
在共聯(lián)報(bào)告物上，信號(hào)分子或染料分子相對(duì)與標(biāo)記識(shí)別分子的數(shù)量比例可以是多 種多樣的，有時(shí)至少是3、 4、 5，通常至少是6、 7、 8、 9，也有時(shí)至少需要10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90或者100，不同的組合方式來(lái)構(gòu)成。
本發(fā)明中的陣列信號(hào)檢測(cè)可以使用數(shù)字圖象傳感器，也可以使用電荷耦合裝置 (CCD)、光電倍增管(PMT)或雪崩光電二極管來(lái)完成，待檢物的檢測(cè)也可以通過(guò)， 例如電導(dǎo)檢測(cè)來(lái)完成不同的陣列方案。
本發(fā)明涉及到共聯(lián)探針在工業(yè)、環(huán)境、生物醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用，這項(xiàng)發(fā) 明的共聯(lián)探針可以應(yīng)用于分析診斷以及檢測(cè)液體、氣體或固體形態(tài)中的待檢物，共聯(lián) 探針可以與生物傳感器組合應(yīng)用于對(duì)待檢物或液相、非液相、氣相中的有機(jī)、無(wú)機(jī)或 環(huán)境顆粒進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明的再一目的是提供一種生物傳感器系統(tǒng)，其包括讀取工作站、包括有圖象 傳感器的便攜外殼。
如圖4所示，生物傳感器系統(tǒng)包括在低光外殼100中的數(shù)字圖象傳感器600、高
數(shù)據(jù)通量的讀取工作站400和一臺(tái)通用計(jì)算機(jī)700，讀取工作站400至少有一個(gè)供帶
14有CMOS數(shù)字圖象傳感器600的低光外殼100插入的插座，以形成傳感器外殼與讀取 工作站的電路和機(jī)械連接，讀取工作站可以通過(guò)通用串行總線(USB) 454、并行端口 接口設(shè)備452或以太網(wǎng)接口 456與計(jì)算機(jī)相連。
根據(jù)圖4，在讀取工作站400的主板上有一個(gè)可編程的邏輯設(shè)備460，如與個(gè) 人計(jì)算機(jī)的通用計(jì)算機(jī)700相連接，可編程的邏輯設(shè)備460也和數(shù)字圖象傳感器600 相連，通過(guò)監(jiān)測(cè)開(kāi)始和結(jié)束的圖象信號(hào)，包括幀、線和時(shí)鐘脈沖線，同步讀取數(shù)字圖 象傳感器的待檢物數(shù)據(jù)?？删幊痰倪壿嬙O(shè)備460管理圖象數(shù)據(jù)從圖象傳感器600傳入 本地FIFO存儲(chǔ)器，直到計(jì)算機(jī)700要求數(shù)據(jù)傳送?？删幊痰倪壿嬙O(shè)備460 —個(gè)典型 的循環(huán)包括計(jì)算機(jī)700命令傳感器輸出一個(gè)圖象，捕捉圖象并傳入讀取工作站400 主板上的本地FIFO存儲(chǔ)器里，傳送捕捉的圖象至計(jì)算機(jī)700。圖形用戶界面(GUI) 可以讓使用者簡(jiǎn)便的實(shí)現(xiàn)急射的圖象捕捉顯示循環(huán)或連續(xù)的動(dòng)態(tài)顯示方式。濾光片和 圖象處理工具可以讓使用者在低光條件下操作傳感器，包括使來(lái)自傳感器的弱信號(hào)提 升的圖象處理程序、圖象重復(fù)增強(qiáng)軟件程序、扣除背景或"全黑"圖象程序和濾除噪 聲程序。GUI還可以讓使用者控制調(diào)節(jié)傳感器本身的參數(shù)設(shè)置，如積分時(shí)間、增益和 模擬轉(zhuǎn)換數(shù)字的范圍。
讀取工作站包括一個(gè)匹配圖象傳感器和低光外殼的連接器，這樣安排是為了讓數(shù) 字圖象傳感器待檢物探測(cè)器與讀取工作站方便的分開(kāi)以提高該生物傳感器系統(tǒng)的工 作通量，輕便的數(shù)字圖象傳感器外殼構(gòu)成低光外殼。該生物傳感器系統(tǒng)即插即用的特 點(diǎn)允許其使用輕便可拋棄的數(shù)字圖象傳感器外殼，當(dāng)然生物傳感探測(cè)器的外殼也可以 再生應(yīng)用于其他陣列。
