專利名稱：用于西羅尼病毒檢測的蛋白質(zhì)芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于西羅尼病毒檢測的蛋白質(zhì)芯片及其制備方法。
背景技術(shù)：
西尼羅病毒(West Nile virus, WNV)于1937年首先在非洲烏干達(dá)的西尼羅地 區(qū)從發(fā)熱患者血清分離到，因此得名，該病毒可以引起發(fā)熱，稱為西尼羅熱。
西尼羅病毒屬于黃病毒科黃病毒屬的B群蟲媒病毒，基因組是由11029個核苷酸 組成的單正鏈RNA。西尼羅病毒最主要的脊柱動物宿主是鳥，帶毒的鳥和患病的鳥 是主要的傳染源和儲存宿主，蚊子尤其庫蚊是最主要的傳播媒介。鳥感染病毒后， 通常不馬上出現(xiàn)臨床癥狀，而是有一個持續(xù)時間長、高滴度的病毒血癥期，此時被 蚊子叮咬后，即可通過感染蚊子而傳播。病毒通過鳥-蚊-鳥的方式傳播，在鳥和蚊 子之間形成循環(huán)鏈，再通過蚊蟲的叮咬偶爾感染人、馬和其它畜禽。人、馬和其他 哺乳動物在被西尼羅病毒感染的蚊蟲叮咬后而發(fā)病，輕者出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛等流感樣 癥狀(西尼羅熱)，重者可表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀(西尼羅腦炎)，甚至死亡。 現(xiàn)有證據(jù)表明，感染病毒的蚊子叮咬人、馬及其它動物后，這些動物成為感染的最 終宿主，不再將病毒傳播給其它動物。
西尼羅病毒廣泛分布于非洲、歐洲、中東、中亞、西亞地區(qū)。近幾年發(fā)生西尼 羅熱腦炎流行的國家有阿爾及利亞、羅馬尼亞、捷克斯洛伐克、剛果共和國、俄羅 斯、以色列等，上世紀(jì)末又傳入北美，并迅速蔓延，幾乎波及到美國各個州，至2005 年6月全美共報告了1. 7萬例人類感染該病毒的病例，650多人死亡。
截至目前我國尚未發(fā)現(xiàn)西尼羅熱或西尼羅病毒腦炎病例的報道，也未在我國分 離到西尼羅病毒。我國周圍國家如以色列等國，已經(jīng)多次發(fā)現(xiàn)西尼羅熱的流行，與 我國北部和西北部接壤的前蘇聯(lián)的一些國家(包括俄羅斯)也發(fā)生過多次西尼羅熱 的流行，極有可能通過各種途徑傳入我國，所以我國存在發(fā)生西尼羅傳染病的巨大 的潛在威脅。特別隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，使得人員往來和國際貿(mào)易、旅游等活 動空前繁榮，大大增加了疾病傳入的可能性，隨時都可能發(fā)生疾病的傳入和流行。 加之我國地域廣闊、環(huán)境多樣、動植物區(qū)系豐富、媒介昆蟲眾多，為西尼羅病毒的 自然循環(huán)提供了必要的宿主、媒介和有利的生境，病毒一旦傳入極易形成循環(huán)圈而
存留下來。此外，已有的研究結(jié)果顯示我國正常人存在西尼羅病毒IgG抗體，近年 也發(fā)現(xiàn)我國局部地區(qū)人群存在較高西尼羅病毒IgG抗體水平，提示我國已經(jīng)存在西 尼羅病毒感染，只是尚未發(fā)現(xiàn)病例。為有效應(yīng)對我國可能發(fā)生的西尼羅病毒感染的 暴發(fā)流行，必須首先建立有效的檢測和防治方法。
目前，西尼羅病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷主要基于病毒分離及核酸分析、血清學(xué)診
斷等實(shí)驗(yàn)技術(shù)。西尼羅病毒的分離與培養(yǎng)需在專業(yè)性的實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)進(jìn)行，如BSL-3 或BSL-4實(shí)驗(yàn)室，并注意生物安全，而我國目前還沒有足夠數(shù)量的符合此生物安全 等級的實(shí)驗(yàn)室。核酸分析一般采用RT-PCR法，從患者的血清、脊髓液中檢出病毒基 因，但由于人、馬等動物為感染的最終宿主，病毒含量低，即便是急性期患者也只 有約40%可檢出病毒基因。血清學(xué)診斷是目前最常用的西尼羅病毒的實(shí)驗(yàn)室臨床檢 驗(yàn)方法，主要利用西尼羅病毒的抗原蛋白與相應(yīng)抗體的特異結(jié)合反應(yīng)來達(dá)到實(shí)驗(yàn)室 診斷的目的。
西尼羅病毒蛋白包括3種結(jié)構(gòu)蛋白(C、 prM/M、 E蛋白)禾口7種非結(jié)構(gòu)蛋白。其 中核衣殼蛋白(C)為一個堿性蛋白并結(jié)合到病毒基因組；糖蛋白E為最重要的免疫 學(xué)結(jié)構(gòu)蛋白，為病毒紅血球凝集素介導(dǎo)病毒-宿主的結(jié)合。E蛋白參與病毒與宿主細(xì) 胞親和、吸附以及細(xì)胞融合過程，是病毒親嗜性以及毒力的主要決定蛋白。prM是成 熟病毒顆粒中M蛋白的前體形式，在病毒釋放前，胞漿內(nèi)的病毒顆粒中含有prM。 prM 有助于E蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中的定位以及空間構(gòu)象的形成，并且防止E蛋白在細(xì)胞漿中 被蛋白酶切割。這三種蛋白均可以在體內(nèi)產(chǎn)生特異性的抗體。
