專利名稱：：檢測豬圓環(huán)病毒2型特異性抗體的合成肽偶聯(lián)抗原及試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及動(dòng)物檢疫，尤其涉及一種豬圓環(huán)病毒2型的合成肽偶聯(lián)抗原制備，以及基于合成肽偶聯(lián)抗原的豬圓環(huán)病毒2型抗體檢測方法和檢測試劑。
背景技術(shù)：
：豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是新近發(fā)現(xiàn)的一種圓環(huán)病毒，可導(dǎo)致斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)。世界許多國家都有該病發(fā)生，近幾年我國也有該病流行。PMWS主要侵害68周齡的仔豬，發(fā)病率一般為10%20%，病死率高達(dá)50%100%，并能造成免疫抑制降低抗病力，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。成年豬一般為隱性感染，不表現(xiàn)任何癥狀，但可以傳染給仔豬。目前，針對該病尚未開發(fā)出商品化的疫苗，通過檢疫排除感染豬是最有效的防控措施。因此，建立一種準(zhǔn)確、快速檢測PCV2感染的方法，是當(dāng)前該病防控工作中急待解決的問題。豬圓環(huán)病毒包括兩種血清型PCV1和PCV2。豬群中PCV1感染非常普遍(尤其是在我國)，感染率遠(yuǎn)超過PCV2，雖不引起發(fā)病，但會(huì)交叉干擾PCV2感染的檢測。免疫學(xué)試驗(yàn)表明，PCV1病毒與PCV2病毒有明顯的交叉反應(yīng)。因此，檢測PCV2感染的關(guān)鍵技術(shù)在于如何盡可能地排除PCV1的干擾。研究表明，PCV2基因組有兩個(gè)主要閱讀框0RF1和0RF2。0RF1編碼與病毒復(fù)制有關(guān)的R印蛋白，0RF2編碼的結(jié)構(gòu)蛋白Cap蛋白是病毒的主要免疫原性物質(zhì)，并含有型特異性的抗原表位，這些表位在Cap蛋白65位87位，113位139位和193位207位氨基酸區(qū)域內(nèi)。因此，0RF2編碼的C即蛋白最有希望用于PCV2抗體的特異性檢測。但是，國內(nèi)外研究表明，PCV1和PCV2的Cap蛋白的氨基酸序列同源性為62X，兩者的部分抗原表位相同。此前，國內(nèi)外運(yùn)用基因工程技術(shù)獲得的重組表達(dá)PCV2C印蛋白，可以檢測出PCV2抗體，但未見重組PCV2Cap蛋白與PCVl抗體的交叉試驗(yàn)數(shù)據(jù)。實(shí)際應(yīng)用表明，用這種表達(dá)蛋白作為抗原來檢測PCV2抗體，其結(jié)果與豬群實(shí)際發(fā)病情況及病原學(xué)診斷結(jié)果往往出現(xiàn)較大差異，存在較多的假陽性結(jié)果。申請人研究發(fā)現(xiàn)，重組表達(dá)的PCV2Cap蛋白(包括截短的Cap蛋白及以此開發(fā)的試劑盒)，與PCV1抗體有明顯的交叉反應(yīng)，因此，檢測結(jié)果會(huì)受到PCV1的干擾。這是由于重組表達(dá)的PCV2C即蛋白肽鏈較長(長度一般在30個(gè)氨基酸以上)，其中包含與PCV1相似的抗原表位。為了尋找更為特異的PCV2抗體檢測方法，盡量排除普遍存在的PCV1抗體的交叉干擾，申請人針對我國流行的PCV2毒株的Cap蛋白氨基酸序列，采用人工合成肽技術(shù)，合成了多條備選的短肽(長度在20個(gè)氨基酸以下)，并與KLH血蘭素蛋白偶聯(lián)，制成大分子偶聯(lián)抗原;采用PCV1和PCV2分別感染實(shí)驗(yàn)豬，制備了可靠的PCV1血清抗體和PCV2血清抗體；在此基礎(chǔ)上，用ELISA方法篩選出型特異好、反應(yīng)活性優(yōu)良的合成肽偶聯(lián)抗原PCV2-Mix;用PCV2-Mix抗原研制成檢測PCV2抗體的ELISA試劑盒和免疫微球快速檢測試劑。原有的重組表達(dá)PCV2Cap蛋白抗原及基于重組抗原的PCV2抗體檢測試劑，存在以下技術(shù)缺陷1、重組表達(dá)的PCV2Cap蛋白抗原與PCVl抗體存在交叉反應(yīng)，因此，用重組抗原檢測PCV2抗體，會(huì)受到普遍存在的PCV1感染的影響，出現(xiàn)大量的假陽性結(jié)果；2、重組的PCV2Cap蛋白抗原含有表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞等雜質(zhì)成份，遠(yuǎn)不如合成肽抗原純凈，容易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)，需要用較高的提純工藝來降低非特異反應(yīng)。