讀取工作站包括一個(gè)USB微型計(jì)算機(jī)接口，也可以包括一個(gè)微軟擴(kuò)展容量接口 (ECP)界面并帶有一個(gè)決定主動(dòng)連接的使用者控制開(kāi)關(guān)，讀取工作站主板可以由USB 線纜供電，但對(duì)于ECP則需要9V的直流供電。 一個(gè)手控開(kāi)關(guān)可以重啟生物傳感器主 板和可編程的邏輯設(shè)備。本發(fā)明涉及了通過(guò)時(shí)間積分來(lái)增強(qiáng)待檢物信號(hào)檢測(cè)的方法，靶物質(zhì)中待檢物參數(shù) 的數(shù)據(jù)產(chǎn)生和測(cè)量受限于數(shù)字圖象傳感器陣列檢測(cè)產(chǎn)生的光所固有的信噪比。信噪比 可以通過(guò)積分待檢物信號(hào)幾毫秒或更長(zhǎng)時(shí)間的積分，通常是10毫秒至大約2分鐘， 有時(shí)是30至大約1000毫秒，有時(shí)是50至大約600毫秒，這個(gè)時(shí)間也可以通過(guò)儲(chǔ)存 一系列陣列信號(hào)幀(畫(huà)面)來(lái)實(shí)現(xiàn)，每一幀也是通過(guò)一個(gè)時(shí)段的待檢物信號(hào)積分(整 合)而來(lái)的。
USB微型計(jì)算機(jī)接口為圖象傳感器和可編程的邏輯設(shè)備提供了主時(shí)鐘，圖象傳感 器輸出像素?cái)?shù)據(jù)和線幀脈沖，通過(guò)連接器傳至主板，存入FIFO存儲(chǔ)器，幀脈沖用于 復(fù)位FIF0指針，線脈沖用于許可寫(xiě)入FIFO， FIFO中儲(chǔ)存的像素?cái)?shù)據(jù)安排為以上面左 邊的像素作為起始零位置。
一旦圖象存入FIFO，即可通過(guò)兩種接口之一被讀取。如圖4所示，ECP允許陣列 圖象數(shù)據(jù)通過(guò)每次讀一個(gè)像素的方式讀入并口 (PP) 452，當(dāng)PP452發(fā)送一個(gè)反向請(qǐng) 求時(shí)，可編程的邏輯設(shè)備460許可其向PP452的輸出驅(qū)動(dòng)程序，而開(kāi)始讀取，然后可 編程的邏輯設(shè)備460發(fā)送一次時(shí)鐘，PP452就相應(yīng)一次應(yīng)答，時(shí)鐘應(yīng)答順序進(jìn)行直到 計(jì)算機(jī)700讀取完一幀像素，可編程的邏輯設(shè)備460用PP452的數(shù)據(jù)位0和1分別作 為12C總線的SDA和SCL。
另外，F(xiàn)IFO中的圖象數(shù)據(jù)還可以通過(guò)USB接口讀取，相對(duì)于常規(guī)的USB傳輸來(lái)講 提高串行數(shù)據(jù)傳輸?shù)膸捒梢蕴岣呱飩鞲衅鞯氖褂?，而常?guī)的USB傳輸中從FIFO 讀取兩個(gè)數(shù)據(jù)包之間存在有一個(gè)間隔時(shí)間。例如，當(dāng)從FIF0讀取一個(gè)63像素的數(shù)據(jù) 包并通過(guò)常規(guī)的USB微型計(jì)算機(jī)接口的一條數(shù)據(jù)線傳輸，在FIFO里指定2個(gè)終點(diǎn)以 建立2個(gè)緩存，實(shí)際運(yùn)行上一個(gè)緩存可以在另一個(gè)滿了的情況下讀取并通過(guò)USB的數(shù) 據(jù)線傳輸，因此比普通串行總線提高了 100%的傳輸帶寬。第一個(gè)緩存數(shù)據(jù)傳輸即將 結(jié)束之前，如1個(gè)或幾個(gè)時(shí)鐘脈沖之前，第二個(gè)緩存開(kāi)始通過(guò)通用串行總線的數(shù)據(jù)線 開(kāi)始傳輸，而當(dāng)?shù)诙€(gè)緩存數(shù)據(jù)傳輸接近完成的同時(shí)，第一個(gè)緩存也用了同樣的時(shí)間加載數(shù)據(jù)，這樣的步驟反復(fù)進(jìn)行直至要傳輸?shù)臄?shù)據(jù)完成，因此比傳統(tǒng)的USB提高了傳 輸率。