目前血清學(xué)診斷主要采用特異性抗體酶聯(lián)吸附免疫法(ELISA) 。 ELISA具有特 異性較高，操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，在許多疾病流行地區(qū)已被廣泛用于西尼羅病毒感染的 臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
蛋白芯片技術(shù)(Protein-chip)是近年來發(fā)展起來的一項生物學(xué)研究技術(shù)，是一 種特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好的方法，其特出特點(diǎn)在于其具有的高通量，能同 時針對不同抗原或抗原亞基成份的抗體，因而常用于同一類型疾病的篩查或?qū)ふ裔?對不同抗原亞基成份的抗體的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于西羅尼病毒檢測的蛋白質(zhì)芯片及其制備方法。 本發(fā)明提供的檢測西羅尼病毒的蛋白質(zhì)芯片，是在生物芯片片基上固定有至少 一種西尼羅病毒蛋白抗原的生物芯片。所述片基上還可固定有質(zhì)控對照；所述質(zhì)控對照為抗IgG抗體或抗IgM抗體。 所述片基可為任何生物芯片常用片基，如玻璃片基、膜片基、高分子硅片基或
塑料片基，優(yōu)選玻璃片基。為了固定希羅尼病毒抗原，所述片基可經(jīng)過化學(xué)處理，
如玻璃片基經(jīng)過醛基化處理。
所述西尼羅病毒蛋白抗原包括西尼羅病毒C蛋白、西尼羅病毒M蛋白、西尼羅
病毒prM蛋白和西尼羅病毒E蛋白。
所述用于西羅尼病毒檢測的蛋白質(zhì)芯片，具體可為在醛基化的玻璃片基上固定 有西尼羅病毒M蛋白、西尼羅病毒prM蛋白、西尼羅病毒E蛋白和所述質(zhì)控對照的生
物芯片。
本發(fā)明還提供了一種制備西羅尼病毒檢測蛋白質(zhì)芯片的方法，包括如下步驟
1) 用含有甘油的碳酸鹽緩沖液將抗原稀釋至O. 1-1.0 mg/ml;所述碳酸鹽緩沖 液中甘油的含量為30-70%，優(yōu)選50%;所述碳酸鹽緩沖液，濃度為O. 01-0. 2mol/L、 優(yōu)選O. 05mol/L， pH為9. 0—10. 0、優(yōu)選9. 6;
2) 將稀釋后的抗原固定于片基上；
3) 用封閉液將步驟2)的片基進(jìn)行封閉，得到所述蛋白質(zhì)芯片；所述封閉液為 含有O. 01-2% BSA和O. (U-2% Tween 20的PBS溶液，優(yōu)選含有O. 5% BSA和O. 05% Tween 20的PBS溶液;所述PBS溶液，濃度為O. 001-0. 2mol/L、優(yōu)選O. 01mol/L， pH為6. 5-8. 5、 優(yōu)選7.4。
所述步驟2)中還可包括將質(zhì)控對照固化于片基上的步驟；所述質(zhì)控對照為抗 I gG抗體或抗I gM抗體。
所述片基可為任何生物芯片常用片基，如玻璃片基、膜片基、高分子硅片基或 塑料片基，優(yōu)選玻璃片基。為了固定希羅尼病毒抗原，所述片基可經(jīng)過化學(xué)處理， 如玻璃片基可經(jīng)過醛基化處理。
所述西尼羅病毒蛋白抗原包括西尼羅病毒C蛋白、西尼羅病毒M蛋白、西尼羅 病毒prM蛋白和西尼羅病毒E蛋白。
當(dāng)所述固定于基片上的西尼羅病毒蛋白抗原為西尼羅病毒M蛋白、西尼羅病毒 prM蛋白和西尼羅病毒E蛋白時，所述西尼羅病毒E蛋白稀釋后的濃度為 0.005-5. 0mg/ml，優(yōu)選O. 05mg/ml;所述西尼羅病毒prM蛋白稀釋后的濃度為 0.005-5.0mg/ral，優(yōu)選0.04mg/ml;所述西尼羅病毒M蛋白稀釋后的濃度為 0. 005-5. Omg/ml，優(yōu)選O. 2mg/ml。 本發(fā)明還提供了一種西尼羅病毒檢測試劑盒，包括所述的蛋白芯片。
所述試劑盒還可包括稀釋液和洗滌液；所述稀釋液為含有O. 01-2。/。BSA和 0.05-1.0% NaN3的磷酸緩沖液，優(yōu)選含有O. 5XBSA和0. P/。NaN3的磷酸緩沖液；所述 洗滌液為含有O. 001-2%吐溫-20和0. 05-1. 0% NaN3的磷酸緩沖液，優(yōu)選含有O. 05。/0吐 溫-20和0. 1。/。NaN3的磷酸緩沖液。
所述試劑盒中還包括用于顯色反應(yīng)的試劑；所述顯色反應(yīng)為納米金顯色反應(yīng)、 磁珠顯色反應(yīng)、熒光顯色反應(yīng)或酶標(biāo)顯色反應(yīng)。
