專利名稱：：一種篩選適用于檢測和純化凝血第八因子的單克隆抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，本發(fā)明是一種篩選適用于檢測和純化凝血第八因子的單克隆抗體的方法。
背景技術(shù)：
：甲型血友病是一種先天性由凝血第八因子缺乏引起的出血性疾病。甲型血友病最有效的治療方法是輸入正常人血漿、血漿來源的濃縮人凝血第八因子制劑或基因重組來源的凝血第八因子制劑。在血漿來源的濃縮人凝血第八因子制劑的生產(chǎn)過程中，凝血第八因子蛋白(即凝血第八因子抗原)是無法被檢測的，其原因是沒有抗原檢測的手段。因此，國內(nèi)血源凝血第八因子只是以活性標(biāo)示，沒有比活數(shù)據(jù)，即單位抗原所具有的凝血活性數(shù)據(jù)。而且，由于不能檢測凝血第八因子抗原，在從血漿中分離純化凝血第八因子的生產(chǎn)過程中只能監(jiān)測凝血活性而不能監(jiān)測凝血第八因子抗原的量的變化，以至于生產(chǎn)過程中出現(xiàn)八因子失活情況也無法被發(fā)現(xiàn)。目前國外已經(jīng)有用酶聯(lián)免疫吸附法檢測凝血第八因子的試劑盒，我國還沒有此類八因子抗原的檢測試劑盒，只能依賴進(jìn)口。通過對進(jìn)口試劑盒的測試發(fā)現(xiàn)，雖然進(jìn)口試劑盒的檢測靈敏度非常高，可以達(dá)到10ng/ml，但是用試劑盒提供標(biāo)準(zhǔn)品所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性區(qū)域非常短，以至于影響了樣品的檢測。另外，在應(yīng)用過程中還發(fā)現(xiàn)對于血漿來源的凝血第八因子檢測常常出現(xiàn)偏差較大、重復(fù)性差等情況，經(jīng)分析很可能是由于血漿來源凝血第八因子B區(qū)降解產(chǎn)物不均一所引起。圖1A顯示的是凝血第八因子重鏈的示意圖，最初的重鏈?zhǔn)怯葾l+A2+B三部分組成，但隨著蛋白分子的成熟，B區(qū)逐步被降解，使重鏈成為一個由Al+A2部分和不同長度的B區(qū)所組成的混合物；圖IB顯示的是凝血第八因子的蛋白印記試驗，從圖中可以看出凝血第八因子Al+A2呈現(xiàn)一條約90kDa的蛋白條帶，而在其上方是一片從100kDa到200kDa大小不等的Al+A2+B條帶。用進(jìn)口試劑檢測血液來源的凝血第八因子所發(fā)現(xiàn)的偏差較大、重復(fù)性差等問題很可能是由于在這些檢測試劑盒的抗體中有抗凝血第八因子B區(qū)的抗體，由于血液來源的凝血第八因子B區(qū)的多樣性導(dǎo)致抗體不能與B區(qū)充分結(jié)合而造成偏差。凝血第八因子的分離純化也必須用到抗凝血第八因子的抗體?，F(xiàn)在已經(jīng)有許多國外廠家用抗凝血第八因子的抗體所制成的親和層析柱來分離純化血漿來源和基因重組來源的凝血第八因子。我國目前還沒有用親和層析方法生產(chǎn)的高純度血液來源的凝血第八因子上市，國內(nèi)基因重組來源的凝血第八因子也是一項空白。這項技術(shù)的難點(diǎn)主要在于凝血第八因子的不穩(wěn)定性使得抗體與凝血第八因子結(jié)合后很難通過某種洗脫方式解離并釋放出有生物學(xué)活性的凝血第八因子。國外廠家篩選到的適用于凝血第八因子的抗體親和層析柱的抗體應(yīng)用SPR生物傳感器方法將純化的凝血第八因子固定于生物芯片上，再加入被檢測的單克隆抗體與凝血第八因子抗原結(jié)合，然后用不同的條件洗脫并記錄抗體解離的情況。由于生物芯片價格昂貴，使用這種方法篩選抗體成本比較高，而且由于血液來源的凝血第八因子純度差，不適于用作結(jié)合在生物芯片的抗原，無法用SPR生物傳感器方法篩選抗體。另外，由于凝血第八因子分子穩(wěn)定性差，非常容易在強(qiáng)酸強(qiáng)堿等不適宜的液體環(huán)境下降解而失活。這也是急需解決的問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一在于提供一種篩選適用于檢測凝血第八因子的單克隆抗體的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供一種篩選適用于分離純化凝血第八因子的單克隆抗體的方法。本發(fā)明采用以下技術(shù)步驟組成的技術(shù)方案一種篩選適用于檢測凝血第八因子的單克隆抗體的方法，包含以下步驟a.分別用全長凝血第八因子和B區(qū)缺失的凝血第八因子免疫動物，用酶聯(lián)免疫吸附法篩選抗凝血第八因子呈陽性的單克隆抗體；b.用蛋白印記方法從以全長凝血第八因子免疫動物產(chǎn)生的陽性單克隆抗體中篩選出抗B區(qū)的抗體，從以B區(qū)缺失的凝血第八因子免疫動物產(chǎn)生的陽性單克隆抗體中篩選出抗Al+A2區(qū)的抗體；c.分別選擇抗Al+A2區(qū)的單克隆抗體，以及抗Al+A2區(qū)的單克隆抗體和抗B區(qū)的單克隆抗體的混合抗體用于ELISA檢測，對實(shí)驗中所得到的結(jié)果進(jìn)行比較，篩選出適合作為ELISA檢測的抗Al+A2區(qū)單克隆抗體。所述的全長凝血第八因子和B區(qū)缺失的凝血第八因子均為基因重組凝血第八因子。一種檢測凝血第八因子的試劑盒，采用上述的方法篩選的抗凝血第八因子的單克隆抗體作為一抗包板。一種篩選適用于凝血第八因子分離純化的單克隆抗體的方法，包括如下步驟A.用B區(qū)缺失的凝血第八因子免疫動物，篩選抗A1+A2區(qū)的單克隆抗體；B.用免疫沉淀方法和凝血第八因子凝血活性檢測，以凝血第八因子作為抗原，對步驟A中篩選出的抗Al+A2區(qū)的單克隆抗體進(jìn)行檢測，篩選出能在低濃度鹽和低濃度乙二醇環(huán)境下與凝血第八因子結(jié)合的單克隆抗體；C.