本發(fā)明主要包括幾個(gè)關(guān)鍵因素傳感器直接對(duì)探針檢測(cè)、共聯(lián)探針、及配對(duì)報(bào)告 物。此外，共聯(lián)探針和共聯(lián)報(bào)告物通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)交聯(lián)于聚合物骨架。通過(guò)這些過(guò) 程的結(jié)合使用，本發(fā)明能夠建立一種超敏感、高速、低成本、高度便攜的分子檢測(cè)系 統(tǒng)，在其眾多潛在的應(yīng)用中，突出例子就是直接檢測(cè)多種形式粗略樣品中的核酸，而 不需要核酸的抽提和擴(kuò)增環(huán)節(jié)，這種全新的發(fā)明可能會(huì)改變或替代目前針對(duì)臨床核酸 樣品或其它核酸樣品應(yīng)用領(lǐng)域的基因分型、基因突變和基因表達(dá)圖譜的應(yīng)用現(xiàn)狀。另 一項(xiàng)應(yīng)用是以一種超敏感的方式改變或替代以蛋白免疫為基礎(chǔ)的現(xiàn)有多種形式的
ELISA檢測(cè)。


圖1示例一個(gè)讀取工作站上的低光圖象傳感器外殼；
圖2示例側(cè)視低光圖象傳感器外殼；
圖3示例用CMOS圖象傳感器檢測(cè)一個(gè)探針點(diǎn)的熒光；
圖4a c 示例生物傳感器系統(tǒng)對(duì)一個(gè)待檢物進(jìn)行檢測(cè)及其陣列檢測(cè)數(shù)據(jù)的顯 示，其中a為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes), b為流感桿菌 (Hemophilus influenzae) ， c為3、腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
線性葡聚糖(Sigma)用于耦聯(lián)帶氨基的寡核苷酸-
線性葡聚糖(Sigma)溶于去離子水，終濃度1%，高壓滅菌，室溫暗環(huán)境下每 0. 4毫升葡聚糖溶液被44微升0. 5M的高碘酸鈉氧化，搖床過(guò)夜，氧化的葡聚糖用0. 3M的NaOAC和2倍體積的乙醇沉淀洗滌兩次，沉淀空氣干燥后重溶于0. 4毫升5mM pH7. 2 的磷酸鈉緩沖液。
在離心管中加入1微升氧化葡聚糖、7微升10mM的Na2C03 (pH9. 0)和2微升寡 核苷酸(2uM水溶液)，寡核苷酸長(zhǎng)度是25—45mer，并在合成時(shí)在3，或5，端引入 首位氨基，37'C水浴過(guò)夜，加入NaBH4室溫孵育30分鐘，然后用0. 3M的NaOAC和2 倍體積的乙醇沉淀，沉淀用TE重溶，并取一部分進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，EtBr 染色，游離的寡核苷酸泳動(dòng)至很接近鹽前端，而與葡聚糖耦聯(lián)的寡核苷酸泳動(dòng)的非常 慢。
實(shí)施例2
高分子量分枝多糖、糖原(Sigma)和支鏈淀粉(Sigma)用于交聯(lián)帶氨基的寡核苷酸。 這些聚合物的二醇鍵通過(guò)NaIO,氧化成醛基，0.4毫升1%多糖水溶液中加入高碘
酸鈉，對(duì)于糖原和支鏈淀粉分別終濃度為25mM和20mM，室溫暗環(huán)境搖床氧化過(guò)夜，
用0. 3M的NaOAC和2倍體積的乙醇沉淀兩次去除過(guò)量的NaI04，沉淀空氣干燥后重溶
于0. 4毫升5mM pH7. 2的磷酸鈉緩沖液，耦聯(lián)帶氨基的寡核苷酸及耦聯(lián)產(chǎn)物的凝膠分
析與實(shí)施例1中葡聚糖相同。
共聯(lián)聚合物的制備交聯(lián)密度為每10個(gè)葡萄糖單體交聯(lián)1個(gè)寡核苷酸，平均大約每
個(gè)糖原分子交聯(lián)1000個(gè)寡核苷酸分子。
實(shí)施例3
信號(hào)分子5' -ACTGCT-3， (BP001)的5'末端帶有氨基，3'末端帶有Cy5熒光燃料， 5' 末端帶有氨基的識(shí)別探針寡核苷酸分子 AKH108 (5， -CCGTGCAGATCTTAATGTGCCAGTAAAAG-3')與同一多糖交聯(lián)，AKH108能與流感嗜 血桿菌基因組中編碼3-磷酸甘油酸激酶基因片段的引物 5， -CCGTGCAGATCTTAATGTGC-3，和5， -GCGCTGTACCAAAGGCATC-3，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物雜 交，PCR產(chǎn)物以微陣列的形式點(diǎn)在包被有多聚賴氨酸的玻璃載玻片上。 所謂交聯(lián)反應(yīng)即在裝有20nmo1氧化糖原、10mM Na2C03的離心管中加入0. 2nmo1AKH108和2nmo1 BP001，終體積10微升，37。C過(guò)夜。
