專利名稱：一種量子點(diǎn)標(biāo)記的間接競爭熒光免疫檢測糖皮質(zhì)激素多殘留的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種量子點(diǎn)標(biāo)記的間接競爭熒光免疫檢測糖皮質(zhì)激素多殘留的方法，屬于 免疫檢測方法技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
糖皮質(zhì)激素具有抗過敏、抗炎和影響糖代謝的作用，常被用于治療家畜的 炎癥反應(yīng)、免疫性疾病、牛的酮病和羊妊娠毒血癥等。地賽米松，倍他米松， 雙氟米松還常被用作生長促進(jìn)劑，增加家畜的詞料攝入量從而使其達(dá)到增重的 目的。然而，經(jīng)毒理學(xué)試驗(yàn)證明，該類藥物具有至突變性、蓄積毒性，若隨意 在飼料中添加該藥物，蓄積的藥物通過食物鏈進(jìn)入人體，將造成巨大的危害。為 此許多國家將此類藥物列入禁用藥物名單。當(dāng)今國際上常用的糖皮質(zhì)激素殘留
的檢測方法有薄層色譜(TLC)、液相色譜CLC)、氣相色譜(GC)、氣-質(zhì)聯(lián)用法 (GC-MS)、液-質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)等，但這些儀器分析方法不僅需要昂貴的儀器 設(shè)備，對檢材的要求也比較高，需要經(jīng)過復(fù)雜的樣品前處理才能進(jìn)行。國外早 己經(jīng)開展了對糖皮質(zhì)激素分析方法的研究，常用的方法為酶聯(lián)免疫分析法 (ELISA)或稱為免疫酶定量分析法(IEMA)。這類方法是將包被原包被酶標(biāo)板， 加入藥物及抗藥物抗體，再加入酶標(biāo)二抗，即檢測抗體，最后加入底物顯色， 一定時(shí)間后，用酶標(biāo)儀檢測某一特定波長的吸光度值，根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)品含量計(jì) 算樣品中待測藥物的濃度，此操作繁瑣，費(fèi)時(shí)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供量子點(diǎn)標(biāo)記的間接競爭熒光免疫檢測糖皮質(zhì)激素多殘 留的方法，該方法具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度、操作簡單的量子點(diǎn)標(biāo) 記的熒光免疫檢測法，用于糖皮質(zhì)激素多殘留的快速檢測。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種量子點(diǎn)標(biāo)記的間接競爭熒光免疫檢測糖皮質(zhì)激素 的方法，將包被原直接包被在酶標(biāo)板的微孔中，加入糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)溶液或待 測樣品形成抗原-抗體發(fā)光免疫復(fù)合體，用炎光酶標(biāo)儀激發(fā)并檢測所形成的抗原-抗體發(fā)光免疫復(fù)合物的熒光強(qiáng)度，通過與標(biāo)準(zhǔn)溶液對比求出待測樣品中糖皮質(zhì) 激素多殘留的濃度；
(一)用變性牛血清蛋白dBSA包裹三種量子點(diǎn)QD545， QD5卯，QD650標(biāo) 記抗地塞米松，抗倍他米松，抗雙氟米松多克隆抗體
(1) BSA變性
將16.5mgBSA溶于10mL雙蒸水中，攪拌下加入0.42mg NaBH4,室溫下反應(yīng)lh, 60-80。C下加熱20min分解過量的NaBH4， BSA變性，二硫鍵打開成-SH, 控制最終的dBSA水溶液的濃度為5X 10'5M;
(2) 變性BSA包裹量子點(diǎn)dBSA-QDs: 將dBSA和量子點(diǎn)鏑化鉻CdTe按摩爾比l : 1混合，60-80'C水浴加熱15min，
室溫下保持兩天，使包裹完全；
(3) 變性BSA包裹量子點(diǎn)偶聯(lián)抗體