3、表達(dá)的重組PCV2Cap蛋白抗原，批次之間質(zhì)量的穩(wěn)定性受多種因素影響，不易控制，不如用儀器自動(dòng)化生產(chǎn)的合成肽抗原的質(zhì)量均一。因此，采用經(jīng)篩選獲得的人工合成短肽，制備合成肽偶聯(lián)抗原，研制高度特異的PCV2抗體檢測試劑，具有良好的應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能特異性地檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體的合成肽偶聯(lián)抗原(命名為PCV2-Mix)以及使用該抗原制成的ELISA試劑盒和免疫微球快速檢測試劑，其特異性優(yōu)于常見的重組表達(dá)PCV2Cap蛋白抗原及其試劑盒。本發(fā)明提供的合成肽偶聯(lián)抗原PCV2-Mix包含以下氨基酸序列或其截短序列的多肽，以及載體蛋白。SEQIDN0:1:TrpAlaValAspMetMetArgpHeAsnlieAsnAsppHeLeuProProGlyGlyGlySerSEQIDN0:2:AspArgGlyValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaThrSEQIDN0:3:AspArgGlyValGlySerThrAlaVallieLeuAspAspAsnpHepHeProLysAlaSerSEQIDN0:4:SerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeVal進(jìn)一步地，載體蛋白優(yōu)選KLH血蘭素蛋白。本發(fā)明提供的檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體的ELISA試劑盒，其中包含合成肽偶聯(lián)抗原PCV2-Mix包被的ELISA反應(yīng)板，進(jìn)一步地包括ELISA試劑盒常用的其他組分如樣品稀釋液、酶結(jié)合物、洗滌液、底物溶液和終止液。本發(fā)明提供的檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體的免疫微球快速檢測試劑，其中包含合成肽偶聯(lián)抗原PCV2-Mix和微球顆粒(可以是金屬顆粒、塑膠微粒)，進(jìn)一步包括免疫學(xué)試劑常用的其他組分如樣品稀釋液、纖維素膜等組分。本申請還提供一種制備豬圓環(huán)病毒2型合成肽偶聯(lián)抗原PCV2-Mix的方法。本申請還涉及上述合成肽偶聯(lián)抗原在制備檢測豬圓環(huán)病毒2型感染的試劑盒中的應(yīng)用。本申請還涉及上述合成肽偶聯(lián)抗原在制備檢測豬圓環(huán)病毒2型感染的免疫微球凝集試劑中的應(yīng)用。本申請還涉及上述合成肽偶聯(lián)抗原在制備檢測豬圓環(huán)病毒2型感染的免疫微球快速檢測試紙條中的應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)途徑實(shí)現(xiàn)的一、所用材料和試劑1、兔抗豬酶標(biāo)抗體辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗豬IgQ，購自Sigma公司；2、ELISA板96孔聚苯乙烯微量反應(yīng)板，購自廈門怡新美公司；3、膠體金按《現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》第二版(湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2002年1月)所述方法制備；4、塑膠微粒直徑約l陶的聚苯乙烯膠乳微粒，見《現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》第二版。二、短肽合成參考國內(nèi)外檢測到的PCV-20RF2的基因序列，推導(dǎo)0RF2的氨基酸序列，并用計(jì)算機(jī)輔助分析其主要抗原表位，設(shè)計(jì)多肽的氨基酸序列。多肽采用FMOC固相合成法，參見《現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》第二版和《多肽的固相合成法研究進(jìn)展》(安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006年22期)，由多肽合成儀自動(dòng)完成。其合成過程包括(1)氨基酸活化；(2)去F-nioc保護(hù)反應(yīng)；(3)肽鏈合成反應(yīng)；(4)純化；(5)與固相載體分離；(6)凍干保存。