在管中加入終濃度4mM的Na朋"室溫孵育90分鐘，終產(chǎn)物用乙醇沉淀，離心， 交聯(lián)產(chǎn)物和游離AKH108處在沉淀中，游離的BP001處在上清中棄去，用10微升3X SSPE/0. 1% SDS/1.0 mg/ml BSA溶解沉淀并加到微陣列表面，室溫雜交5小時(shí)，用10 微升的新鮮的0. 1XSSPE/0. 1%SDS清洗載玻片3次，用激光掃描儀進(jìn)行掃描，觀測(cè)PCR 產(chǎn)物的斑點(diǎn)圖譜。 實(shí)施例4
能特異性雜交來(lái)自以糞腸球菌的RecA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的寡核苷酸 5' -NH2-CCGATGCC TTAGTTTCAAGTGGTGCGATTGACATCGTTGTCAT-3'，與糖原或支鏈淀粉交 聯(lián)，多糖氧化同實(shí)施例2。交聯(lián)反應(yīng)即，20nmol氧化糖、2n即l帶氨基的寡核苷酸與 10mM的Na2C03緩沖液(pH9.0)混合，終體積10微升，37。C孵育過(guò)夜，交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束 后加入終濃度4mM的NaB&室溫孵育60分鐘。
終產(chǎn)物用0.3M的NaOAC和2倍體積的乙醇沉淀，然后溶解于lOmM的Na2C03 (pH9.0)。 一部分交聯(lián)的寡核苷酸點(diǎn)在環(huán)氧處理的玻璃載玻片上，等量的寡核苷酸和 未氧化的多糖混合也點(diǎn)在同一張載玻片上作為對(duì)照。芯片上雜交即標(biāo)記有Alexa Fluor 546 (Molecular Probes Inc)的RecA的PCR產(chǎn)物溶解于3 X SSPE/0. 1% SDS/1. 0mg/ml BSA，并加在玻璃載玻片表面上，室溫雜交3小時(shí)，0. 1 X SSPE/0. 1%SDS 清洗，用激光掃描儀進(jìn)行掃描，與糖原交聯(lián)的寡核苷酸點(diǎn)信號(hào)相對(duì)于非氧化糖原對(duì)照 點(diǎn)5. 86倍，與支鏈淀粉交聯(lián)的寡核苷酸點(diǎn)信號(hào)相對(duì)于非氧化支鏈淀粉對(duì)照點(diǎn)5. 63倍。 實(shí)施例5
二咪唑羰(CDI)活化的過(guò)程即4微升0.5M CDI (溶于DMSO)與10微升0.5
X溶于DMSO的多糖、6微升DMS0混合，室溫孵育3小時(shí)，偶爾蝸旋振蕩，每管加入
l毫升n-丁醇，蝸旋振蕩徹底混勻，離心，去除丁醇空氣干燥沉淀后，用10微升的
DMS0溶解。對(duì)于寡核苷酸交聯(lián)，2. 2nmo1帶氨基的寡核苷酸與5微升0. 5%活化CDI
多糖混合，終體積20微升，室溫孵育5天，偶爾蝸旋振蕩，反應(yīng)結(jié)束后加入1微升10
%氨基乙醇，孵育30分鐘，乙醇沉淀，產(chǎn)物溶于10微升TE緩沖液，凝膠電泳分析。實(shí)施例6用CMOS圖象傳感器直接在芯片上檢測(cè)雜交信號(hào)
模塊裸露的PB0330單色圖象傳感器(Photobit)通過(guò)插頭座連接于子板，連接 線用環(huán)氧樹(shù)脂封閉固定，模塊表面用滅菌蒸餾水沖洗3次，空氣干燥。為環(huán)氧化表面， 用2%溶于甲醇的(3-丙氧基縮水甘油)三丙氧基-硅垸加到模塊表面，室溫孵育10 分鐘，用甲醇洗2次，空氣干燥。
四種不同的探針(100pmol/ml溶于50mMNa2C03緩沖液，pH10. 5)人工點(diǎn)在環(huán)氧 處理過(guò)的模塊表面，均點(diǎn)復(fù)點(diǎn)。
點(diǎn)干燥后，用1%溶于50 mM Na2C03的氨基乙醇快速洗一次，然后用同樣的封閉 液室溫孵育10分鐘，然后用滅菌蒸餾水沖洗表面4次。
芯片上雜交，模塊表面用3XSSPE/50y。甲酰胺/1. 0 mg/ml BSA室溫孵育20分鐘， 然后和溶于20毫升的3XSSPE/50。/。甲酰胺/1. Omg/ml BSA的PCR產(chǎn)物(末端標(biāo)記有生 物素，如后詳述)雜交(此前于沸水浴加熱2分鐘，迅速冷卻至4X:)， 3(TC濕盒中雜 交過(guò)夜，完成后室溫用O. 1XSSPE清洗4次，每次5分鐘。用鏈酶親和素-堿性磷酸 酶結(jié)合雜交的PCR產(chǎn)物上的生物素，首先模塊表面用溶于TBS的lmg/ral BSA室溫孵 育20分鐘，然后用TBS/lmg/ml BSA 1: 100稀釋的Avidx-AP (Tropix)室溫孵育2 小時(shí)，再用TBS室溫清洗5次，每次5分鐘。