對步驟B篩選出的單克隆抗體進(jìn)行進(jìn)一步篩選，在免疫沉淀實(shí)驗過程中提高反應(yīng)的鹽濃度，篩選出在鹽濃度提高時與凝血第八因子結(jié)合力增強(qiáng)的單克隆抗體；D.對步驟C篩選出的單克隆抗體進(jìn)行進(jìn)一步篩選，在免疫沉淀實(shí)驗過程中在提高反應(yīng)的鹽濃度的同時提高乙二醇的濃度，并與未提高乙二醇的濃度時的數(shù)據(jù)相比較，篩選出在提高乙二醇的濃度時結(jié)合力降低的單克隆抗體。其中，步驟A中，所述B區(qū)缺失的凝血第八因子為基因重組凝血第八因子。在步驟B中，所述的凝血第八因子是血漿來源凝血第八因子或基因重組凝血第八因子。步驟B中，所述的低濃度鹽為0.5M氯化鈉，低濃度乙二醇的濃度為5wt%。步驟C中，所述的鹽濃度是1.5M氯化鈉。步驟D中，所述的乙二醇的濃度是40wt。/0。本發(fā)明還請求保護(hù)采用上述方法(篩選適用于凝血第八因子分離純化的單克隆抗體的方法)篩選的抗凝血第八因子Al+A2區(qū)的單克隆抗體制備的用于純化凝血第八因子的抗體親和層析柱。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)方案的流程圖見圖2。圖2顯示用不同條件的免疫印跡、免疫沉淀、凝血第八因子凝血活性測定等方法，篩選出適合用于凝血第八因子抗原檢測和分離純化的抗體的流程。結(jié)合圖2篩選出適合用于凝血第八因子抗原檢測的單克隆抗體的方案如下首先，用全長凝血第八因子和B區(qū)缺失的凝血第八因子免疫成年小鼠，檢測到小鼠血清中有抗凝血第八因子的抗體活性后進(jìn)行小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合，產(chǎn)生抗凝血第八因子的雜交瘤細(xì)胞株；第2步對分泌不同的抗凝血第八因子抗體的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行篩選，分別挑選出分泌抗A1+A2區(qū)的單克隆抗體和抗B區(qū)的單克隆抗體的細(xì)胞株;第3步進(jìn)一步篩選適用于用雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測凝血第八因子抗原的抗體，做成凝血第八因子抗原檢測試劑盒。篩選方法為用抗凝血第八因子Al+A2區(qū)的抗體作為一抗包酶標(biāo)板，或者用抗凝血第八因子Al+A2區(qū)和抗B區(qū)的單克隆抗體的混合抗體作為一抗包酶標(biāo)板，分別對不同濃度的凝血第八因子標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定，繪制濃度曲線，計算回歸方程式和線性回歸系數(shù)，挑選出線性回歸最好的抗體用于ELISA檢測試劑盒的一抗包被酶標(biāo)板。結(jié)合圖2本發(fā)明篩選出適合用于凝血第八因子抗原分離純化的單克隆抗體的方案是將前述篩選的抗凝血第八因子Al+A2抗體進(jìn)一步篩選，找出與凝血第八因子抗原以疏水鍵相互作用的單克隆抗體。具體采用免疫沉淀結(jié)合凝血第八因子凝血活性檢測的方法，通過升高免疫沉淀反應(yīng)中鹽濃度和乙二醇濃度的方法考察不同抗凝血第八因子Al+A2區(qū)單克隆抗體與凝血第八因子抗原的結(jié)合性質(zhì)，篩選出與凝血第八因子抗原以疏水鍵相互作用的單克隆抗體細(xì)胞株，將挑選出的單克隆抗體進(jìn)行大規(guī)模制備，制作成免疫親和層析柱，用于凝血第八因子的分離純化。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明提供的篩選適用于酶聯(lián)免疫吸附法檢測凝血第八因子的單克隆抗體的方法，可以得到高靈敏度和高特異度的適用于酶聯(lián)免疫吸附法檢測凝血第八因子的單克隆抗體。將本發(fā)明的檢測結(jié)果繪制成的對數(shù)曲線，其線性范圍為0.078—0.313國際單位/毫升，相當(dāng)于抗原濃度15.6—62.6納克/毫升。本發(fā)明提供的篩選適合用于凝血第八因子分離純化的單克隆抗體的方法，可以得到適合用于凝血第八因子分離純化的單克隆抗體。該方法篩選得到的單克隆抗體與凝血第八因子結(jié)合后，可通過洗脫方式解離并釋放出有生物學(xué)活性的凝血第八因子。該方法篩選抗體條件易控制，成本低。圖1是凝血第八因子重鏈的示意圖及多克隆抗體檢測凝血第八因子的蛋白印記圖。(A)是凝血第八因子重鏈的示意圖；(B)是凝血第八因子的蛋白印記圖。圖2是本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)方案的流程圖。圖3是不同凝血第八因子為抗原免疫小鼠的血清酶聯(lián)免疫吸附試驗結(jié)果圖。(A)是以全長凝血第八因子為抗原免疫6周后小鼠血清酶聯(lián)免疫吸附試驗結(jié)果圖；(B)是以B區(qū)缺失凝血第八因子為抗原免疫6周后小鼠血清酶聯(lián)免疫吸附試驗結(jié)果圖。圖4是酶聯(lián)免疫吸附試驗顯色后的酶標(biāo)板的圖像。圖5是以全長凝血第八因子作抗原的雜交瘤細(xì)胞中篩選出抗B區(qū)的單克隆抗體的蛋白印記圖。圖6是以B區(qū)缺失凝血第八因子作抗原的雜交瘤細(xì)胞中篩選出抗Al+A2區(qū)的單克隆抗體的蛋白印記圖。圖7是不同抗體作為包板的一抗的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。(A)是抗A1+A2區(qū)的單克隆抗體作為包板的一抗的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；(B)是抗Al+A2區(qū)的單克隆抗體和抗B區(qū)的單克隆抗體的混合抗體作為包板的一抗的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖8是免疫沉淀時不同鹽濃度和不同乙二醇濃度對凝血第八因子清除率的影響。