當(dāng)所述顯色反應(yīng)為酶標(biāo)顯色反應(yīng)時，所述用于顯色反應(yīng)的試劑包括示蹤物和顯 色劑；所述顯色劑為四甲基聯(lián)苯胺顯色液；所述示蹤物為辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗； 所述二抗為抗人IgG抗體或抗人IgM抗體。
所述示蹤物具體可為含5XBSA (質(zhì)量百分比)和0.02%硫柳汞(質(zhì)量百分比) 的辣根過氧化酶標(biāo)記的抗人IgG抗體；所述顯色劑具體可為含O. 005%四甲基聯(lián)苯胺 (質(zhì)量百分比)的醋酸緩沖液(pH3.3)。
所述質(zhì)控對照有兩個作用， 一是作為反應(yīng)定位點(diǎn)，二是作為陽性對照，所述質(zhì) 控對照為抗IgG抗體或抗IgM抗體，視檢測的樣本來源和目標(biāo)而定。比如當(dāng)所述顯色 反應(yīng)為酶標(biāo)顯色反應(yīng)時，所述質(zhì)控對照可為辣根過氧化酶標(biāo)記的抗馬IgG抗體或辣 根過氧化酶標(biāo)記的抗馬IgM抗體，所述質(zhì)控對照優(yōu)選為辣根過氧化酶標(biāo)記的抗人IgG 抗體、辣根過氧化酶標(biāo)記的抗人IgM抗體。
應(yīng)用本發(fā)明提供的蛋白芯片可通過不同的顯色反應(yīng)檢測西尼羅病毒。根據(jù)顯色 反應(yīng)的不同，所述試劑盒可包括不同的顯色反應(yīng)試劑，如納米金、磁珠、熒光試劑 等，不同的顯色劑需與示蹤物的標(biāo)記相匹配，優(yōu)選的示蹤劑為辣根過氧化酶標(biāo)記的 二抗，優(yōu)選的顯色劑為用pH3. 3醋酸緩沖液配制的四甲基聯(lián)苯胺液；
應(yīng)用本發(fā)明提供的試劑盒檢測西羅尼病毒的具體方法如下
1、 標(biāo)本稀釋用稀釋液將血清標(biāo)本l : 21稀釋(即15ul血清標(biāo)本加于300ul稀
釋液中)，混勻。
2、 加樣將所述蛋白芯片拆封并平放于實(shí)驗(yàn)臺上，于每方格中加入300ul已稀 釋的標(biāo)本，注意使標(biāo)本布滿方格。
3、 孵育將芯片置于濕盒中并放置37'C溫育30分鐘，甩去方格內(nèi)液體，于每 格內(nèi)加入4滴洗漆液，停頓l秒鐘后甩掉洗液。連續(xù)洗滌3次，最后用自來水流洗l秒 鐘，甩干后在吸水紙上吸干方格周圍水滴。
4、 加示蹤物每格滴2滴示蹤物，勿溢出方格外。濕盒中37"C溫育30分鐘，同 上法洗滌3次，在吸水紙上吸干周圍水滴。
5、 顯色每格加入2滴顯色劑，37t:孵育箱顯色10-12分鐘。甩去方格內(nèi)液體， 用蒸餾水流洗l秒種。甩干，吸水紙吸干液滴。
6、 結(jié)果判讀在白色背景下觀察各方格內(nèi)顯色情況，陽性顯藍(lán)色點(diǎn)，陰性無
色；或在閱讀儀上進(jìn)行，由軟件自動分析，自動生成藍(lán)色斑點(diǎn)的灰度值，T/cutoff 》1.0為陰性，T/cutoff〈1.0為陽性。
結(jié)果判讀時，需要所有的質(zhì)控點(diǎn)都顯色，否則試驗(yàn)無效。
本發(fā)明將高度純化的基因工程抗原固定于生物芯片片基上，加入患者血清后， 血清中的抗體與片基上的抗原結(jié)合，再加入示蹤物，形成按點(diǎn)樣設(shè)計的圖形， 一次 實(shí)驗(yàn)即可檢測出西尼羅病毒M蛋白、prM蛋白及E蛋白抗體的血清狀況。本發(fā)明具有 省時、高效、高通量平行檢測的優(yōu)點(diǎn)，檢測結(jié)果既可肉眼定性觀察，也可用掃描儀 定量檢測，結(jié)果可永久保存，是傳統(tǒng)檢測方法無可比擬的，是現(xiàn)代生物芯片技術(shù)、 免疫學(xué)技術(shù)和化學(xué)技術(shù)的結(jié)晶。應(yīng)用本發(fā)明的蛋白芯片一方面可以更準(zhǔn)確的對西尼 羅病毒進(jìn)行臨床診斷，另一方面可以直觀的了解西尼羅病毒各蛋白成分在刺激機(jī)體 免疫應(yīng)答方面所起的作用，給亞單位疫苗研制提供理論依據(jù)，也為流行病學(xué)本底調(diào) 查提供技術(shù)支持，為疾病的防治創(chuàng)造前提條件。
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。


圖1為蛋白芯片的點(diǎn)陣排列情況。
圖2為實(shí)施例1的檢測結(jié)果。
圖3為實(shí)施例2的檢測結(jié)果。
圖4為實(shí)施例3的檢測結(jié)果。
圖5為實(shí)施例4的檢測結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例l、對人工gG的檢測
一、西尼羅病毒抗體多片段蛋白芯片的制備