檢測(cè)芯片上雜交信號(hào)，模塊表面帶有TBS的子板插入讀取工作站閉光外殼的連接 器里，安裝在PC上的授權(quán)軟件接收"暗圖象"(即背景圖象，Idark)，子板插在讀取 工作站上，TBS被換成化學(xué)發(fā)光底物溶液，包括依據(jù)供貨說(shuō)明制備的CDP-star和增強(qiáng) 劑Emerald II (均來(lái)自Tropix)。
大約0.1秒積分時(shí)間的圖象幀(I)被從傳感器接收，I-Idark作為真實(shí)信號(hào)快照， 軟件具有一個(gè)把連續(xù)處理的快照加在一起并作為一幅圖像顯示結(jié)果的子程序，因此更 加延展了積分時(shí)間。
以下的傳感器寄存器設(shè)置最優(yōu)增益(寄存器53、 43—46)，最大；積分時(shí)間(寄 存器9、 10)，每幀O. 1秒；相似負(fù)偏移(寄存器32、 57)，最大；增益級(jí)(寄存器62)， 74;其他寄存器保持默認(rèn)設(shè)置。實(shí)施例7用T0TDA涂布合成多聚物
在一個(gè)Eppendorff管中加入8微升溶于5mM磷酸緩沖液(pH 7. 2)的1%氧化葡 聚糖-500， 1微升lmM 5'帶有氨基的寡核苷酸衍生物，2微升0. 2M的Na2B03 (pH 9. 0)， 2微升20 mM的Na朋3CN， 1微升0. 3mM的TOTDA和6微升的水?；靹蛟?°C溫育過(guò)夜。 然后加入4微升的水和6微升的DMS0，轉(zhuǎn)到微量滴定板上，轉(zhuǎn)印到GeneMachine 0mniGrid Accent arrayer的芯片表面。涂布的交聯(lián)劑與捕獲的分子比例在10: 1到 1: 1000之間。應(yīng)該注意在這一還原氨化反應(yīng)中，靠NaBH3CN形成的shift， s鍵的同 步還原反應(yīng)幫助偶聯(lián)反應(yīng)完成。
實(shí)施例9 G四聯(lián)體共聯(lián)報(bào)告物
一個(gè)富含G寡聚核苷酸TP(TGGACCAGACCAGCTATGGGGGAGCTGGGGAA ^T,AATGTGA)可以從含有一個(gè)通過(guò)鳥(niǎo)嘌呤間的Hoogsteen型堿基對(duì)而形成的四鏈 G4-DNA結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)換區(qū)中獲得。報(bào)道于Sen and Gilbert (1988) 7fe^re 334:364-366, Sen and Gilbert (1990)組,344: 410-414.—個(gè)截?cái)嗟腡P如寡 聚核苷酸Q3 (5' -CACGTATGGGGGAGCTGGGGTAT-3')，被用來(lái)制備純化G4-DNA特殊核酸 酶的G4-DNA親和矩陣，報(bào)道于Liu and Gilbert (1994) 1083-1092.在鈉
和鉀離子存在的條件下，四鏈結(jié)構(gòu)是非常穩(wěn)定的。
在一個(gè)Eppendorff管中加入，2 mM服P 25微升，0. 3mM濃度5，尾端帶有一個(gè) 氨基的Q3寡核苷5微升，20mM濃度NaCNBrH3 IO微升，0. lmm濃度的抗生物素蛋白 5微升，1%的氧化葡聚糖_500 40微升和水5微升。在4'C孵育過(guò)夜。然后過(guò)柱，柱子 是Bio-GelP-50介質(zhì)。收集過(guò)柱的小部分碎片，然后用包含40%甘油，200mM氯化鈉， 和100mM氯化鉀的緩沖液l: l混勻。-2(TC保存。這個(gè)試劑能夠監(jiān)測(cè)分子包含有生物 素標(biāo)簽的樣品，它能增強(qiáng)其靈敏度。相比于直接的HRP聚合，目前方法得到的多聚服P 有具多優(yōu)勢(shì)。這是因?yàn)樵趦?cè)P之間有更多的間距，這種多聚HRP的形成浮力密度很 小，因此不太可能由于沉淀而與檢測(cè)的表面黏著在一起，減少?zèng)]有非特異結(jié)合的噪聲 信號(hào)。另外，HRP之間更好的間距能夠減小底物損耗和底物擴(kuò)散這些限速的可能性可減少發(fā)光信號(hào)的收集。堿性磷酸酶或者熒光染料能容易地替代HRP做其它共聯(lián)報(bào)告物。 葡聚糖骨架中的Q3寡聚核苷主要是提供一個(gè)機(jī)械的穩(wěn)定性，能夠減輕由于機(jī)械