(A)是免疫沉淀時不同鹽濃度對凝血第八因子清除率的影響；圖中，星號表示在低鹽濃度免疫沉淀時凝血八因子活性清除率大于70%，且提高鹽濃度時凝血八因子活性清除率進(jìn)一步提高的單克隆抗體細(xì)胞株。(B)是免疫沉淀時不同乙二醇濃度對凝血第八因子清除率的影響。具體實(shí)施方式實(shí)施例1免疫小鼠并用酶聯(lián)免疫吸附法篩選抗凝血第八因子呈陽性的單克隆抗體分別用基因重組全長凝血第八因子和基因重組B區(qū)缺失的凝血第八因子免疫小鼠6周后取血清進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗，目的是檢測小鼠體內(nèi)是否產(chǎn)生了抗凝血第八因子的抗體。(1)雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)用于免疫小鼠的抗原為(1)基因重組全長凝血第八因子，商品名為拜科奇，由美國拜爾公司生產(chǎn)，可以通過科研途徑購買，其規(guī)格為每瓶250國際單位(IU)，約折合50微克/瓶；(2)基因重組B區(qū)缺失的凝血第八因子，商品名為Refacto，由美國惠氏公司生產(chǎn)，可以通過科研途徑購買，其規(guī)格也為每瓶250國際單位(IU)，約折合15微克/瓶；兩種蛋白凍干粉分別溶解于PBS緩沖液中。5-10微克全長凝血第八因子或2-3微克B區(qū)缺失凝血第八因子與0.4毫升弗氏完全佐劑(FreundsAdjuvantComplete,美國SIGMA公司產(chǎn)品)充分混合后靜脈注射免疫小鼠。首次免疫之后每三周用同樣的凝血第八因子制劑進(jìn)行兩次次加強(qiáng)免疫。在進(jìn)行脾細(xì)胞融合的前三天，小鼠最后一次用生理鹽水溶解的凝血第八因子進(jìn)行沖擊免疫。進(jìn)行脾細(xì)胞融合時，取出小鼠脾臟后用生理鹽水清洗，將脾細(xì)胞懸浮于RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基并在冰水浴中浸泡5分鐘后用冷的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基清洗2次備用。P3A8653型骨髓瘤細(xì)胞用l(TC的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基清洗兩次，然后懸浮于10毫升室溫的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞融合反應(yīng)以脾細(xì)胞比骨髓瘤細(xì)胞比例4:1進(jìn)行混合，1毫升50y。重量比的PEG1500緩緩加入細(xì)胞中，混勻后置于37。C水浴1.5分鐘，然后在3分鐘內(nèi)逐滴加入5毫升RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基，在之后的1分鐘內(nèi)再加入14毫升RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基，最后加入30毫升含有20%胎牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基。細(xì)胞離心后去上清，細(xì)胞繼續(xù)在有HAT培養(yǎng)基和20%胎牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)30天，然后轉(zhuǎn)換到20%胎牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基。脾細(xì)胞融合后，分別從以兩種抗原分別免疫的所得到的雜交瘤細(xì)胞挑選出1000株細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞在96孔板中生長達(dá)到50%密度時開始收集細(xì)胞上清液，并用于酶聯(lián)免疫吸附試驗。(2)用檢測未知抗體的間接酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的篩選酶標(biāo)板包板的方法為用0.05MpH9.0碳酸鹽包被緩沖液將凝血第八因子抗原稀釋至蛋白質(zhì)含量為0.21.0微克/毫升，在每個聚苯乙烯酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中加0.1毫升放置于4'C過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液(0.15MPBS緩沖液，pH7.4)洗3次，每次3分鐘。將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液0.1毫升加入酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中，置37'C孵育1小時。沒有加入抗體的反應(yīng)孔作為陰性對照孔，加入濃度為1-10微克/毫升陽性抗體的反應(yīng)孔作為陽性對照孔。然后用洗滌緩沖液洗滌3次，每次3分鐘。加酶標(biāo)抗體時于各反應(yīng)孔中加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體O.lml，經(jīng)37t:孵育0.51小時后用洗滌緩沖液洗滌3次，每次3分鐘。加底物液顯色，于各反應(yīng)孔中加入新鮮配制的TMB底物溶液O.lml孵育37°C1030分鐘后用2M硫酸0.05ml加入反應(yīng)孔內(nèi)終止反應(yīng)?？