1、材料的準(zhǔn)備
CBS-G溶液含有在50°/。甘油(質(zhì)量百分比)的碳酸鹽緩沖液；所述碳酸鹽緩沖
液的濃度為O. 05mol/L， pH為9. 6;
質(zhì)控對照(辣根過氧化酶標(biāo)記的抗人IgG抗體)購自上海碧云天生物技術(shù)有 限公司(A0201);
西尼羅病毒E蛋白購自美國abcam公司(ab48960); 西尼羅病毒prM蛋白購自美國abcam公司(ab39905); 西尼羅病毒M蛋白購自美國abcam公司(ab39904);
封閉液:含有O. 5%BSA (質(zhì)量百分比)和O. 05% Tween 20 (質(zhì)量百分比)的PBS 溶液；所述PBS溶液的濃度為O. Olmol/L， pH為7. 4。
玻璃基片深圳市賽爾生物技術(shù)有限公司(B-002); 2、蛋白芯片的制備
1) 用CBS-G溶液將E蛋白稀釋至O. 05mg/ml;用CBS-G溶液將prM蛋白稀釋至 0. 04rag/ml;用CBS-G溶液將M蛋白稀釋至O. 2mg/ml;質(zhì)控對照用CBS-G稀釋至
0.5mg/ml;
2) 用生物芯片點(diǎn)樣儀將步驟1稀釋好的3種抗原及質(zhì)控對照固定于醛基化的玻 璃基片上，點(diǎn)樣量為2ul/dot，避光置室溫晾2-3小時；3種抗原及對照的點(diǎn)陣排列 見圖l;圖1中，Al、 Bl、 Cl為質(zhì)控對照，A2和A3為E蛋白抗原、B2和B3為M蛋白抗原， Cl和C2為prM蛋白抗原；
3) 每個點(diǎn)陣加250ul的封閉液，37i:濕盒封閉90分鐘，用蒸餾水洗凈晾干，.得 到蛋白芯片。
共制備50張蛋白芯片。 二、試劑盒的組裝 試劑盒的組成如下 步驟一制備的50張蛋白芯片；
稀釋液含有O. 5%BSA (質(zhì)量百分比)和O. l%NaN3 (質(zhì)量百分比)的磷酸緩沖 液(pH7. 4);
洗滌液含有0.05%吐溫-20 (質(zhì)量百分比)和O. l%NaN3 (質(zhì)量百分比)的磷酸 緩沖液(pH7.4);
示蹤物含5XBSA (質(zhì)量百分比)禾卩0.02%硫柳汞(質(zhì)量百分比)的辣根過氧 化酶標(biāo)記的抗人IgG抗體(購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，A0201);
顯色劑含0.005%四甲基聯(lián)苯胺(質(zhì)量百分比)的醋酸緩沖液(pH3.3);
三、 檢測
1、 血清樣本
50份人血清標(biāo)本，均來自于深圳口岸醫(yī)院查體人員。
2、 檢測
用步驟二制備的試劑盒檢測以上標(biāo)本，每個標(biāo)本用一張蛋白芯片，具體檢測步 驟如下
1、 用稀釋液將血清標(biāo)本l : 21稀釋(即15ul血清標(biāo)本加于300ul稀釋液中)，混勻。
2、 取出蛋白芯片拆封并平放于實(shí)驗(yàn)臺上，于每方格中加入300ul已稀釋的標(biāo)本， 使標(biāo)本布滿方格。
3、 將芯片置于濕盒中，37。C溫育30分鐘，甩去方格內(nèi)液體，于每格內(nèi)加入4滴 洗滌液，停頓l秒鐘后甩掉洗液。連續(xù)洗滌3次，最后用自來水流洗l秒鐘，甩干后 在吸水紙上吸干方格周圍水滴。
4、 每格滴2滴示蹤物，勿溢出方格外。濕盒中37。C溫育30分鐘，同上法洗滌3 次，在吸水紙上吸干周圍水滴。
5、 每格加入2滴顯色劑，37'C孵育箱顯色10-12分鐘。甩去方格內(nèi)液體，用蒸 餾水流洗l秒種。甩干，吸水紙吸干液滴。
部分試驗(yàn)結(jié)果見圖2。
由圖可見，20ft樣本為E蛋白陽性，32財羊本為prM蛋白陽性，47財羊本為prM蛋白 陽性且E蛋白陽性，2雜樣本為陰性。經(jīng)過ELISA驗(yàn)證，檢測結(jié)果正確。
四、 結(jié)果驗(yàn)證
應(yīng)用美國FOCUS Diagnostics公司EL0300G試劑盒檢測步驟三中的50份血清樣 本，按說明書進(jìn)行操作。
結(jié)果顯示，50個樣本中有兩個樣本為陽性，分別是32tt樣本和47共樣本。由于 ELISA試劑盒一般只固化有一種抗原，本發(fā)明的試劑盒的檢測結(jié)果表明32tt樣本和 47共樣品均為prM蛋白陽性，因此可以初步判定FOCUS Diagnostics公司EL0300G試劑 盒是只針對prM檢測的。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 一方面本發(fā)明的試劑盒的檢測結(jié)果是 可靠的，最起碼體現(xiàn)在prM蛋白的檢測上和FOCUS Diagnostics公司EL0300G試劑盒 的檢測結(jié)果是完全一致的；另一方面表明本發(fā)明的試劑盒的檢測優(yōu)于現(xiàn)有的ELISA 試劑檢測，可以同時對三個蛋白進(jìn)行檢測，而ELISA只能針對一種蛋白進(jìn)行檢測。