將5^1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺EDC 0.056M與5pL硫代N-羥基琥珀酰亞胺sulfo-NHS 0.1M混合10s后，加入至25|aL dBSA-QDs 2X 1(T5M 中，變性BSA包裹的量子點(diǎn)活化15min,加入12|iL三種糖皮質(zhì)激素抗體中的 一種Ab， 4.0mg/mL ;反應(yīng)物摩爾比控制為dBSA-QDs: Ab: EDC: sulfo-NHS=l:l:560:1000，室溫下反應(yīng)4h，得到量子點(diǎn)標(biāo)記的糖皮質(zhì)激素抗體， 反應(yīng)液中抗體的濃度為1.0mg/mL，用0.1。/。明膠的含吐溫的pH7.4、 O.OIM磷酸 鹽緩沖液作抗體稀釋液稀釋1000倍待用；變性BSA包裹量子點(diǎn)分別與三種多 克隆抗體進(jìn)行偶聯(lián)；
(二) 抗原的包被
用三種包裹量子點(diǎn)的多克隆抗體分別與卵血清白蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，將得到的 三種多克隆抗體-卵血清白偶聯(lián)物等質(zhì)量混合用作糖皮質(zhì)激素偶連體作為包被 原，用pH9.6、 0.05M碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，用包被緩沖液將糖皮質(zhì)激 素包被原稀釋至l-20pg/mL作為包被液，在酶標(biāo)板的每孔中加IOOjiL包被液，4 。C冰箱過夜，用含NaCl 8.5g/L、 pH 7.2-7.4、 1Ommol/L磷酸鹽緩沖液洗三次， 按200(iL/孔加0.1%明膠進(jìn)行封閉；
(三) 抗原-抗體二元發(fā)光免疫復(fù)合體的形成 在封閉后的酶標(biāo)板孔中加入糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品50pL，稀釋的
量子點(diǎn)標(biāo)記的糖皮質(zhì)激素抗體50pL,37"C孵育lh，抗原與糖皮質(zhì)激素藥物競爭 抗體，部分抗體與抗原形成抗原-抗體二元免疫復(fù)合物，用含NaC18.5g/L 、 pH 7.2-7.4、 1Ommol/L磷酸鹽緩沖液洗三次，去掉非特異性吸附；
(四) 定量熒光檢測 用熒光酶標(biāo)儀激發(fā)并檢測所形成的抗原-抗體發(fā)光免疫復(fù)合物的熒光強(qiáng)度，
激發(fā)波長430nm;發(fā)射波長545nm， 590nm， 650nm，通過與標(biāo)準(zhǔn)溶液對比求 出祥品中糖皮質(zhì)激素多殘留地塞米松，倍他米松，雙氟米松的濃度。
所說的抗體是指用變性BSA包裹三種量子點(diǎn)(545nm， 590nm， 650nm)分
別標(biāo)記的抗地塞米松，抗倍他米松，抗雙氟米松的多克隆抗體；量子點(diǎn)是指能 夠發(fā)射熒光的納米粒子，其核心部分為CdTe。
所說的包被是利用常規(guī)的方法將地塞米松，倍他米松，雙氟米松的包被原(地 塞米松，倍他米松，雙氟米松-OVA偶聯(lián)物)直接固定在酶標(biāo)板微孔中。所說的抗原-抗體復(fù)合體的形成是加入地塞米松，倍他米松，雙氟米松， 三種抗原與相應(yīng)的藥物競爭相應(yīng)的抗體，通過抗原與抗體的特異性結(jié)合形成抗 原-抗體二元免疫復(fù)合物。
所說的熒光強(qiáng)度的檢測是用熒光酶標(biāo)儀激發(fā)并檢測所形成的抗原-檢測抗體 二層夾心發(fā)光免疫復(fù)合物的熒光強(qiáng)度，通常樣品中藥物濃度越大，被抗體捕獲 的藥物量越多，與包被原結(jié)合的抗體越少，則測得的熒光強(qiáng)度值越小。
上述的待測藥物為地塞米松，倍他米松，雙氟米松，相應(yīng)的抗體應(yīng)為特異 性抗地塞米松，抗倍他米松，抗雙氟米松的多克隆抗體。
本發(fā)明的有益效果
(1) 本法操作簡單，不需加顯色物質(zhì)就能檢測待測糖皮質(zhì)激素的含量，即 通過抗原-抗體免疫復(fù)合物的熒光強(qiáng)度，間接檢測樣品中待測糖皮質(zhì)激素的濃度 值，無論操作還是反應(yīng)均較背景技術(shù)少兩步，只需一步就可完成。
(2) 本法用于標(biāo)記抗體的量子點(diǎn)與傳統(tǒng)熒光相比，發(fā)射的熒光強(qiáng)度更強(qiáng)， 且熒光穩(wěn)定時(shí)間長。