梢灾苯佑萌庋叟卸ńY(jié)果，將酶標(biāo)板置于白色背景上，反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以"+"、"-"號表示。為得到更精確的結(jié)果可測OD值在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，大于規(guī)定的陰性對照0D值的2.1倍，即為陽性。圖3是以全長凝血第八因子為抗原(A)和以B區(qū)缺失凝血第八因子為抗原(B)免疫6周后小鼠血清酶聯(lián)免疫吸附試驗結(jié)果圖。分別以以全長凝血第八因子為抗原(A)和以B區(qū)缺失凝血第八因子為抗原(B)包板后用小鼠血清進(jìn)行對比稀釋后加入酶標(biāo)板中，反應(yīng)后顯色并在450nm波長下檢測?？梢钥闯鰞煞N抗原免疫小鼠6周后，血清中可以檢測到與各自抗原相結(jié)合的抗體，表明對小鼠免疫成功，可以進(jìn)行脾細(xì)胞融合。圖4中顯示顯色后的酶標(biāo)板的圖像，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中含有抗凝血第八因子的抗體時，抗體會與固定在酶標(biāo)板上的凝血第八因子抗原發(fā)生特異性結(jié)合，從而出現(xiàn)顯色反應(yīng)。圖中顏色較深的孔中說明有抗凝血第八因子抗體存在。酶標(biāo)板經(jīng)過酶標(biāo)儀對其顏色深度進(jìn)行量化，給出酶聯(lián)免疫吸附數(shù)據(jù)。用酶聯(lián)免疫吸附的方法分別篩選出約50株陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步克隆培養(yǎng)。在一周內(nèi)重復(fù)進(jìn)行篩選，陽性雜交瘤細(xì)胞數(shù)減小到20多株。表一是以全長凝血第八因子為抗原(A)和以B區(qū)缺失凝血第八因子為抗原(B)免疫6周后小鼠血清酶聯(lián)免疫吸附試驗結(jié)果數(shù)據(jù)。表一以全長凝血第八因子為抗原(A)和以B區(qū)缺失凝血第八因子為抗原(B)免疫6周后小鼠血清酶聯(lián)免疫吸附試驗結(jié)果數(shù)據(jù)表一(A)1/10001/20001/40001/80001/16000<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>續(xù)表一(A)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>續(xù)表一(B)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)施例2用蛋白印記方法篩選出抗凝血第八因子B區(qū)的抗體和Al+A2區(qū)的抗體(1)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中分離純化單克隆抗體每一株抗凝血第八因子單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞以1-2x105密度接種到5個T-75細(xì)胞培養(yǎng)方瓶中，每個方瓶中加入20毫升10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，細(xì)胞在37"C，5%二氧化碳濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中生長到80%，收集全部細(xì)胞培養(yǎng)液，加入同樣體積的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)到細(xì)胞生長到100%，再次收集全部細(xì)胞培養(yǎng)液，與第一次收集的細(xì)胞培養(yǎng)液混合備用。金黃色葡萄球菌的胞壁蛋白A，能夠特異性結(jié)合哺乳動物IgG分子的Fc片段，包括鼠源性抗體。將其固定于親水性瓊脂糖介質(zhì)，可有效的分離純化出高純度的IgG組分。收集培養(yǎng)好的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，4。C低溫每分鐘3000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速離心去除細(xì)胞碎片和懸浮細(xì)胞，再以0.45微米濾膜過濾，得到澄清的細(xì)胞培養(yǎng)液用于抗體的分離純化。小規(guī)模制備抗體，采用GEHeathcare公司的1毫升HiTrapproteinA預(yù)裝柱，一次可制備5mg以上的抗體蛋白。柱平衡與洗滌為0.02M磷酸氫二鈉，氯化鈉0.15M，pH7.2緩沖液,洗脫液為pH3.2，0.1M的檸檬酸鈉緩沖液。純化儀器為GEHeathcare公司的AKTAprimeplus。1毫升的蛋白A柱經(jīng)過10倍柱體積的平衡緩沖液平衡后上樣。100200ml的細(xì)胞培養(yǎng)液以每分鐘3毫升流速上樣，上樣結(jié)束后再用洗滌緩沖液沖洗，去除殘留的細(xì)胞培養(yǎng)液以及非特異結(jié)合的蛋白雜質(zhì)，約IO倍柱體積至紫外觀測值穩(wěn)定后，用低PH值的洗脫液以每分鐘2毫升流速洗脫蛋白A柱。紫外值上升時開始收集洗脫液峰值，至紫外趨緩，共約56毫升的抗體洗脫液，濃度約1000微克/毫升以上。用1MTris-HCl(pH3.2)調(diào)整收集液的pH至中性。然后4'C低溫環(huán)境在10倍體積的抗原抗體交聯(lián)緩沖液(O.IM碳酸氫鈉，0.5M氯化鈉，pH8.5)中透析4小時，再在相同的環(huán)境下透析過夜。在280nm紫外下測量蛋白含量，調(diào)節(jié)成l.l毫克/毫升，SDS-PAGE檢查純度，分裝后在-2(TC冰凍保存。