實(shí)施例2、對人IgM的檢測
一、 西尼羅病毒抗體多片段蛋白芯片的制備
1、 材料的準(zhǔn)備
CBS-G溶液含有在50%甘油(質(zhì)量百分比)的碳酸鹽緩沖液；所述碳酸鹽緩沖
液的濃度為O. 05mol/L， pH為9. 6;
質(zhì)控對照(辣根過氧化酶標(biāo)記的抗人IgM抗體)購自廣州華拓生物科技有限 公司(HT21007);
西尼羅病毒E蛋白購自美國abcam公司(ab48960);
西尼羅病毒prM蛋白購自美國abcam公司(ab39905);
西尼羅病毒M蛋白購自美國abcam公司(ab39904);
封閉液含有O. 5%BSA (質(zhì)量百分比)禾卩O. 05% Tween 20 (質(zhì)量百分比)的PBS 溶液；所述PBS溶液的濃度為O. Olmol/L， pH為7.4。
玻璃基片深圳巿賽爾生物技術(shù)有限公司(B-002);
2、 蛋白芯片的制備
1) 用CBS-G溶液將E蛋白稀釋至0.05mg/ml;用CBS-G溶液將prM蛋白稀釋至 0. 04mg/ml;用CBS-G溶液將M蛋白稀釋至O. 2mg/ml;質(zhì)控對照用CBS-G稀釋至
0. 5nig/ml;
2) 用生物芯片點(diǎn)樣儀將步驟1稀釋好的3種抗原及質(zhì)控對照固定于醛基化的玻 璃基片上，點(diǎn)樣量為2ul/dot，避光置室溫晾2-3小時；3種抗原及對照的點(diǎn)陣排列見 圖l;圖1中，Al、 Bl、 Cl為質(zhì)控對照，A2和A3為E蛋白抗原、B2和B3為M蛋白抗原， Cl和C2為prM蛋白抗原；
3) 每個點(diǎn)陣加250ul的封閉液，37t:濕盒封閉90分鐘，用蒸餾水洗凈晾干，得 到蛋白芯片。
共制備2張蛋白芯片。
二、 試劑盒的組裝 試劑盒的組成如下 步驟一制備的2張蛋白芯片；
稀釋液含有0.5XBSA (質(zhì)量百分比)和O. l%NaN3 (質(zhì)量百分比)的磷酸緩沖 液(pH7, 4);
洗滌液含有0.05%吐溫-20 (質(zhì)量百分比)和O. l%NaN3 (質(zhì)量百分比)的磷酸
緩沖液(pH7.4);
示蹤物含5XBSA (質(zhì)量百分比)和0.02%硫柳汞(質(zhì)量百分比)的辣根過氧 化酶標(biāo)記的抗人IgM抗體(購自廣州華拓生物科技有限公司，HT21007);
顯色劑含0.005%四甲基聯(lián)苯胺(質(zhì)量百分比)的醋酸緩沖液(pH3.3);
分別取2例發(fā)熱癥狀的病人(病人為深圳口岸入境人員)血清，作為樣本l和樣 本2，用步驟二制備的試劑盒檢驗(yàn)。
每個樣本用一張蛋白芯片，具體檢測步驟如下
1、 用稀釋液將血清標(biāo)本l : 21稀釋(即15ul血清標(biāo)本加于300ul稀釋液中)， 混勻。
2、 取出蛋白芯片拆封并平放于實(shí)驗(yàn)臺上，于每方格中加入300ul已稀釋的標(biāo)本， 使標(biāo)本布滿方格。
3、 將芯片置于濕盒中，37'C溫育30分鐘，甩去方格內(nèi)液體，于每格內(nèi)加入4滴 洗滌液，停頓l秒鐘后甩掉洗液。連續(xù)洗滌3次，最后用自來水流洗l秒鐘，甩干后 在吸水紙上吸干方格周圍水滴。
4、 每格滴2滴示蹤物，勿溢出方格外。濕盒中37"溫育30分鐘，同上法洗滌3 次，在吸水紙上吸干周圍水滴。
5、 每格加入2滴顯色劑，37i:孵育箱顯色10-12分鐘。甩去方格內(nèi)液體，用蒸
餾水流洗l秒種。甩干，吸水紙吸干液滴。
結(jié)果見圖3， A代表樣品l; B代表樣品2。表明該兩例病人并未發(fā)生西羅尼病毒 感染。經(jīng)過ELISA驗(yàn)證，檢測結(jié)果正確。
四、結(jié)果驗(yàn)證
應(yīng)用美國FOCUS Diagnostics公司EL0300M試劑盒檢測步驟三中的2份血清樣本， 按說明書進(jìn)行操作。
檢測結(jié)果表明，兩個樣本均為陰性，與本發(fā)明的試劑盒檢測結(jié)果一致。
實(shí)施例3、對人IgG的檢測
一、西尼羅病毒抗體多片段蛋白芯片的制備
1、材料的準(zhǔn)備
CBS-G溶液含有在30%甘油(質(zhì)量百分比)的碳酸鹽緩沖液；所述碳酸鹽緩沖 液的濃度為0.01raol/L， pH為9.0;
質(zhì)控對照(辣根過氧化酶標(biāo)記的抗人IgG抗體)購自上海碧云天生物技術(shù)有 限公司(A0201);
西尼羅病毒E蛋白購自美國abcam公司(ab48960); 西尼羅病毒prM蛋白購自美國abcara公司(ab39905); 西尼羅病毒M蛋白購自美國abcam公司(ab39904);
封閉液含有O. 01% BSA (質(zhì)量百分比)和0.01% Tween 20 (質(zhì)量百分比)的 PBS溶液；所述PBS溶液的濃度為0.001mol/L， pH為6.5。 玻璃基片深圳市賽爾生物技術(shù)有限公司(B-002); 2、蛋白芯片的制備
