專利名稱：同型半胱氨酸診斷試劑盒及同型半胱氨酸濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種同型半胱氨酸診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定同型半胱 氨酸濃度的方法，屬于醫(yī)學檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
測定血漿中同型半胱氨酸濃度的方法有很多種，包括高效液相色譜法(HPLC)、 氨基酸分析儀測定法、離子色譜法、酶聯(lián)免疫分析法(EIA)、毛細管氣相色譜-質(zhì) 譜，熒光偏振免疫分析(FPIA)、電化學法及酶法等。
高效液相色譜法(HPLC):是經(jīng)典的參考方法，但其操作比較復雜，試驗耗時 比較長，試驗數(shù)據(jù)變異比較大，在臨床應用方面逐漸被酶聯(lián)免疫分析法、熒光偏 振分析法和酶法所取代。高效液相色譜法先使用還原劑使血樣中所有形式的同 型半胱氨酸轉(zhuǎn)變成還原形式，然后與熒光劑進行衍生生成同型半胱氨酸-熒光物質(zhì) 復合物，將衍生后的樣品進行色譜分析。因色譜固定相對不同物質(zhì)的吸附力不同， 因此流動相將其洗脫下來的次序也不同，根據(jù)這一原理將樣品中的不同物質(zhì)分開， 以熒光檢測器檢測洗脫下同型半胱氨酸-熒光物質(zhì)復合物的熒光強度，將其與標準 品/內(nèi)標的比值進行比較和計算，就可以測定血總同型半胱氨酸的水平。
酶聯(lián)免疫分析法(EIA):是臨床上測定同型半胱氨酸水平的常用方法，操作 比較方便、快捷，重復性好，方法穩(wěn)定可靠。其缺點是大部分操作還是手工操作，
比較耗時。酶聯(lián)免疫分析法基本分析原理先使用酶將血樣中所有形式的同型半
胱氨酸轉(zhuǎn)變成S-腺苷-L-同型半胱氨酸，然后加入酶標的抗S-腺苷-L-同型半胱氨酸 的單克隆或多克隆抗體，采用競爭結(jié)合的原理，將不同水平的標準品與酶標抗體 競爭結(jié)合，然后以顯色試劑和終止試劑分別進行顯色和終止，制作出同型半胱氨 酸濃度與發(fā)色強度的標準曲線。樣品也按相同步驟處理，在標準曲線上就可以查 出其同型半胱氨酸的濃度。
離子色譜法主要用于實驗研究，臨床上較少使用，其基本分析原理是色譜
4分析的一種，主要是其固定相采用離子交換物質(zhì)，根據(jù)其對不同離子的吸附力不 同可將同型半胱氨酸與其它物質(zhì)分開進行測定。
毛細電泳法主要用于實驗研究，有在臨床使用的報道。其特點與高效液相 色譜方法相似，其操作比較復雜、試驗耗時較長和試驗數(shù)據(jù)變異比較大的缺點。 基本分析原理先使用還原劑使血樣中所有形式的同型半胱氨酸轉(zhuǎn)變成還原形式， 然后與熒光試劑進行衍生生成同型半胱氨酸-熒光物質(zhì)復合物，將衍生后的樣品進 行毛細電泳分析。將樣品放置于10千伏左右的高壓電場中，因為各種物質(zhì)所帶電 荷不同，其等電點也不相同，因此其在電場中的遷移速度也就不同，根據(jù)這一原 理可將同型半胱氨酸與樣品中的其它物質(zhì)分開，再以熒光檢測器檢測同型半胱氨 酸-熒光物質(zhì)復合物的熒光強度，將其與標準品/內(nèi)標的比值進行比較和計算，就可 以測定總同型半胱氨酸的水平。
熒光偏振法是臨床上測定同型半胱氨酸水平的比較好的方法，該方法完全 自動化儀器分析，具有快速、準確、方便的優(yōu)點。其基本分析原理樣品中游離 同型半胱氨酸和抗單克隆抗體相結(jié)合的同型半胱氨酸的熒光偏振強度不同，將樣 品、標準品與標抗體競爭結(jié)合，采用競爭結(jié)合的原理制作出同型半胱氨酸濃度與 熒光偏振強度的標準曲線，在標準曲線上就可以查出其同型半胱氨酸的濃度。
酶法因應市場需求而新開發(fā)出來的測試方法，目前國內(nèi)有多項專利申請，
CN98807531.8利用同型半胱氨酸酶來測量樣品中同型半胱氨酸含量； CN200410016789.6利用同型半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶(E.C.2丄1.10)及腺苷同型半胱氨 酸酶(E.C.3.3丄1)的循環(huán)擴增作用，再加上腺苷脫氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、黃嘌 呤氧化酶、過氧化物酶等，或腺苷脫氨酶、谷氨酸脫氫酶等顯色反應測定同型半 胱氨酸含量；CN200510053210.8利用L-蛋氨酸Y-裂解酶作用于同型半胱氨酸使之 產(chǎn)生硫化氫后再與瑩光化合物DMPD2HC1作用產(chǎn)生熒光，該方法使用全自動熒光 分析儀測試，具有快速、準確、方便的優(yōu)點。其基本分析原理用基因重組酶將 同型半胱氨酸分解，所形成之硫化氫產(chǎn)物再與熒光顯色劑發(fā)生化學反應形成可測 量的芡光化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶(偶)聯(lián)法(CoupleReaction)技術(shù)，監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原 型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定同型半胱氨酸濃度的方法，同 時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的同型半胱氨酸診斷試劑盒，采用該試劑不 僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行同型半胱氨酸濃度測 定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。 本發(fā)明同型半胱氨酸濃度測定方法原理如下
同型半胱氨酸+水同型半胱氨酸-a,y-裂解酶硫化氫+氨+
oc-氧代丁酸
氨+ 2-酮戊二酸+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶+
水
這種方法應用同型半胱氨酸-a,Y -裂解酶(homocysteine desulfhydrase; EC 4.4丄2)酶(偶)聯(lián)谷氨酸脫氫酶(GlutamateDehydrogenase; EC 1.4.1.2; EC 1.4.1.3; EC 1.4丄4)酶促反應比色法。同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶酶解同型半胱氨酸反應產(chǎn) 生氨，再通過(偶)聯(lián)合谷氨酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處 有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在 340nm處吸光度下降的程度，通過測量340nm處吸光度下降的程度，可以測算同 型半胱氨酸的濃度大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是 單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明同型半胱氨酸診斷試劑盒較為理想:
緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
同型半胱氨酸-oc，y -裂解酶 9000 U/L
谷氨酸脫氫酶 8000 U/L2-酮戊二酸 15mmol/L
本發(fā)明的同型半胱氨酸診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶、谷氨酸脫氫酶、 2-酮戊二酸。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑， 直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、2-酮戊二酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶、谷氨酸脫氫酶。 還原型輔酶、同型半胱氨酸-a,y-裂解酶、谷氨酸脫氫酶、2-酮戊二酸在試劑l 或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、2-酮戊二酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸脫氫酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶。 還原型輔酶、同型半胱氨酸-a，Y-裂解酶、谷氨酸脫氫酶、2-酮戊二酸在試劑1、 試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是千粉狀態(tài)，在使用前加水溶解 后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定同型半胱氨酸濃度的方法，其還原型
輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的同型半胱氨酸診斷試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶
同型半胱氨酸-a，Y-裂解酶
2-酮戊二酸
0.25 mmol/L 卯OO U/L 8000 U/L 15 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加 入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光度1.8 ±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405mn，被測同型半胱氨酸樣品與試劑的 體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢 測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下， 檢測主波長340mn吸光度下降的程度，從而測算出同型半胱氨酸的濃度大小。 實施例二
本實施例的同型半胱氨酸診斷試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑
還原型輔酶
2-酮戊二酸
50 mmol/L 0.25 mmol/L 15 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶
100mmol/L 500 mmol/L ■0 U/L 8000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應時間10分鐘，起始吸光度1.8
±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測同型半胱氨酸樣品與試劑1、
試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約0分
鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，
檢測主波長340rnn吸光度下降的程度，從而測算出同型半胱氨酸的濃度大小。
實施例三
本實施例的同型半胱氨酸診斷試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 2-酮戊二酸 試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
100mmol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 15 mmol/穩(wěn)定劑
500 mmol/L
谷氨酸脫氫酶
,0 U/L
試劑3
(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
100 mmol/L
穩(wěn)定劑
500 mmol/L
同型半胱氨酸-oc,Y-裂解酶
卯00 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定同型半胱氨酸濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應時間
IO分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測同 型半胱氨酸樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為負 反應(下降反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出同型半胱氨酸的濃度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達到本 發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得 出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0007;吸光度時間反 應曲線應呈下降曲線直至終點；試劑可測有效(RX).99)線形范圍可達1 mmol/L; 試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過±4%;試劑測試的精密度(重復性)的 變異系數(shù)(CV) 《2%;試劑的靈敏度可達0.3 ± 0.15 AA/mmol/L;試劑在2 一8t:下保存，活性口了以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬
廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的同型半胱氨酸濃度測定方法，其方法原理如下同型半胱氨酸+水同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶硫化氫+氨+ α-氧代丁酸氨+2-酮戊二酸+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶+ 水將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，測算出同型半胱氨酸的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種同型半胱氨酸診斷試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——4000 mmol/L還原型輔酶 0.1——0.35mmol/L同型半胱氨酸-a,Y -裂解酶 1000——80000 U/L谷氨酸脫氫酶 1000——80000 U/L2-酮戊二酸 1- 50mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍夕卜，試劑仍會反應作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述同型半胱氨酸診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、同型半胱氨酸-a，Y-裂解酶、谷氨酸脫氫酶、 2-酮戊二酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述同型半胱氨酸診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶、谷氨酸脫氫酶、 2-酮戊二酸組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、2-酮戊 二酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、同型半胱氨酸-a,y-裂解酶、谷氨酸脫 氫酶組成。還原型輔酶、同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶、谷氨酸脫氫酶、2-酮戊二 酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述同型半胱氨酸診斷試劑盒，其特征在丁-:由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶、谷氨酸脫氫酶、 2-酮戊二酸組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、2-酮戊 二酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖 液、穩(wěn)定劑、同型半胱氨酸-a，Y-裂解酶組成。還原型輔酶、同型半胱氨酸-oc,Y -裂解酶、谷氨酸脫氫酶、2-酮戊二酸在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以 不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述同型半胱氨酸診斷試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的同型半胱氨酸診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定同型半胱氨酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、2-酮戊二酸、同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶、谷氨酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度，從而測算出同型半胱氨酸的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101620173SQ20081012424
公開日2010年1月6日 申請日期2008年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司