三、制備偶聯(lián)抗原采用戊二醛偶聯(lián)法制備偶聯(lián)抗原(參見《現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》第二版)。取載體蛋白和多肽，共同溶解在硼酸溶液中，加入戊二醛溶液混合后反應(yīng)2h，再加甘氨酸溶液封閉未反應(yīng)的戊二醛，然后用硼酸透析純化。四、篩選偶聯(lián)抗原用PCV1、PCV2標(biāo)準(zhǔn)毒株分別感染SPF試驗(yàn)豬，在感染后0、7、14、21、35、49天采集豬血清,作為評價(jià)用血清。將制備的所有偶聯(lián)抗原，包被在ELISA板上，分別與PCV1、PCV2感染豬血清反應(yīng)，用兔抗豬酶標(biāo)抗體和TMB(四甲基聯(lián)苯胺)底物進(jìn)行檢測，篩選出4個(gè)反應(yīng)活性較好、能明確區(qū)分PCV1、PCV2感染的偶聯(lián)抗原。將篩選出的偶聯(lián)抗原按等體積混合，獲得偶聯(lián)抗原PCV2-Mix。五、制備ELISA試劑盒將偶聯(lián)抗原PCV2-Mix包被ELISA板，并用兔抗豬酶標(biāo)抗體作為第二抗體，經(jīng)方陣試驗(yàn)優(yōu)ELISA反應(yīng)體系，建立了檢測PCV-2抗體的間接ELISA方法。用該方法檢測PCV-1和PCV-2人工感染豬，測定抗體消長曲線，結(jié)果表明，與基因工程表達(dá)的抗原介導(dǎo)的ELISA相比，該合成肽抗原ELISA方法能特異地檢測PCV-2血清抗體，與PCV-1陽性血清無交叉反應(yīng)，可用于兩者的鑒別檢測。將配制好的ELISA反應(yīng)試劑，包括合成肽偶聯(lián)抗原PCV2-Mix包被的ELISA反應(yīng)板，以及ELISA試劑盒常用的其他組分樣品稀釋液、酶結(jié)合物、洗滌液、底物溶液和終止液按一定的規(guī)格分裝、包裝，加入說明書，組裝成試劑盒。六、制備免疫微球快速檢測試劑方法l制備免疫微球凝集試劑將PCV2-Mix包被到膠體金或塑膠微粒表面，在緩沖液中制成均勻的懸液。該懸液可以作為凝集抗原試劑，與被檢血清混合后，通過觀察懸液中是否產(chǎn)生凝集塊，判定血清中是否存在PCV2抗體。該試劑可與PCV2陰性、陽性對照血清配套使用。方法2制備免疫微球快速檢測試紙條制備結(jié)合物墊將PCV2-Mix包被到膠體金或塑膠微粒表面，在緩沖液中制成均勻的懸液，將標(biāo)記好的膠體金結(jié)合物均勻地噴在條狀的玻璃纖維膜上，冷凍干燥。噴制檢測膜在同一塊硝酸纖維膜上，用Bio-dotXYZ3000噴膜機(jī)將稀釋好的兔抗豬IgG噴成檢測線(T帶)，在間隔210mm處，平行地噴上PCV2抗體作為質(zhì)控線(C帶)。放于溫箱內(nèi)干燥，取出后密封保存?zhèn)溆?。組裝試紙條將樣品吸收墊(玻璃纖維膜)、結(jié)合物墊、噴有檢測線(T帶)和對照線(C帶)的硝酸纖維素膜、吸收墊(吸水紙)依次粘貼在PVC底板(PVC等硬質(zhì)薄板)上，用Bio-dot切割機(jī)將組裝好的試紙切成36mrn寬的試紙條，裝入有干燥劑的鋁箔袋內(nèi)，密封，室溫保存。七、PCV2抗體檢測方法方法lELISA檢測方法取豬全血樣品，按常規(guī)方法分離血清，在稀釋板上稀釋待檢血清。分別在ELISA板相應(yīng)孔中加入陽性對照血清、陰性對照血清、稀釋好的待檢豬血清。置2038。C孵育3060分鐘；棄去各孔中液體，洗滌；每孔加入酶結(jié)合物液100uL，貼上封板膜，置2038t;孵育3060分鐘；棄去各孔中液體，洗滌；每孔加入底物液A50100uL，再加入底物液B50100uL，置2038。C避光顯色1015分鐘；每孔加入終止液50100uL，用酶標(biāo)儀測定各孔的吸光度值，根據(jù)吸光度值判定結(jié)果。方法2免疫微球凝集試驗(yàn)取豬全血樣品，按常規(guī)方法分離血清。取凝集抗原一滴、被檢血清一滴，充分混合后，在20分鐘內(nèi)觀察懸液中是否產(chǎn)生凝集塊。出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊，判定血清中存在PCV2抗體，說明豬被PCV2感染；否則，判定血清中不存在PCV2抗體，說明豬未被感染或在急性感染期。方法3快速檢測試紙條取豬全血樣品，按常規(guī)方法分離血清。取被檢血清一滴，滴在試紙條的樣品吸收墊上，在20分鐘內(nèi)觀察紙條上是否同時(shí)出現(xiàn)檢測線和對照線。同時(shí)出現(xiàn)檢測線和對照線，判定血清中存在PCV2抗體，說明豬被PCV2感染；僅出現(xiàn)對照線，判定血清中不存在PCV2抗體，說明豬未被感染或在急性感染期；對照線未出現(xiàn)，判定試驗(yàn)失敗，可能是試劑失效。