(2)用蛋白印記方法(WesternBlot)對每一株抗凝血第八因子單克隆抗體進(jìn)行驗證分別選取分別以血漿來源凝血第八因子，基因重組全長和B區(qū)缺失的凝血第八因子作為蛋白印記的抗原進(jìn)行電泳上樣，電泳電壓100V,為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果在電泳中添加了預(yù)染的分子量標(biāo)記。電泳結(jié)束后選用PVDF膜轉(zhuǎn)膜，PVDF膜在轉(zhuǎn)膜之前，用甲醇浸泡10—15秒，浸泡后用清水漂洗，最后置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中，利用BIORAD的濕法轉(zhuǎn)膜設(shè)備進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜緩沖液為Tris-base0.025M,甘氨酸0.19M，20。/。甲醇。轉(zhuǎn)膜電壓100V，轉(zhuǎn)膜時間2個小時。轉(zhuǎn)膜完成后，PVDF膜利用PBST(磷酸二氫鉀2mM，磷酸氫二鈉10mM，氯化鈉137mM，氯化鉀2.7mM，吐溫200.05%)清洗，將膜上的轉(zhuǎn)移液洗掉后，放到封閉液中緩慢孵育，孵育2小時后4。C冰箱靜止過夜，其中封閉液配方為PBST中添加2%的脫脂奶粉。封閉完成后，先用PBST清洗膜3次，每次5分鐘，清洗干凈后，添加l:1000稀釋的小鼠抗凝血第八因子抗體，稀釋液為封閉液。添加抗體后，常溫下孵育1小時進(jìn)行一抗結(jié)合。一小時后，利用PBST清洗膜3次，每次5分鐘，清洗干凈后，添加1:5000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，繼續(xù)常溫下孵育。待孵育一小時后，用PBST清洗膜，洗膜3次，每次5分鐘，清洗后進(jìn)入暗室，膜上添加帶有熒光標(biāo)記的底物(ECL底物)，X膠片曝光后顯影定影，清水沖凈晾干，標(biāo)定Marker,進(jìn)行分析與掃描，利用膠片上條帶曝光的條帶位置及強(qiáng)弱。分別用全長和B區(qū)缺失凝血第八因子作抗原進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將在凝膠上分離的蛋白轉(zhuǎn)移到醋酸纖維膜上封閉后用不同的抗凝血第八因子單克隆抗體進(jìn)行蛋白印記檢測。通過這種方法，從以全長凝血第八因子作抗原的雜交瘤細(xì)胞中篩選出9株抗凝血第八因子B區(qū)的抗體，從以B區(qū)缺失凝血第八因子作抗原的雜交瘤細(xì)胞中篩選出14株抗凝血第八因子Al+A2區(qū)的抗體。圖5顯示的是用蛋白印記方法從以全長凝血第八因子作抗原的雜交瘤細(xì)胞中篩選出抗B區(qū)的單克隆抗體。(A)中顯示用代號為KF81-H的抗全長凝血第八因子的單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡試驗的結(jié)果。泳道1為全長凝血第八因子，泳道2為B區(qū)缺失凝血第八因子?？梢钥闯鯧F81-H不能結(jié)合B區(qū)缺失凝血第八因子，但與全長凝血第八因子顯示出數(shù)條分子量高于160kDa的條帶。(B)是判斷KF81-H單克隆抗體與全長凝血第八因子重鏈結(jié)合位點(diǎn)的示意圖?？梢酝茰y，KF81-H單克隆抗體的結(jié)合位點(diǎn)在距凝血第八因子重鏈氨基端160kDa處與羧基端之間。當(dāng)B區(qū)從羧基端被降解后KF81-H單克隆抗體失去其結(jié)合位點(diǎn)，因此無法顯示160kDa分子量以下的條帶。圖6顯示的是用蛋白印記方法從以B區(qū)缺失凝血第八因子作抗原的雜交瘤細(xì)胞中篩選出抗Al+A2區(qū)的單克隆抗體。(A)中顯示用代號為RF81-D3的抗凝血第八因子單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡試驗的結(jié)果。泳道1為全長凝血第八因子，泳道2為B區(qū)缺失凝血第八因子?？梢钥闯鯮F81-D3能結(jié)合B區(qū)缺失凝血第八因子。由于B區(qū)缺失凝血第八因子只有重鏈Al+A2區(qū)，其分子量約90kDa。可以觀察到RF81-D3與B區(qū)缺失凝血第八因子結(jié)合，顯示出在90-95kDa分子量的條帶。高于130kDa的條帶很可能是重鏈與輕鏈復(fù)合體的條帶。而在90-95kDa分子量的條帶上方?jīng)]有任何條帶。RF81-D3與全長凝血第八因子顯示出數(shù)條分子量高于95kDa的條帶。說明RF81-D3可以檢測出A1+A2與不同長度的B區(qū)的中間體。(B)是判斷RF81-D3單克隆抗體與全長凝血第八因子重鏈結(jié)合位點(diǎn)的示意圖?？梢酝茰y，RF81-D3與全長凝血第八因子重鏈結(jié)合位點(diǎn)在Al+A2區(qū)域。實(shí)施例3用實(shí)施例2中不同抗體作為一抗用于凝血第八因子的ELISA檢測分別選擇(A)抗A1+A2區(qū)的單克隆抗體，和(B)抗A1+A2區(qū)的單克隆抗體和抗B區(qū)的單克隆抗體的混合抗體作為包板的一抗用于ELISA檢測。用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗時將8毫克辣根過氧化物酶放入1毫升玻璃瓶，加入l毫升水溶解，室溫逐漸滴入0.2毫升碘酸鈉并攪拌均勻，然后在4'C醋酸鈉溶液中透析過夜?？贵w在4"ClmM醋酸鈉溶液中透析過夜，加入0.2M碳酸鈉溶液將pH調(diào)整至9.0，混勻后以l:1比例立即加入透析好的抗體，用0.2M碳酸鈉溶液將pH調(diào)整至9.0，室溫攪拌3小時，再加入新配制的硼氫化鈉溶液100微升，4'C放置2小時后保存。