剪切導(dǎo)致的骨架損傷。眾所周知，在Na和K離子存在的情況下，富含G的寡聚核苷
酸能夠通過(guò)Hoogsteen堿基配對(duì)形成一個(gè)穩(wěn)定的四級(jí)結(jié)構(gòu)(稱為G4DNA或者G四聚體)。 Q3寡聚核苷在葡聚糖中的作用是提供某個(gè)物理連接(或連接橋)這個(gè)物理連接
是非共價(jià)的，在聚合體骨架中間，在自然情況下既能在分子內(nèi)部又能在分子之間。 當(dāng)然，帶氨基的Q3寡核苷酸同樣也能用來(lái)制備共聯(lián)探針，例如替代TOTDA，正
如在例8中所描述的，將產(chǎn)生一個(gè)穩(wěn)定，非共價(jià)的聚合體骨架物理連接，從而提供更
好的機(jī)械穩(wěn)定性。
實(shí)施例9 Watson-Crick堿基配對(duì)穩(wěn)定共聯(lián)報(bào)告物
有其它的方法建立聚合體骨架的非共價(jià)連接， 一個(gè)例子，利用互補(bǔ)的寡核苷酸 之間的特異的堿基配對(duì)?？梢院铣梢粋€(gè)17-mer隨機(jī)序列寡核苷酸，在3'端帶有氨基 基團(tuán)，然后合成他的互補(bǔ)核苷酸，在3'端也帶有氨基。正如實(shí)施例8所描述的準(zhǔn)備 共聯(lián)報(bào)告物的過(guò)程，結(jié)合使用這2個(gè)寡核苷酸能替代Q3寡聚核苷酸。
實(shí)施例10寡聚核苷雜交的敏感滴定
在直接探針感應(yīng)器的方法中，聯(lián)合使用共聯(lián)探針和共聯(lián)報(bào)告物的重要原因是此
舉能夠在很大程度上改良其敏感性。本實(shí)施例評(píng)估這個(gè)結(jié)合系統(tǒng)的敏感性。
如實(shí)施例5所述，2個(gè)不同的寡聚核苷酸A105和D207，各自與氧化葡聚糖交叉
結(jié)合。每個(gè)共聯(lián)探針都以2.2矩陣印在CM0S傳感器上，總共7個(gè)芯片被印記。印記
之后，芯片在70%濕度的小室中干燥2小時(shí)，然后再80。C真空烘烤過(guò)夜，然后用PBS
或相應(yīng)的溶液漂洗。在含有被生物素化的互補(bǔ)寡聚核苷BC-A105和BC-D207的雜
交溶液，加入了上述芯片。對(duì)于所有7個(gè)芯片，每個(gè)芯片(或雜交反應(yīng))BC-A105數(shù)
量維持在10—17摩爾，寡聚核苷BC-D207的數(shù)量降低10倍，約為10—16到1(T'摩爾之間。
第7個(gè)芯片是省略BC-D207的雜交反應(yīng)。雜交之后，用O. 1XSSPE完全洗脫芯片，然
后，用含有Straptavidin-Poly HRP和1%BSA的TBS緩沖液中溫育1小時(shí)，再用TBS洗脫芯片數(shù)次，HRP發(fā)光的底物就被加在芯片上，雜交結(jié)果經(jīng)過(guò)USB閱讀器，直接還 原在個(gè)人電腦的桌面上。
重復(fù)的數(shù)據(jù)反復(fù)證實(shí)這套系統(tǒng)的敏感度是500分子(也就是總量既包括未結(jié)合 態(tài)也包括雜交后結(jié)合態(tài)化合物)當(dāng)沒(méi)有BC-D207的時(shí)候，在D207共聯(lián)探針的"點(diǎn)" 上沒(méi)有雜交信號(hào)。為了評(píng)估這套系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)范圍，來(lái)自D207的雜交信號(hào)數(shù)量被A105 的雜交信號(hào)數(shù)量除后或者數(shù)量化修飾之后，這些數(shù)據(jù)相對(duì)BC-D207的濃度作圖，雙對(duì) 數(shù)圖中，其線性范圍顯示出至少有4.5的對(duì)數(shù)數(shù)量級(jí)。
實(shí)施例11血清中基因的無(wú)擴(kuò)增檢測(cè)