下列實(shí)施方式僅用于舉例說明本發(fā)明的目的，但不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。附圖1試紙條組裝方式示意圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1備選短肽合成參考國內(nèi)外檢測到的PCV-20RF2的基因序列，推導(dǎo)0RF2的一級結(jié)構(gòu)氨基酸序列，并用計(jì)算機(jī)輔助分析其主要抗原表位，設(shè)計(jì)一系列的多肽氨基酸序列。包括SEQIDNO:5SEQIDNO:26.SEQIDNO:5:TrpAlaValAspMetMetArgpHeAsnlieAsnAsppHeLeuProProGlyGlyGlySerSEQIDNO:6:TrpAlaValAspMetMetArgpHeAsnlieAsnA印pHeValProProGlyGlyGlyThrSEQIDNO:7:TrpAlaValAspMetMetArgpHeAsnlieAsnAsppHeLeuProProGlySEQIDNO:8:TrpAlaValAspMetMetArgpHeAsnlieAsnAsppHeLeuSEQIDNO:9:TrpAlaValAspMetMetArgpHeAsnlieAsnSEQIDNO:10:AspMetMetArgpHeAsnlieAsnAsppHeLeuProProGlyGlyGlySerSEQIDNO:11:ArgpHeAsnlieAsnAsppHeLeuProProGlyGlyGlySerSEQIDNO:12:lieAsnAsppHeLeuProProGlyGlyGlySerSEQIDNO:13:AspArgGlyValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaSEQIDNO:14:AspArgGlyValGlySerThrAlaVallieLeuAspAspAsnpHepHeProLysAlaSEQIDNO:15:AspArgGlyValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrSEQIDNO:16:AspArgGlyValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnSEQIDNO:17:AspArgGlyValGlySerSerAlaVallieLeuSEQIDNO:18:ValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaThrSEQIDNO:19:SerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaThrSEQIDNO:20:lieLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaThrSEQIDNO:21:ArgGlyValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaSEQIDNO:22:GlyValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrLysSEQIDNO:23:ValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrSEQIDNO:24:GlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValSEQIDNO:25:SerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValSEQIDNO:26:GlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHe多肽采用F-moc固相合成法，由多肽合成儀自動(dòng)完成，其合成過程如下1、氨基酸活化氨基酸與1-羥基苯并三唑(簡稱HOBT)合成氨基酸-HOBT酉旨。2、去保護(hù)反應(yīng)用哌啶清洗氨基酸-OBTE酯數(shù)次，以除去F-moc保護(hù)基。用二氮己環(huán)(醒P)清洗，除去殘余的哌啶。3、合成反應(yīng)啟動(dòng)多肽合成儀自動(dòng)合成程序，儀器自動(dòng)加入活化的氨基酸與二異丙基碳二亞膠至反應(yīng)器中，合成的過程是由C端開始至N端，依照上述序列不斷地重復(fù)合成步驟。反應(yīng)完成后，用醒P清洗，以除去殘余的氨基酸。4、純化加入2.5%乙酰咪唑，對未合成的肽鏈進(jìn)行乙?；幚恚K止多余的肽鏈生成，并使肽鏈純化。用NMP清洗，除去剩余的乙酰咪唑。按步驟2的方法，除去多肽氨基酸端的F-moc保護(hù)基。用隨P洗滌固相板，干燥備用。