圖l用量子點(diǎn)標(biāo)記的間接競爭熒光免疫法檢測糖皮質(zhì)激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
(一)用變性牛血清蛋白(dBSA)包裹三種量子點(diǎn)QD545, QD590, QD650 標(biāo)記抗地塞米松，抗倍他米松，抗雙氟米松多克隆抗體
(1) BSA變性
將16.5mg BSA溶于10mL雙蒸水中，攪拌下加入0.42mg NaBH4,室溫下 反應(yīng)lh, 60-8(TC下加熱20min分解過量的NaBH4， BSA變性，二硫鍵打開成-SH, 最終的dBSA水溶液的濃度為5 X 1(T5M。
(2) 變性BSA包裹量子點(diǎn)(dBSA-QDs): 將dBSA和量子點(diǎn)鏑化鉻(CdTe)按摩爾比(1:1)混合，60-SCTC水浴加
熱15min，室溫下保持兩天，使包裹完全。
(3) 變性BSA包裹量子點(diǎn)偶聯(lián)抗體
將5pL l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺EDC(0.056M)與5pL硫代 N-羥基琥珀酰亞胺sulfo-NHS(0.1M)混合10s后，加入至25|iL dBSA-QDs (2X 1(T5M)中，變性BSA包裹的量子點(diǎn)活化15min，加入12|iL糖皮質(zhì)激素抗體(Ab, 4.0mg/mL)。反應(yīng)物摩爾比為dBSA-QDs: Ab: EDC: sulfo-NHS=l: 1:560:1000。 室溫下反應(yīng)4h，得到量子點(diǎn)標(biāo)記的糖皮質(zhì)激素抗體。反應(yīng)液中抗體的濃度為 1.0mg/mL，用抗體稀釋液(0.1。/。明膠的含吐溫的磷酸鹽緩沖液pH7.4、 0.01M) 稀釋1000倍待用。(二) 抗原的包被
用地塞米松，倍他米松，雙氟米松與卵血清白蛋白偶連體作為包被原，用碳
酸鹽緩沖液(pH9.6、 0.05M)作為包被緩沖液，用包被緩沖液將糖皮質(zhì)激素包 被原稀釋至l-20嗎/mL作為包被液，在酶標(biāo)板的每孔中加100pL包被液，4"C冰 箱過夜，用磷酸鹽緩沖液(PBS,10mmol/L、 pH 7.2-7.4、含NaC18.5g/L)洗三次， 按200pL/孔加0.1%明膠進(jìn)行封閉。
(三) 抗原-抗體二元發(fā)光免疫復(fù)合體的形成 在封閉后的酶標(biāo)板孔中加入地塞米松，倍他米松，雙氟米松標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測
樣品50^L，稀釋的量子點(diǎn)標(biāo)記的糖皮質(zhì)激素抗體5(VL,37"C孵育lh，抗原與糖 皮質(zhì)激素藥物競爭抗體，部分抗體與抗原形成抗原-抗體二元免疫復(fù)合物，用磷 酸鹽緩沖液(PBS，10mmol/L， pH 7.2-7.4，含NaC18.5g/L)洗三次，去掉非特異 性吸附。
(四) 定量熒光檢測 量子點(diǎn)標(biāo)記的間接競爭榮光免疫檢測法的測定原理是通過檢測結(jié)合到酶標(biāo)
板微孔上的抗原-抗體二元免疫復(fù)合物的熒光強(qiáng)度來實(shí)現(xiàn)對糖皮質(zhì)激素的檢測。 可與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比求出樣品中糖皮質(zhì)激素的濃度。結(jié)合到酶標(biāo)板微孔上的量于 點(diǎn)標(biāo)記的檢測抗體數(shù)量不同，產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度不同，通常樣品中藥物濃度越大， 被抗體捕獲的藥物量越多，與包被原結(jié)合的抗體越少，則測得的熒光強(qiáng)度值越 小。