將10毫升人類病人血液離心。從離心管中提出血清的白色細(xì)胞層加入到裝有3 毫升細(xì)玻璃珠和6毫升PBS緩沖液的15毫升離心管中。然后，用臺(tái)式超聲破碎機(jī)破 碎一分鐘，重復(fù)4次以上。將20微升未經(jīng)處理的融胞產(chǎn)物加在含有人類CYP450基因 捕獲探針的CMOS傳感器芯片上，然后加入1微升末端含有生物素標(biāo)簽并能與捕獲探 針雜交的報(bào)告探針。經(jīng)過(guò)兩個(gè)小時(shí)的雜交，并在嚴(yán)格的條件下漂洗。然后加入含有 Straptavidin和poly-HRP (多聚辣根過(guò)氧化物酶)的共聯(lián)報(bào)告物在室溫下焙育一小 時(shí)。再用PBS緩沖液漂洗數(shù)次并將化學(xué)發(fā)光底物(LMA-6， Lumigen)加到芯片上。雜交 結(jié)果通過(guò)一個(gè)便攜USB讀取裝置傳送到筆記本電腦上。
每十微升血液中含有一百二十萬(wàn)個(gè)白細(xì)胞。假定檢測(cè)特殊的CYP450單倍體，通 過(guò)上述程序回收的樣品總量將達(dá)到70%，每20微升未處理的融胞產(chǎn)物就有10， 000份 CYP基因拷貝用于芯片雜交檢測(cè)。當(dāng)前的系統(tǒng)比檢測(cè)特異雜交靈敏度更高，因此可以 繞過(guò)前面對(duì)目標(biāo)序列的擴(kuò)增。
實(shí)施例12微生物病原體的非擴(kuò)增檢測(cè)
在活細(xì)胞中，核糖體RNA是一種大量存在的核酸，估計(jì)每個(gè)細(xì)胞中含有大約
10, 000個(gè)。雖然這種RNA在序列上十分保守，但通過(guò)特異核酸雜交，種間序列上的差
異足以進(jìn)行物種鑒定。下面是一個(gè)微生物病原體檢測(cè)的例子。
23舉例說(shuō)明大體上檢測(cè)原理。將沙眼衣原體溶液濃縮到10，000 cfu/ml備用。在一 個(gè)EP管中將0. 3毫升CT溶液與0. 3毫升含有2%SDS的PBS緩沖液和0. 3毫升(體積) 的玻璃珠混合。然后用最高速度在漩渦器上旋轉(zhuǎn)混勻。在10微升上清液加入10微升 含有90%甲酰胺和6XSSPE的溶液并加入1微升生物素指示探針，然后轉(zhuǎn)到含有通過(guò)多 聚骨架結(jié)合了捕獲探針(合為共聯(lián)探針)的感受芯片上雜交一小時(shí)。在此例，共聯(lián)探針 是點(diǎn)在一個(gè)透明薄層上，然后再固定到CMOS光電傳感器表面上的(組成感受芯片)。 指示探針和捕獲探針在規(guī)定的雜交條件下與同一個(gè)核糖體RNA接合。這個(gè)長(zhǎng)度在17 到45個(gè)核苷酸殘基。雜交后芯片的處理過(guò)程與上面的例子相同。做這種臨床檢測(cè)， 需要包括芯片陽(yáng)性和陰性對(duì)照。而且，可能需要同一種檢測(cè)的另外一種病原體如淋球 菌的捕獲和指示探針。假如玻璃珠漩渦造成的CT細(xì)胞溶菌破裂率大約是10%，那么對(duì)于任何給定的核糖 體RNA，可以計(jì)算出目標(biāo)分子出現(xiàn)在每個(gè)雜交反應(yīng)中的數(shù)量正如上面描述的是大約 150000。雖然這僅僅是下限，但是對(duì)于沒(méi)有任何酶擴(kuò)增的系統(tǒng)這個(gè)數(shù)值已經(jīng)足夠用于 檢測(cè)。在對(duì)于最常見(jiàn)的性傳染疾病CT/NT進(jìn)行臨床檢測(cè)時(shí)， 一般是用棉花球插入陰道取 樣。取樣后的棉花球可用PBS緩沖液將大部分細(xì)胞清洗下來(lái)，然后重懸在1毫升的PBS 中。CT/NC呈陽(yáng)性的病人，以這種方式收集到的細(xì)胞至少可以達(dá)到10000個(gè)細(xì)胞每毫 升。這樣上面所描述的檢測(cè)法就完全可以適用了。這兒揭示的原理可以應(yīng)用于通過(guò)水 或食物傳播的病原體的非擴(kuò)增檢測(cè)。
權(quán)利要求
1、一類分子檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述檢測(cè)系統(tǒng)包括a)化學(xué)或生物分子；b)聚合物；c)交聯(lián)分子；以及d)圖像傳感器，其中，所述聚合物與所述光電傳感器共價(jià)連接，所述化學(xué)或生物分子與所述聚合物橫向連接，所述聚合物通過(guò)交聯(lián)分子在分子內(nèi)、分子間共價(jià)和/或非共價(jià)連接。
2、 如權(quán)利要求1所述的分子檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，在所述光電傳感器 之上設(shè)有透明薄層支持物，所述聚合物布于透明薄層支持物上。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的分子檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述圖像傳感 器為CMOS圖像傳感器。