1) 用CBS-G溶液將E蛋白稀釋至O. 005mg/ml;用CBS-G溶液將prM蛋白稀釋至 0. 005mg/ml;用CBS-G溶液將M蛋白稀釋至O. 005mg/ml;質(zhì)控對照用CBS-G稀釋至 0.005mg/ml;
2) 用生物芯片點(diǎn)樣儀將步驟1稀釋好的3種抗原及質(zhì)控對照固定于醛基化的玻 璃基片上，點(diǎn)樣量為2ul/dot，避光置室溫晾2-3小時；3種抗原及對照的點(diǎn)陣排列 見圖l;圖1中，Al、 Bl、 Cl為質(zhì)控對照，A2和A3為E蛋白抗原、B2和B3為M蛋白抗原， Cl和C2為prM蛋白抗原；
3) 每個點(diǎn)陣加250ul的封閉液，37i:濕盒封閉90分鐘，用蒸餾水洗凈晾干，得 到蛋白芯片。
共制備2張蛋白芯片。
二、 試劑盒的組裝 試劑盒的組成如下 步驟一制備的2張蛋白芯片；
稀釋液含有0.01XBSA (質(zhì)量百分比)禾叫.05。/。NaN:,(質(zhì)量百分比)的磷酸緩 沖液(pH7.4);
洗滌液含有O. 001%吐溫-20 (質(zhì)量百分比)和O. 05%NaN3 (質(zhì)量百分比)的磷 酸緩沖液(pH7.4);
示蹤物含5XBSA (質(zhì)量百分比)和0.02%硫柳汞(質(zhì)量百分比)的辣根過氧 化酶標(biāo)記的抗人IgG抗體(購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，A0201);
顯色劑含0.005%四甲基聯(lián)苯胺(質(zhì)量百分比)的醋酸緩沖液(pH3.3);
三、 檢測
1、 血清樣本
2份人血清標(biāo)本，均來自于深圳口岸醫(yī)院查體人員。 一份為西羅尼病毒陽性標(biāo) 本(美國F0CUS Diagnostics公司EL0300G試劑盒檢測驗(yàn)證)，另一份為西羅尼病毒 陰性標(biāo)本(美國FOCUS Diagnostics公司EL0300G試劑盒檢測驗(yàn)證)。
2、 檢測
同實(shí)施例1的步驟三的2。
檢測結(jié)果見圖4。標(biāo)本l為prM蛋白陽性標(biāo)本(A)，標(biāo)本2為陰性標(biāo)本(B)。
實(shí)施例4、對人IgG的檢測
一、西尼羅病毒抗體多片段蛋白芯片的制備
1、 材料的準(zhǔn)備
CBS-G溶液含有在70%甘油(質(zhì)量百分比)的碳酸鹽緩沖液；所述碳酸鹽緩沖 液的濃度為O. 2mol/L， pH為10. 0;
質(zhì)控對照(辣根過氧化酶標(biāo)記的抗人IgG抗體)購自上海碧云天生物技術(shù)有 限公司(A0201);
西尼羅病毒E蛋白購自美國abcam公司(ab48960);
西尼羅病毒prM蛋白購自美國abcara公司(ab39905);
西尼羅病毒M蛋白購自美國abcam公司(ab39904);
封閉液含有2。/。BSA (質(zhì)量百分比)和2。/。Tween20 (質(zhì)量百分比)的PBS溶液； 所述PBS溶液的濃度為O. 2mol/L， pH為8. 5。
玻璃基片深圳市賽爾生物技術(shù)有限公司(B-002);
2、 蛋白芯片的制備
1) 用CBS-G溶液將E蛋白稀釋至5.0mg/ml;用CBS-G溶液將prM蛋白稀釋至 5.0mg/ml;用CBS-G溶液將M蛋白稀釋至5. Omg/ml;質(zhì)控對照用CBS-G稀釋至
5. Omg/ml;
2) 用生物芯片點(diǎn)樣儀將步驟1稀釋好的3種抗原及質(zhì)控對照固定于醛基化的玻 璃基片上，點(diǎn)樣量為2ul/dot，避光置室溫晾2-3小時；3種抗原及對照的點(diǎn)陣排列 見圖l;圖1中，Al、 Bl、 Cl為質(zhì)控對照，A2和A3為E蛋白抗原、B2和B3為M蛋白抗原， Cl和C2為prM蛋白抗原；
3) 每個點(diǎn)陣加250ul的封閉液，37i:濕盒封閉90分鐘，用蒸餾水洗凈晾干，得 到蛋白芯片。
共制備2張蛋白芯片。 二、試劑盒的組裝 試劑盒的組成如下 步驟一制備的2張蛋白芯片；
稀釋液含有2XBSA (質(zhì)量百分比)禾卩1%嵐仏(質(zhì)量百分比)的磷酸緩沖液 (pH7. 4);
洗滌液含有2%吐溫-20 (質(zhì)量百分比)和P/。NaN3 (質(zhì)量百分比)的磷酸緩沖 液(pH7.4);
示蹤物含5XBSA (質(zhì)量百分比)和0.02%硫柳汞(質(zhì)量百分比)的辣根過氧 化酶標(biāo)記的抗人IgG抗體(購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，A0201);
顯色劑含0.005。/。四甲基聯(lián)苯胺(質(zhì)量百分比)的醋酸緩沖液(pH3.3);
1、 血清樣本