ELISA檢測采用用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法。一抗包被使用0.05MpH9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為110微克/毫升。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1毫升，4r過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。加一定稀釋的待檢樣品O.lml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37。C孵育I小時。然后洗滌。同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔。加酶標(biāo)抗體于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)O.l毫升。37'C孵育0.51小時，洗滌。加底物液顯色于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1毫升，37°C1030分鐘。終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05毫升。在ELISA檢測儀上以450nm讀取吸光度值，以養(yǎng)性對照的吸光度數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)試驗樣品的吸光度值測算樣品濃度。以兩種不同一抗所得到的數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算線性區(qū)間和線性回歸系數(shù)。表2為不同抗體作為一抗用于凝血第八因子的ELISA檢測結(jié)果。表二中分別選擇(A)抗Al+A2區(qū)的單克隆抗體，以及(B)抗Al+A2區(qū)的單克隆抗體和抗B區(qū)的單克隆抗體的混合抗體作為包板的一抗的ELISA檢測結(jié)果。表二不同抗體作為一抗用于凝血第八因子的ELISA檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>圖7為分別選擇(A)抗Al+A2區(qū)的單克隆抗體，以及(B)抗Al+A2區(qū)的單克隆抗體和抗B區(qū)的單克隆抗體的混合抗體作為包板的一抗的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。(A)為用抗A1+A2單克隆抗體包板，對10國際單位/毫升凝血第八因子原液進(jìn)行對比稀釋后進(jìn)行檢測的結(jié)果繪制成的對數(shù)曲線，其線性范圍為0.078—2.5國際單位/毫升，相當(dāng)于抗原濃度15.6—500納克/毫升。(B)為用抗A1+A2和抗B的混合抗體包板，對10國際單位/毫升凝血第八因子原液進(jìn)行對比稀釋后進(jìn)行檢測的結(jié)果繪制成的對數(shù)曲線，其線性范圍為0.078—0.313國際單位/毫升，相當(dāng)于抗原濃度15.6—62.6納克/毫升。從標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍可以看出，選用抗Al+A2區(qū)的單克隆抗體作為一抗，其線性區(qū)域遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于選用抗Al+A2區(qū)的單克隆抗體和抗B區(qū)的單克隆抗體的混合抗體作為包板的一抗的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。因此，應(yīng)該選用抗Al+A2區(qū)的單克隆抗體作為一抗包板做成Elisa酶標(biāo)板用于凝血第八因子抗原的檢測試劑盒。實(shí)施例4篩選適合用于凝血第八因子抗原檢測和分離純化的抗體用免疫沉淀(Immuno-precipitation,IP)和凝血第八因子凝血活性檢測聯(lián)合方法，分別以血漿來源凝血第八因子和基因重組凝血第八因子作為抗原，對步驟C中篩選出的Al+A2區(qū)的單克隆抗體進(jìn)行檢測。免疫沉淀方法是利用抗原抗體之間的相互作用而結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，然后用抗體重鏈與固定在凝膠介質(zhì)上的蛋白A或蛋白G的結(jié)合，使抗原抗體復(fù)合物被蛋白A凝膠介質(zhì)沉淀并與液體分離的一種方法。根據(jù)這個實(shí)驗原理，可以通過檢測免疫沉淀反應(yīng)之后反應(yīng)體系上清中的凝血第八因子的凝血活性的方法，判斷抗原抗體反應(yīng)中抗體與抗原結(jié)合的能力。凝血第八因子凝血活性檢測操作完全參照DiagnosticaStago儀器操作說明手冊。其測定的基本原理是在腦磷脂、激活劑，以及除因子vin外其他所有的因子都穩(wěn)定且過剩的存在下，通過測定凝固時間來進(jìn)行分析。部分凝血活酶(APTT)先預(yù)熱至37。C后保溫，然后與凝血因子八缺乏血漿混合備用。測試開始時向反應(yīng)中加入20-100微升測試樣品，37'C保溫2分鐘，再加入37。C預(yù)熱的濃度0.001-0.004M氯化鈣溶液，記錄凝固時間。使用定標(biāo)血漿，質(zhì)控血漿來做標(biāo)準(zhǔn)和參照，計算出樣品中八因子的含量。將基因重組凝血第八因子凍干制劑溶解于(1)低鹽濃度的免疫沉淀緩沖液中(Tris0.02M，氯化鈣0.0006M，氯化鈉0.5M，乙二醇5%，pH6.2);(2)高鹽濃度的免疫沉淀緩沖液中(Tris0.02M，氯化鈣0.0006M，氯化鈉1.5M，乙二醇5%，pH6.2)分別至終濃度20國際單位/毫升。