4、 一類共聯(lián)聚合物，其特征在于，所述共聯(lián)聚合物包括a) 化學(xué)或生物分子；b) 聚合物；以及 C)交聯(lián)分子；其中，所述化學(xué)或生物分子與所述聚合物橫向連接，所述聚合物通過(guò)交 聯(lián)分子在分子內(nèi)、分子間共價(jià)和/或非共價(jià)連接。
5、 如權(quán)利要求4所述的共聯(lián)聚合物，其特征在于，所述聚合物為天然或合成的聚合物。
6、 如權(quán)利要求5所述的共聯(lián)聚合物，其特征在于，所述天然聚合物為線 性或支鏈多聚糖、分支DNA或水凝膠。
7、 如權(quán)利要求6所述的共聯(lián)聚合物，其特征在于，所述線性多聚糖為右旋 糖酐。
8、 如權(quán)利要求6所述的共聯(lián)聚合物，其特征在于，所述支鏈多聚糖為支 鏈淀粉糖酐。
9、 如權(quán)利要求5所述的共聯(lián)聚合物，其特征在于，所述合成聚合物為甲基乙 烯基醚/馬來(lái)酸酐共聚物。
10、 如權(quán)利要求4所述的共聯(lián)聚合物，其特征在于，所述生物分子為蛋白質(zhì)、 DNA、 RNA、抗體或抗體片段。
11、 一種制備權(quán)利要求4所述共聯(lián)聚合物的方法，其特征在于，所述方法包括 以下步驟1) 用高碘酸鈉氧化多糖，形成含有大量的醛基團(tuán)的直鏈或分支多聚物；2) 添加具有氨基反應(yīng)基的化學(xué)或者生物分子；3) 與NaCNBrBH3同步還原結(jié)合完成耦合反應(yīng)。
12、 一種檢測(cè)分析物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟1) 將權(quán)利要求1的分子檢測(cè)系統(tǒng)接觸分析物樣本；2) 然后加入共聯(lián)聚合物，接觸陣列；3) 加入陣列的底物；以及4) 在不需要外在掃描器的情況下直接從光學(xué)傳感器得到數(shù)據(jù)。
13、 一種傳感器設(shè)備，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的分子檢測(cè)系統(tǒng)。
14、 一種生物傳感器系統(tǒng)，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的分子檢測(cè)系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子檢測(cè)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一類分子檢測(cè)系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的分子檢測(cè)系統(tǒng)包括a)化學(xué)或生物分子；b)聚合物；c)交聯(lián)分子；以及d)圖像傳感器，其中，所述聚合物與所述光電傳感器共價(jià)連接，所述化學(xué)或生物分子與所述聚合物橫向連接，所述聚合物通過(guò)交聯(lián)分子在分子內(nèi)、分子間共價(jià)和/或非共價(jià)連接。使用本發(fā)明的分子檢測(cè)系統(tǒng)可以直接檢測(cè)多種形式粗略樣品中的核酸，而不需要核酸的抽提和擴(kuò)增環(huán)節(jié)，這種全新的發(fā)明可能會(huì)改變或替代目前針對(duì)臨床核酸樣品或其它核酸樣品應(yīng)用領(lǐng)域的基因分型、基因突變和基因表達(dá)圖譜的應(yīng)用現(xiàn)狀。另一項(xiàng)應(yīng)用是以一種超敏感的方式改變或替代以蛋白免疫為基礎(chǔ)的現(xiàn)有多種形式的ELISA檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/48GK101514956SQ20081011795
公開(kāi)日2009年8月26日 申請(qǐng)日期2008年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月18日
發(fā)明者劉治平, 升 欒 申請(qǐng)人:北京九州泰康生物科技有限責(zé)任公司