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，將地塞米松，倍他米松，雙氟米松標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配置成由 低到高8種不同濃度(0.1ng/mL， 0.5 ng/mL， 1 ng/mL， 5 ng/mL， 10ng/mL， 25 ng/mL， 50ng/mL， 100ng/mL)，同濃度下，二種藥品分別等量混和，用與待測 樣本相同的方法，重復(fù)(二)(三)歩驟的操作，測定某種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液對應(yīng) 的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長430nm;發(fā)射波長545nm， 590nm， 650nm，以糖皮質(zhì) 激素濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。 實(shí)施例2添加回收實(shí)驗(yàn)
(1) 樣品的提取凈化在2g雞肉靡樣本中加入10mL乙腈/水(7 : 3)的混 合溶液，渦旋混合lmin，超聲波超聲30min， 2000Xg離心10min，吸取2.5mL 上層液于干凈的玻璃管中，加入4mL正己烷和lmL 二氯甲垸脫脂，渦旋混合 lmin使三相分離，吸取lmL中間相(對應(yīng)于0.2g樣品)于干凈的試管中；50°C， 緩慢的N2流吹干，用0.2mL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(含10%甲醇的含吐溫-20的磷酸鹽 緩沖液PBST)溶解殘留物，作為試樣供分析。
(2) 在2g空白的雞肉樣本中添加標(biāo)準(zhǔn)品(地塞米松，倍他米松和雙氟米 松三種混合物)液，使其濃度為10ng/g，各濃度分別制備樣品五份，按上述的 前處理方法進(jìn)行提取后分析。結(jié)果見表l?？梢钥闯觯瑔为?dú)檢測三種藥品在雞肉 樣品中的回收率在70.5 74.5該分析方法重復(fù)性良好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于4.37。同時(shí)檢測三種藥品在雞肉樣品中的回收率在60.12% 67.98%。該分析方法 重復(fù)性良好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于5.57%。
表1添加回收率的測定
添加藥物 實(shí)測濃度(ng/mL) 回收率(％)
地塞米松(10ng/g)7.427.057.617.547.2973.82±4.37
倍他米松(10ng/g)6.77.196.937.317.1270.5±3.69
雙氟米松(10ng/g)7.517.697.337.467.2674.5±3.22
混合物(地塞米松)G.33ng/g)2.272.162.352.072.1165.76±5.57
混合物(倍他米松)(3.33ng/g)1.92.082.051.942.0460.12±5.19
混合物(雙氟米松)G.33ng/g)3.352.272.332.22.1867.98±3.8
8
權(quán)利要求
1.一種量子點(diǎn)標(biāo)記的間接競爭熒光免疫檢測糖皮質(zhì)激素多殘留的方法，其特征在于將包被原直接包被在酶標(biāo)板的微孔中，加入糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品形成抗原-抗體發(fā)光免疫復(fù)合體，用熒光酶標(biāo)儀激發(fā)并檢測所形成的抗原-抗體發(fā)光免疫復(fù)合物的熒光強(qiáng)度，通過與標(biāo)準(zhǔn)溶液對比求出待測樣品中糖皮質(zhì)激素多殘留的濃度；(一)用變性牛血清蛋白dBSA包裹三種量子點(diǎn)QD545，QD590，QD650分別標(biāo)記的抗地塞米松，抗倍他米松，抗雙氟米松多克隆抗體，此三種多克隆抗體即分別為下述的糖皮質(zhì)激素抗體之一(1)BSA變性將16.5mg BSA溶于10mL雙蒸水中，攪拌下加入0.42mg NaBH4，室溫下反應(yīng)1h，60-80℃下加熱20min分解過量的NaBH4，BSA變性，二硫鍵打開成-SH，控制最終的dBSA水溶液的濃度為5×10-5M；(2)變性BSA包裹量子點(diǎn)dBSA-QDs將dBSA和量子點(diǎn)鏑化鉻CdTe按摩爾比1∶1混合，60-80℃水浴加熱15min，室溫下保持兩天，使包裹完全；(3)變性BSA包裹量子點(diǎn)偶聯(lián)抗體將5μL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺EDC 0.056M與5μL硫代N-羥基琥珀酰亞胺sulfo-NHS 0.1M混合10s后，加入至25μL dBSA-QDs 2×10-5M中，變性BSA包裹的量子點(diǎn)活化15min，加入12μL三種糖皮質(zhì)激素抗體中的一種Ab、4.0mg/mL；反應(yīng)物摩爾比控制為dBSA-QDs∶Ab∶EDC∶sulfo-NHS＝1∶1∶560∶1000，室溫下反應(yīng)4h，得到量子點(diǎn)標(biāo)記的糖皮質(zhì)激素抗體，反應(yīng)液中抗體的濃度為1.0mg/mL，用0.1％明膠的含吐溫的pH 7.4、0.01M磷酸鹽緩沖液作抗體稀釋液稀釋1000倍待用；變性BSA包裹量子點(diǎn)分別與三種多克隆抗體進(jìn)行偶聯(lián)；(二)抗原的包被用三種包裹量子點(diǎn)的多克隆抗體分別與卵血清白蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，將得到的三種多克隆抗體-卵血清白偶聯(lián)物等質(zhì)量混合用作糖皮質(zhì)激素偶連體作為包被原，用pH 9.6、0.05M碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，用包被緩沖液將糖皮質(zhì)激素包被原稀釋至1-20μg/mL作為包被液，在酶標(biāo)板的每孔中加100μL包被液，4℃冰箱過夜，用含NaCl 8.5g/L、pH 7.2-7.4、10mmol/L磷酸鹽緩沖液洗三次，按200μL/孔加0.1％明膠進(jìn)行封閉；(三)抗原-抗體二元發(fā)光免疫復(fù)合體的形成在封閉后的酶標(biāo)板孔中加入糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品50μL，稀釋的量子點(diǎn)標(biāo)記的糖皮質(zhì)激素抗體50μL，37℃孵育1h，抗原與糖皮質(zhì)激素藥物競爭抗體，部分抗體與抗原形成抗原-抗體二元免疫復(fù)合物，用含NaCl 8.5g/L、pH7.2-7.4、10mmol/L磷酸鹽緩沖液洗三次，去掉非特異性吸附；(四)定量熒光檢測用熒光酶標(biāo)儀激發(fā)并檢測所形成的抗原-抗體發(fā)光免疫復(fù)合物的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長430nm；發(fā)射波長545nm，590nm，650nm，通過與標(biāo)準(zhǔn)溶液對比求出祥品中糖皮質(zhì)激素多殘留地塞米松，倍他米松，雙氟米松的濃度。
全文摘要
一種量子點(diǎn)標(biāo)記的間接競爭熒光免疫檢測糖皮質(zhì)激素多殘留的方法，屬于免疫檢測方法技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明用于標(biāo)記抗體的量子點(diǎn)分別為QD545，QD590，QD650，將包被原直接包被在酶標(biāo)板的微孔中，加入糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品形成抗原-抗體發(fā)光免疫復(fù)合體，用熒光酶標(biāo)儀激發(fā)并檢測所形成的抗原-抗體發(fā)光免疫復(fù)合物的熒光強(qiáng)度，通過與標(biāo)準(zhǔn)溶液對比求出待測樣品中糖皮質(zhì)激素多殘留的濃度。本發(fā)明不需加顯色物質(zhì)就能通過抗原-抗體免疫復(fù)合物的熒光強(qiáng)度，間接檢測待測樣品中糖皮質(zhì)激素多殘留的濃度值，無論操作還是反應(yīng)均只需一步就可完成；本方法用于標(biāo)記抗體的量子點(diǎn)與傳統(tǒng)熒光相比，發(fā)射的熒光強(qiáng)度更強(qiáng)，且熒光穩(wěn)定時(shí)間長。
文檔編號G01N33/543GK101308148SQ20081012352
公開日2008年11月19日 申請日期2008年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月17日
發(fā)明者彭池方, 徐麗廣, 哲 李, 李灼坤, 胥傳來, 媛 袁, 偉 陳 申請人:江南大學(xué)