5、多肽與固相載體分離反應(yīng)配制含90%三氟乙酸(TFA)、4%異硫氨酸丙酯、5%苯酚和1%去離子水的反應(yīng)溶液。將干燥的肽一樹脂放入玻璃燒杯內(nèi)。將反應(yīng)溶液緩慢加入燒杯內(nèi)，勻速攪拌。將燒杯置O'C下反應(yīng)10分鐘，反應(yīng)結(jié)束后取出，置室溫下，使其逐漸恢復(fù)至室溫(2025°C)。用分液漏斗將TFA/肽混合物從樹脂中萃取出來。利用真空揮發(fā)技術(shù)將TFA及其余保護(hù)試劑分離除去。將所有成分移至漏斗內(nèi)，用叔丁基甲醚及二乙醚洗滌肽，以除去保護(hù)劑及其它雜質(zhì)。6、凍干及保存將多肽在真空干燥機(jī)中冷凍干燥3日，形成凍干品，-2(TC保存。用此方法，共合成22條短肽。實(shí)施例2偶聯(lián)抗原制備采用戊二醛偶聯(lián)法制備偶聯(lián)抗原，具體方法如下-1、取載體蛋白10mg，以0.lmol/LpH10的硼酸溶液充分溶解，加入多肽15mg混勻；2、邊振蕩邊加新鮮配制的0.3%(V/V)戊二酸溶液,室溫作用2h，倒轉(zhuǎn)試管數(shù)次；3、加lmol/L甘氨酸，以封閉未反應(yīng)的戊二醛，繼續(xù)反應(yīng)30min;4、0.lmol/LpH8.5的硼酸透析過夜，換透析液，繼續(xù)透析4h，-20。C保存?zhèn)溆?。用此方法，將?shí)施例1的22個(gè)多肽制備成22個(gè)偶聯(lián)抗原備選。實(shí)施例3篩選和制備PCV2-Mix偶聯(lián)抗原陽性血清制備取PCV抗原及抗體陰性的SPF試驗(yàn)豬10頭，分成5頭/組，各組分別隔離飼養(yǎng)。用PCV1、PCV2標(biāo)準(zhǔn)毒株分別感染一組豬(5頭)，在感染后0、7、14、21、35、49天采集豬血清，作為評價(jià)抗原用的血清。用ELISA試驗(yàn)方法篩選抗原用PH9.6的碳酸鹽緩沖液，將備選的偶聯(lián)抗原稀釋成5Pg/mL，分別包被ELISA板，25X:過夜反應(yīng)。將不同時(shí)間采集的豬血清,用含2%BSA的PBST(0.02mol/L,PH7.2)稀釋5倍，按每孔加入IOO化的量，分別加入到各種ELISA抗原板中，37。C反應(yīng)60分鐘。PBST洗板5次。用含2%BSA的PBST按1:10000稀釋兔抗豬酶標(biāo)抗體，每孔加入IOO叱,37°C反應(yīng)60分鐘。PBST洗板5次。每孔加入TMB底物IOOML，37。C顯色反應(yīng)15分鐘。每孔加入50叱2mol/L^04終止反應(yīng)。結(jié)果篩選出4個(gè)反應(yīng)活性較好、能明確區(qū)分PCV1、PCV2感染的偶聯(lián)抗原(PC1、PC9、PC10、PC21)。將篩選出的偶聯(lián)抗原按等體積混合，獲得偶聯(lián)抗原PCV2-Mix。篩選出4個(gè)偶聯(lián)抗原檢測5頭PCV1感染豬的血清，結(jié)果均為陰性；檢測PCV2感染豬的血清結(jié)果見表l:表14個(gè)偶聯(lián)抗原在感染后不同時(shí)間對PCV2抗體的檢出比例<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>ProGlyGlyGlySerPC90/51/52/54/55/55/5AspArgGlyValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaThrPC100/51/53/53/54/54/5AspArgGlyValGlySerThrAlaVallieLeuAspAspAsnpHepHeProLysAlaSerPC210/51/52/53/55/55/5SerSerAlsVallieLeuAspAspAsnpHeVal實(shí)施例4用偶聯(lián)抗原PCV2-Mix制備ELISA試劑盒1、建立ELISA方法將偶聯(lián)抗原PCV2-Mix包被微量反應(yīng)板，并用兔抗豬酶標(biāo)抗體作為第二抗體，經(jīng)ELISA方陣試驗(yàn)，優(yōu)選ELISA反應(yīng)體系，建立了檢測PCV_2抗體的間接ELISA方法。確定的ELISA反應(yīng)體系如下PCV2-Mix抗原板制備方法用PH9.6的碳酸鹽緩沖液，將PCV2-Mix抗原稀釋成5Pg/mL，按lOO^L/孔的量包被ELISA板，在室溫下(2030°C)過夜反應(yīng)。用含2%BSA的PBST(0.02mol/L,PH7.2)在室溫下(2030°C)過夜封閉。棄去ELISA板中的封閉液，PBST洗滌一次，室溫下充分晾干，裝入鋁箔袋，密封保存。ELISA反應(yīng)條件將被檢豬血清用樣品稀釋液作5倍稀釋，按100化/孔的量，分別加入到PCV2-Mix抗原板中，同時(shí)設(shè)立PCV2陰性和PCV2陽性豬血清對照孔，37。