2份人血清標(biāo)本，均來自于深圳口岸醫(yī)院查體人員。 一份為西羅尼病毒陽性標(biāo) 本(美國FOCUS Diagnostics公司EL0300G試劑盒檢測驗(yàn)證)，另一份為西羅尼病毒 陰性標(biāo)本(美國FOCUS Diagnostics公司EL0300G試劑盒檢測驗(yàn)證)。
2、 檢測
同實(shí)施例1的步驟三的2。
檢測結(jié)果見圖5。標(biāo)本l為prM蛋白陽性標(biāo)本(A)，標(biāo)本2為陰性標(biāo)本(B)。 實(shí)施例5、特異性檢測
有研究資料表明，西尼羅病毒與黃熱病毒的其它種類尤其是乙型腦炎和登革熱 在檢測抗體的血清學(xué)反應(yīng)中存在著較為嚴(yán)重的交叉現(xiàn)象。為了驗(yàn)證上述西尼羅病毒 三個蛋白IgG抗體陽性標(biāo)本檢測結(jié)果的可信度，對其進(jìn)行了日本腦炎和登革熱IgG抗 體檢測實(shí)驗(yàn)。
本實(shí)施采用ELISA間接法對50個血清樣本中的三個西尼羅病毒抗體(IgG)陽性 血清樣品(20tt， 32tt， 47#)進(jìn)行檢測，包被抗原采用登革熱病毒NS1蛋白(購自美 國abcam公司，ab64456)和乙型腦炎病毒E蛋白(購自美國abcam公司，ab43031)，
其它反應(yīng)溶液的配方同實(shí)施例l。
1、 將登革熱病毒NS1蛋白(購自美國abcam公司，ab64456)用CBS-G溶液(深 圳市賽爾生物技術(shù)有限公司)稀釋至5ug/ml后包被酶標(biāo)板，4。C過夜；將乙型腦炎
病毒E蛋白(購自美國abcam公司，ab43031)用CBS-G溶液(深圳市賽爾生物技術(shù)有 限公司)稀釋至5ug/ml后包被酶標(biāo)板，4t:過夜。
2、 加入封閉液(深圳市賽爾生物技術(shù)有限公司)，置于4'C過夜。
3、 檢測日本腦炎IgG抗體時將待測標(biāo)本按l: 41用稀釋液(深圳市賽爾生物技 術(shù)有限公司)進(jìn)行稀釋；檢測登革熱IgG抗體時待測標(biāo)本按l: 41用稀釋液(深圳市 賽爾生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行稀釋；小心吸取已稀釋待檢標(biāo)本上清液100ul于反應(yīng)
孔中，同時設(shè)對照如下陰性對照正常人血清100ul (深圳市賽爾生物技術(shù)有限 公司)；陽性對照l:登革熱陽性血清各100ul (深圳市賽爾生物技術(shù)有限公司)； 陽性對照2:乙型腦炎陽性血清100ul (深圳市賽爾生物技術(shù)有限公司)；空白對照
標(biāo)本稀釋液100ul。輕拍混勻后置37。C孵育30分鐘。
4、 用洗滌液(深圳市賽爾生物技術(shù)有限公司)洗滌孔板3次，拍干。加入服P標(biāo) 記的抗人IgG二抗(購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，A0201) ， 100ul/孔。混勻 后置37。C孵育30分鐘。
5、 同步驟4洗板。每孔加100ulTMB(深圳市賽爾生物技術(shù)有限公司)底物顯色， 37'C反應(yīng)10分鐘。
6、 每孔加50ul 2mol/L的H2S04終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀上測定OD450值。
7、 數(shù)據(jù)處理取2. lXNC值做為cutoff值(注NC值不足O. l時以O(shè). l記，大于 0. l時以實(shí)際值記)。
結(jié)果顯示，3例西尼羅病毒抗體(IgG)陽性標(biāo)本的日本腦炎和登革熱的IgG抗體 檢測結(jié)果全為陰性。結(jié)果表明，此3例西尼羅病毒prM蛋白或E蛋白IgG抗體陽性標(biāo)本 與曰本腦炎和登革熱病毒之間沒有交叉反應(yīng)。
權(quán)利要求
1、一種檢測西羅尼病毒的蛋白質(zhì)芯片，是在生物芯片片基上固定有至少一種西尼羅病毒蛋白抗原的生物芯片。
2、 如權(quán)利要求l所述的芯片，其特征在于所述片基上還固定有質(zhì)控對照；所 述質(zhì)控對照為抗IgG抗體或抗IgM抗體。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的芯片，其特征在于所述片基為玻璃片基、膜片基、 高分子硅片基或塑料片基，優(yōu)選玻璃片基；所述西尼羅病毒蛋白抗原包括西尼羅病 毒C蛋白、西尼羅病毒M蛋白、西尼羅病毒prM蛋白和西尼羅病毒E蛋白。