向2毫升離心管中加入0.5毫升凝血第八因子溶液，然后加入5-20微克純化的實(shí)施例2篩選的抗凝血第八因子Al+A2區(qū)的抗體?？乖贵w在4'C溫度環(huán)境下混合2-20小時后，在免疫沉淀反應(yīng)中加入20微升蛋白A+G凝膠介質(zhì)，然后繼續(xù)在4。C溫度環(huán)境下混合l-4小時后取出，室溫靜置10-20分鐘，待凝膠介質(zhì)沉降到試管底部后取上清，立即進(jìn)行凝血第八因子凝血活性(FVIII:C)的檢測。與無抗體添加的免疫沉淀反應(yīng)上清相比第八因子的凝血活性降低可得出清除率，即(無抗體上清FVni:C-有抗體上清FVm:C)/無抗體上清FVIII:C的比值。兩種不同免疫沉淀條件下抗體對凝血第八因子的清除率見表三。結(jié)果通過上述方法從實(shí)施例2篩選的14株抗凝血第八因子Al+A2區(qū)的抗體中篩選出8株在鹽濃度提高時與凝血第八因子結(jié)合力增強(qiáng)的單克隆抗體。將選出的8株株抗凝血第八因子Al+A2區(qū)的抗體進(jìn)行進(jìn)一步篩選，把免疫沉淀高鹽緩沖液中的乙二醇濃度從5%提高到40%，并用同樣的方法進(jìn)行檢測上清中的凝血第八因子凝血活性和清除率。將基因重組凝血第八因子凍干制劑溶解于(1)高鹽濃度的免疫沉淀緩沖液中(Tris0.02M，氯化媽0.0006M，氯化鈉1.5M，乙二醇5%，pH6.2)，(2)高鹽和乙二醇濃度的免疫沉淀緩沖液中(Tris0.02M，氯化鈣0.0006M，氯化鈉1.5M,乙二醇40%，pH6.2)分別至終濃度20國際單位/毫升。向2毫升離心管中加入0.5毫升凝血第八因子溶液，然后加入5-20微克純化的上述8株待篩選的抗凝血第八因子Al+A2區(qū)的抗體?？乖贵w在4'C溫度環(huán)境下混合2小時后，在免疫沉淀反應(yīng)中加入20微升蛋白A+G凝膠介質(zhì)，然后繼續(xù)在4T:溫度環(huán)境下混合1小時后取出，室溫靜置10-20分鐘，待凝膠介質(zhì)沉降到試管底部后取上清，立即進(jìn)行凝血第八因子凝血活性的檢測。結(jié)果(1)在低鹽和高鹽兩種不同緩沖液條件下進(jìn)行免疫沉淀。將基因重組的凝血第八因子作為抗原分別與不同的單克隆抗體反應(yīng)后用蛋白A沉淀后，檢測上清中的凝血第八因子的凝血活性(FVIII:C)。圖8A可以看出14株抗體中8株抗體在低鹽時免疫沉淀對凝血第八因子清除率高于70%,說明這些抗體結(jié)合凝血第八因子的能力比較強(qiáng)。可以看到在鹽濃度升高時，這些抗體對凝血第八因子清除率進(jìn)一步提高，達(dá)到90%以上，提示這些抗體很可能是以疏水鍵與凝血第八因子抗原結(jié)合的抗體。(2)乙二醇濃度提高后檢測上清中的凝血第八因子凝血活性和清除率。圖8B可以看出這8株抗體在有髙濃度乙二醇的條件下，與凝血第八因子結(jié)合的能力都不同程度地有所下降。由于乙二醇可以減低抗原抗體之間疏水性結(jié)合的能力，這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步提高了這8株抗體是以疏水鍵與凝血第八因子抗原結(jié)合的可能性，根據(jù)這些數(shù)據(jù)挑選出1-2株體制作成免疫親和層析柱用于凝血第八因子的分離純化。表三免疫沉淀時不同鹽濃度對凝血八因子活性清除率的影響14株FVIIImAb編號低鹽緩沖液上清中FVIII活性(IU/ml)活性降低(％)高鹽緩沖液上清中FVIII活性(IU/ml)活性降低(％)無抗體對照2.50.001.410.00RF81-G42.2310.801.1220.57RF81-B121.9721.201.0823.40RF81-G90.5578.000.1192.20RF81-F32.66-6.400,7646.10RF81-F51.6235.201.2114.18RF81-A121.3247.200.9929.79RF81-E41.6534.001.0823.40RF81-H110.5578.000.1192.20RF81-D90.5179.600.1291.49RF81-D120.5378,800.1291.49RF81-B20.6275.200,1390.78RF81-E120.5876.800.1390.78RF81-D30.5179.600.1490.07RF81-H90.5976.400.1192.20實(shí)施例5親和層析方法分離純化血漿來源和基因重組凝血第八因子將實(shí)施例4篩選的單克隆抗體純化后與溴化氫(CNBr)活化的瓊脂糖21凝膠Sepharose-4B介質(zhì)偶聯(lián)制成免疫親和層析柱。步驟如下將用等體積的2-4t:去離子水浸泡Sepharose-4B介質(zhì)，然后加入兩倍體積的2.0M碳酸氫鈉溶液，加入CNBr至終濃度60克/升混勻并孵育10-30分鐘。用2倍體積的抗原抗體交聯(lián)緩沖液(碳酸氫鈉O.IM，氯化鈉0.5M，pH8.5)清洗5次后將Sepharose-4B介質(zhì)轉(zhuǎn)移至燒杯中，立即加入透析處理過的單克隆抗體。加入的抗體量為每毫升Sepharose-4B介質(zhì)1-10毫克抗體。交聯(lián)反應(yīng)4。C過夜，第二天用2體積的抗原抗體交聯(lián)緩沖液(碳酸氫鈉0.1M，氯化鈉0.5M，pH8.5)清洗5次后用2倍體積pH8.0的0.2M甘氨酸溶液封閉室溫30分鐘。然后用2體積pH3.5的醋酸鈉0.1M，氯化鈉0.5M清洗5次，再用2體積pH3.5的醋酸鈉lOmM溶液清洗5次后置于2-8'C保存。