C反應(yīng)30分鐘。PBST洗板5次。按100A/孔加入兔抗豬酶標(biāo)抗體溶液，37'C反應(yīng)30分鐘。PBST洗板5次。每孔加入TMB底物A溶液和B溶液各50A，37'C顯色反應(yīng)15分鐘。每孔加入終止液50化。在酶標(biāo)儀上，測定ELISA板孔的0D450nm值。判定結(jié)果被檢樣品0D450值<陽性對照孔OD450nm值XO.25，為PCV-2抗體陰性；樣品OD450值》陽性對照孔OD450nm值XO.25，為PCV-2抗體陽性。2、溶液配制PCV2陰性豬血清無菌采集SPF豬的血液，分離血清，56。C滅活30分鐘。用0.2pm濾膜濾過，無菌分裝，每瓶1.2mL;PCV2陽性豬血清取感染后1428天的5頭豬的血清等體積混合均勻，進(jìn)行系列稀釋后用ELISA方法檢測，選擇0D450nm值在1.5左右的稀釋度，用0.2pm濾膜過濾，無菌分裝，每瓶1.2mL;樣品稀釋液0.02mol/L,PH7.2PBST含2%BSA，加入萬分之一疊氮鈉，分裝成每瓶15mL;20倍PBST濃縮洗滌液的制備稱取Na2HP04358.1g，KH2P0424.5g，NaCl818.2g，KC120.1g，硫柳汞5g，加入4000mL去離子水，用磁力攪拌器混合，使其充分溶解，加入100mLTween20，再加水定容至5000mL用，分裝成每瓶30.0mL。使用時(shí)稀釋20倍。兔抗豬酶標(biāo)抗體溶液用0.02mol/L,PH7.2PBST含2%BSA的溶液，按1:10000稀釋兔抗豬酶標(biāo)抗體(Sigma公司產(chǎn)品)，加入萬分之一疊氮鈉，分裝成每瓶12mL;TMB底物A溶液往容器內(nèi)依次加入1000mL甲醇和5g3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯膠(TMB)，混合均勻，分裝成每瓶8.0mL;TMB底物B溶液往容器內(nèi)加入600mL的無菌去離子水，持續(xù)攪拌的同時(shí)，加入16.7g醋酸鈉、2g檸檬酸和3.4g過氧化脲，混合溶解后，用去離子水定容至1000mL，分裝成每瓶8.0mL;終止液用去離子水將硫酸稀釋成2mol/L，分裝成每瓶8.0mL。3、組裝ELISA試劑盒將配制好的ELISA反應(yīng)試劑各組分，按表2組裝成試劑盒。組裝試劑盒的環(huán)境必須潔凈無塵，室溫應(yīng)低于25t:，組裝好的試劑盒應(yīng)及時(shí)放入4'C冰庫保存。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例5制備免疫微球(膠體金)凝集試劑將PCV2-Mix包被到膠體金微粒表面，在緩沖液中制成均勻的懸液。具體方法為取2ml的WHAuC14溶液加熱沸騰，加入2.5ml的1%檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱5min，冷卻后于4'C保存?zhèn)溆?。?ixl/ml的量加入0.2mol/LK2C03，攪拌10min。用0.01MpH7.4PBS稀釋PCV2-Mix多肽抗原，按3.75ug/ml的量加入膠體金溶液中，繼續(xù)攪拌30min。按5u1/ml的量加入20%BSA水溶液，攪拌5min;按10"1/ml加入腦PEG20000水溶液，攪拌5min，4"C靜置過夜。以17000rpm離心20min，再用懸浮液(含5%BSA、5%PVP40的PBST溶液)懸浮至原體積的1/2。該懸液可以作為凝集抗原試劑，與被檢血清混合后，通過觀察懸液中是否產(chǎn)生凝集塊，判定血清中是否存在PCV2抗體。該試劑可與PCV2陰性、陽性對照血清配套使用。以塑膠顆粒為載體時(shí)，按《現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(第二版)，采用常規(guī)的EDCI法將PCV2-Mix多肽抗原與塑膠顆粒連接，用懸浮液(含5%BSA、5%PVP40的PBST溶液)制成懸液。實(shí)施例6制備免疫微球(膠體金)快速檢測試紙條制備結(jié)合物墊將PCV2-Mix包被到膠體金微粒表面，在緩沖液中制成均勻的懸液，將標(biāo)記好的膠體金結(jié)合物均勻地噴在條狀的玻璃纖維膜上，冷凍干燥。噴制檢測膜在同一塊硝酸纖維膜上，用Bio-dotXYZ3000噴膜機(jī)將稀釋好的兔抗豬IgG噴成檢測線，在間隔37mm處，平行地噴上PCV2抗體作為質(zhì)控線。放于溫箱內(nèi)干燥，取出后密封保存?zhèn)溆谩＝M裝試紙條按圖1所示的方式，將樣品吸收墊(玻璃纖維膜)、結(jié)合物墊、噴有檢測線(T帶)和對照線(C帶)的硝酸纖維素膜、吸收墊(吸水紙)依次粘貼在PVC底板(PVC等硬質(zhì)薄板)上，用Bio-dot切割機(jī)將組裝好的試紙切成36m寬的試紙條，裝入有干燥劑的鋁箔袋內(nèi)，密封，室溫保存。