4、 一種制備西羅尼病毒檢測蛋白質(zhì)芯片的方法，包括如下步驟1) 用含有甘油的碳酸鹽緩沖液將抗原稀釋至O. 1-1.0 mg/ral;所述碳酸鹽緩沖液 中甘油的含量為30-70%，優(yōu)選50°/。；所述碳酸鹽緩沖液的濃度為0.01-0.2mol/L，優(yōu)選 0.05mol/L， pH為9. 0—10.0，優(yōu)選9. 6;2) 將稀釋后的抗原固定于片基上；3) 用封閉液將完成步驟2)的片基進(jìn)行封閉，得到所述蛋白質(zhì)芯片；所述封閉液 為含有O. 01-2% BSA和O. 01-2%Tween 20的PBS溶液，優(yōu)選含有O. 5% BSA和O. 05% Tween 20的PBS溶液;所述PBS溶液的濃度為O. 001-0. 2mol/L，優(yōu)選O. 01mol/L， pH為6. 5-8. 5， 優(yōu)選7. 4。
5、 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟2)中還包括將質(zhì)控對照固 化于片基上的步驟；所述質(zhì)控對照為抗IgG抗體或抗IgM抗體；所述片基為玻璃片基、 膜片基、高分子硅片基或塑料片基，優(yōu)選玻璃片基；所述西尼羅病毒蛋白抗原包括 西尼羅病毒C蛋白、西尼羅病毒M蛋白、西尼羅病毒prM蛋白和西尼羅病毒E蛋白。
6、 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述西尼羅病毒E蛋白稀釋后的濃度 為O. 005-5. Omg/ml，優(yōu)選O. 05mg/ml;所述西尼羅病毒prM蛋白稀釋后的濃度為 0.005-5.0mg/ml，優(yōu)選O. 04mg/ml;所述西尼羅病毒M蛋白稀釋后的濃度為0. 005-5. Omg/ml ，優(yōu)選O. 2mg/ml 。
7、 一種西尼羅病毒檢測試劑盒，包括權(quán)利要求1至3中任一所述的蛋白質(zhì)芯片。
8、 如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括稀釋液和洗滌液； 所述稀釋液為含有O. 01-2。/。BSA和0. 05-1. 0% NaN:,的磷酸緩沖液，優(yōu)選含有O. 5XBSA和 0. 1。/oNaN3的磷酸緩沖液；所述洗滌液為含有O. 001-2%吐溫-20和0. 05-1. 0% NaN;,的磷酸 緩沖液，優(yōu)選含有O. 05%吐溫-20和0. r/。NaN3的磷酸緩沖液。
9、 如權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括用于顯色 反應(yīng)的試劑；所述顯色反應(yīng)為納米金顯色反應(yīng)、磁珠顯色反應(yīng)、熒光顯色反應(yīng)或酶標(biāo) 顯色反應(yīng)。
10、如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于所述顯色反應(yīng)為酶標(biāo)顯色反應(yīng)， 所述用于顯色反應(yīng)的試劑為示蹤物和顯色劑；所述顯色劑為四甲基聯(lián)苯胺顯色液；所 述示蹤物為辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗；所述二抗為抗人IgG抗體或抗人IgM抗體；所述示蹤物優(yōu)選為含5XBSA和0.02。/。硫柳汞的辣根過氧化酶標(biāo)記的抗人IgG抗體； 所述顯色劑優(yōu)選為含O. 005%四甲基聯(lián)苯胺的醋酸緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于西羅尼病毒檢測的蛋白質(zhì)芯片及其制備方法。本發(fā)明提供的檢測西羅尼病毒的蛋白質(zhì)芯片，是在生物芯片片基上固定有至少一種西尼羅病毒蛋白抗原的生物芯片。本發(fā)明具有省時、高效、高通量平行檢測的優(yōu)點(diǎn)，檢測結(jié)果既可肉眼定性觀察，也可用掃描儀定量檢測，結(jié)果可永久保存，是傳統(tǒng)檢測方法無可比擬的，是現(xiàn)代生物芯片技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)和化學(xué)技術(shù)的結(jié)晶。應(yīng)用本發(fā)明的蛋白芯片一方面可以更準(zhǔn)確的對西尼羅病毒進(jìn)行臨床診斷，另一方面可以直觀的了解西尼羅病毒各蛋白成分在刺激機(jī)體免疫應(yīng)答方面所起的作用，給亞單位疫苗研制提供理論依據(jù)，也為流行病學(xué)本底調(diào)查提供技術(shù)支持，為疾病的防治創(chuàng)造前提條件。
文檔編號G01N33/569GK101349701SQ20081011977
公開日2009年1月21日 申請日期2008年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月9日
發(fā)明者劉春曉, 蕾 史, 徐云慶, 朱玉蘭, 林連成, 趙純中, 顧大勇 申請人:深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院;深圳市賽爾生物技術(shù)有限公司