實(shí)施例7合成肽偶聯(lián)試劑與市售重組抗原試劑的應(yīng)用效果比較1.被檢血清采用實(shí)施實(shí)例3中制備的，PCV1、PCV2標(biāo)準(zhǔn)毒株分別感染5頭豬、在其后0、7、14、21、35、49天采集的豬血清，作為被檢血清。2.試劑偶聯(lián)抗原PCV2-Mix制備的ELISA試劑盒、免疫膠體金凝集試劑、免疫膠體金快速檢測試紙條；市售重組表達(dá)PCV2C即蛋白抗原制備的ELISA試劑盒。3.檢測方法(1)用偶聯(lián)抗原PCV2-Mix制備的ELISA試劑盒來檢測洗滌液配制使用前將20倍PBST濃縮洗滌液恢復(fù)至室溫，并搖動(dòng)使沉淀的鹽溶解，然后用去離子水或雙蒸水作20倍稀釋。洗滌工作液應(yīng)在配制后盡快使用，在28"C下可保存2d，再次使用時(shí)應(yīng)恢復(fù)到室溫。樣品稀釋取出試劑盒中提供的樣品稀釋板，在稀釋板孔中按1:5的體積比稀釋待檢血清(120uL樣品稀釋液+30uL待檢血清)和對照豬血清。操作步驟①剪開抗原反應(yīng)板的包裝袋，取出PCV2-Mix抗原板，在記錄表上記錄陽性對照、陰性對照和樣品的位置。②別在相應(yīng)孔中加入PCV2陰性豬血清對照(2孔)原液和PCV2陽性豬血清對照(2孔)、稀釋好的待檢血清各100iiL。充分混勻后，貼上封板膜，置37D孵育30分鐘。③小心揭掉封板膜，棄去各孔中液體、拍凈。每孔加滿洗滌液，靜置約30秒，重復(fù)洗滌5次，最后在吸水紙上拍凈。④每孔加入兔抗豬酶標(biāo)抗體100uL，貼上封板膜，置37'C，孵育30分鐘；⑤重復(fù)步驟③。(D每孔加入TMB底物A溶液50uL，再加入TMB底物B溶液50uL，輕振混勻，置37'C避光顯色15分鐘。⑦每孔加入終止液50uL,輕振混勻，立即置酶標(biāo)儀450nm波長處測定各孔A450nm值(注意加終止液后應(yīng)在15分鐘內(nèi)讀取A450nm值)。判定結(jié)果a.試驗(yàn)結(jié)果同時(shí)符合下列條件，方為有效①兩孔陰性對照A450nm平均值應(yīng)<0.15;②每孔陽性對照A450nm值均》0.60;b.臨界值的計(jì)算臨界值=陽性對照孔A450nm均值XO.25c.結(jié)果判定①被檢樣品A450nm值<臨界值，判為PCV-2抗體陰性；②樣品A450nm值》臨界值，判為PCV-2抗體陽性。(2)用免疫膠體金凝集試劑檢測操作方法用一次性塑料吸管，吸取凝集抗原一滴(約30uL)、被檢血清一滴(約30uL)，用一次性牙簽在玻片上攪拌，充分混合，在20分鐘內(nèi)觀察懸液中是否產(chǎn)生凝集塊。同時(shí)設(shè)陰性、陽性血清對照。判定方法當(dāng)陰性、陽性血清對照成立，樣品出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊，判定血清中存在PCV2抗體，說明豬被PCV2感染；否則，判定血清中不存在PCV2抗體，說明豬未被感染或處在急性感染期。(3)用免疫膠體金快速檢測試紙條檢測操作方法用一次性塑料吸管，吸取被檢血清一滴(約100UL)，滴在試紙條的樣品吸收墊上，在20分鐘內(nèi)觀察紙條上是否同時(shí)出現(xiàn)檢測線和對照線。判定方法同時(shí)出現(xiàn)檢測線和對照線，判定血清中存在PCV2抗體，說明豬被PCV2感染；僅出現(xiàn)對照線，判定血清中不存在PCV2抗體，說明豬未被感染或處在急性感染期；未出現(xiàn)對照線，判定試驗(yàn)失敗，可能是試劑失效。(4)用市售重組表達(dá)PCV2Cap蛋白抗原制備的ELISA試劑盒檢測市售ELISA試劑盒購自北京測迪生物技術(shù)公司，按試劑盒的說明書操作、判定結(jié)果。4.檢測結(jié)果四種試劑盒對PCV1、PCV2感染豬的檢測結(jié)果見表3、表4。特異性比較從對PCV1、PCV2感染豬的檢測結(jié)果來看，市售重組表達(dá)PCV2C邵蛋白抗原制備的ELISA試劑盒，能檢出PCV1、PCV2感染，因此與PCV1存在交叉反應(yīng)；偶聯(lián)抗原PCV2-Mix制備的ELISA試劑盒、免疫膠體金凝集試劑、免疫膠體金快速檢測試紙條僅能檢出PCV2感染，因此特異性較好。敏感性比較從PCV2感染后不同時(shí)間的檢出結(jié)果來看，重組表達(dá)PCV2C鄰蛋白抗原制備的ELISA試劑盒與偶聯(lián)抗原PCV2-Mix制備的ELISA試劑盒敏感性相似；免疫膠體金凝集試劑、免疫膠體金快速檢測試紙條的檢出時(shí)間較晚，因此敏感性較低。但后者具有操作簡單、適合在現(xiàn)場操作的優(yōu)點(diǎn)。表3各種試劑盒在PCV1感染后不同吋間的檢出情況<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>〈110〉中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心〈120〉一種檢測豬圓環(huán)病毒2型特異性抗體的合成肽偶聯(lián)抗原及試劑〈160〉4〈170〉PatentInVersion3.0〈210〉1〈211〉20〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉1TrpAlaValAspMetMetArgpHeAsnlieAsnAsppHeLeuProProGlyGlyGlySer〈210〉2〈211〉20〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉2AspArgGlyValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaThr〈210〉2〈211〉20〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉3AspArgGlyValGlySerThrAlaVallieLeuAspAspAsnpHepHeProLysAlaSer〈210〉2〈211〉11〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉4SerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeVal權(quán)利要求1、一種豬圓環(huán)病毒2型的合成肽偶聯(lián)抗原，包含載體蛋白和以下氨基酸序列或其截短序列的多肽SEQIDNO1TrpAlaValAspMetMetArgpHeAsnIleAsnAsppHeLeuProProGlyGlyGlySerSEQIDNO2AspArgGlyValGlySerSerAlaValIleLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaThrSEQIDNO3AspArgGlyValGlySerThrAlaValIleLeuAspAspAsnpHepHeProLysAlaSerSEQIDNO4SerSerAlaValIleLeuAspAspAsnpHeVal。2.如權(quán)利要求1所述的豬圓環(huán)病毒2型的合成肽偶聯(lián)抗原，其特征在于所述載體蛋白是KLH血蘭素蛋白。3、一種檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體的ELISA試劑盒，其中包含權(quán)利要求l所述的合成肽偶聯(lián)抗原包被的ELISA反應(yīng)板。4、一種豬圓環(huán)病毒2型抗體的免疫微球快速檢測試劑，其中包含權(quán)利要求l所述的合成肽偶聯(lián)抗原和微球顆粒，優(yōu)選微球顆粒是膠體金顆?；蛩苣z微粒。5.如權(quán)利要求4所述的豬圓環(huán)病毒2型抗體的免疫微球快速檢測試劑，其特征在于包括免疫微球凝集試劑或免疫微球快速檢測試紙條。6.如權(quán)利要求1所述的豬圓環(huán)病毒2型的合成肽偶聯(lián)抗原的制備方法，包括(1)按照SEQIDNO:1SEQIDNO:4的氨基酸序列，采用F-moc固相合成法分別合成四條多肽；(2)采用戊二醛偶聯(lián)法，將這四條多肽分別與載體蛋白連接，形成四種偶聯(lián)抗原；(3)將這四種偶聯(lián)抗原按等體積混合，獲得豬圓環(huán)病毒2型的合成肽偶聯(lián)抗原。7、如權(quán)利要求1或2所述的豬圓環(huán)病毒2型的合成肽偶聯(lián)抗原在制備檢測豬圓環(huán)病毒2型感染試劑盒中的用途。8.如權(quán)利要求1或2所述的豬圓環(huán)病毒2型的合成肽偶聯(lián)抗原在制備檢測豬圓環(huán)病毒2型感染免疫微球快速檢測試劑中的用途。全文摘要本申請涉及一種豬圓環(huán)病毒2型的合成肽偶聯(lián)抗原，以及用合成肽偶聯(lián)抗原研制的ELISA試劑盒和免疫微球檢測試劑，用于特異性地檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體。文檔編號(hào)G01N33/569GK101357945SQ200810118570公開日2009年2月4日申請日期2008年8月19日優(yōu)先權(quán)日2008年8月19日發(fā)明者振曹,王傳彬,田克恭,萍金,陳西釗申請人:中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心