將上述凝血第八因子單克隆抗體偶聯(lián)的Sepharose-4B介質(zhì)裝在5毫升的層析柱體中，在室溫環(huán)境下用20毫升蒸餾水清洗后用20毫升平衡液(氯化鈉0.5M，氯化牽丐0.05M，1.0%曲納通TritonX-100，pH7.4)平衡層析柱，將5毫升重組第八因子細(xì)胞培養(yǎng)液上柱，收集全部18毫升流穿液后用20毫升清洗緩沖液(咪唑0.05M，氯化鈣0.04M,乙二醇5%，1.0%曲納通TritonX-lOO，pH6.4)清洗層析柱，然后用10-20毫升洗脫液(咪唑0.05M，氯化鈣0.04M，乙二醇40%，1.0%曲納通TritonX-lOO,pH6.4)將結(jié)合在層析柱上的凝血第八因子洗脫下來，用酶聯(lián)免疫吸附法和活性法檢測凝血第八因子，結(jié)果見表四。從Elisa試驗數(shù)據(jù)可以看出陽性對照樣品在稀釋64倍后吸光度為0.493，相當(dāng)于乙二醇試驗中流穿液稀釋2倍時的吸光度和洗脫液稀釋16倍時的吸光度(分別以下劃線在表四中標(biāo)出)。如果以陽性對照樣品1中的0.493為基準(zhǔn)估算，穿透量18ml/(5mlX25)=11.25%洗脫量13ml/(5mlX22)=65%因此，粗略估算在沒有進(jìn)行上樣和洗脫條件優(yōu)化的情況下，抗體親和層析柱對凝血第八因子結(jié)合率大于80%，回收率大于60%。表四親和層析方法分離純化血漿來源和基因重組凝血第八因子試驗Elisa結(jié)果稀釋倍數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>以上對本發(fā)明所提供的篩選適用于檢測和純化凝血第八因子的單克隆抗體的方法進(jìn)行了詳細(xì)介紹，本文中應(yīng)用了具體個例對本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想；同時，對于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，在具體實(shí)施方式及應(yīng)用范圍上均會有改變之處，綜上所述，本說明書內(nèi)容不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。權(quán)利要求1.一種篩選適用于檢測凝血第八因子的單克隆抗體的方法，其特征在于，包含以下步驟a.分別用全長凝血第八因子和B區(qū)缺失的凝血第八因子免疫動物，用酶聯(lián)免疫吸附法篩選抗凝血第八因子呈陽性的單克隆抗體；b.用蛋白印記方法從以全長凝血第八因子免疫動物產(chǎn)生的陽性單克隆抗體中篩選出抗B區(qū)的抗體，從以B區(qū)缺失的凝血第八因子免疫動物產(chǎn)生的陽性單克隆抗體中篩選出抗A1+A2區(qū)的抗體；c.分別選擇抗A1+A2區(qū)的單克隆抗體，以及抗A1+A2區(qū)的單克隆抗體和抗B區(qū)的單克隆抗體的混合抗體用于ELISA檢測，對實(shí)驗中所得到的結(jié)果進(jìn)行比較，篩選出適合作為ELISA檢測的抗A1+A2區(qū)單克隆抗體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選適用于檢測凝血第八因子的單克隆抗體的方法，其特征在于所述的全長凝血第八因子和B區(qū)缺失的凝血第八因子均為基因重組凝血第八因子。3.—種檢測凝血第八因子的試劑盒，其特征在于采用權(quán)利要求1或2篩選的抗凝血第八因子的單克隆抗體作為一抗包板。4.一種篩選適用于凝血第八因子分離純化的單克隆抗體的方法，其特征在于，包括如下步驟A.用B區(qū)缺失的凝血第八因子免疫動物，篩選抗A1+A2區(qū)的單克隆抗體；B.用免疫沉淀方法和凝血第八因子凝血活性檢測，以凝血第八因子作為抗原，對步驟A中篩選出的抗A1+A2區(qū)的單克隆抗體進(jìn)行檢測，篩選出能在低濃度鹽和低濃度乙二醇環(huán)境下與凝血第八因子結(jié)合的單克隆抗體；C.對步驟B篩選出的單克隆抗體進(jìn)行進(jìn)一步篩選，在免疫沉淀實(shí)驗過程中提高反應(yīng)的鹽濃度，篩選出在鹽濃度提高時與凝血第八因子結(jié)合力增強(qiáng)的單克隆抗體；D.對步驟C篩選出的單克隆抗體進(jìn)行進(jìn)一步篩選，在免疫沉淀實(shí)驗過程中在提高反應(yīng)的鹽濃度的同時提高乙二醇的濃度，并與未提高乙二醇的濃度時的數(shù)據(jù)相比較，篩選出在提高乙二醇的濃度時結(jié)合力降低的單克隆抗體。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟A中，所述B區(qū)缺失的凝血第八因子為基因重組凝血第八因子。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟B中，所述的凝血第八因子是血槳來源凝血第八因子或基因重組凝血第八因子。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟B中，所述的低濃度鹽為0.5M氯化鈉，低濃度乙二醇的濃度為5wt%。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟C中，所述的鹽濃度是1.5M氯化鈉。9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟D中，所述的乙二醇的濃度是40wty。。10.采用權(quán)利要求4篩選的抗凝血第八因子A1+A2區(qū)的單克隆抗體制備的用于純化凝血第八因子的抗體親和層析柱。全文摘要本發(fā)明公開了一種篩選適用于檢測和純化凝血第八因子的單克隆抗體的方法。該篩選適用于檢測凝血第八因子的單克隆抗體的方法，分別用全長凝血第八因子和B區(qū)缺失的凝血第八因子免疫動物，篩選抗凝血第八因子呈陽性的單克隆抗體；從以全長凝血第八因子免疫動物產(chǎn)生的陽性單克隆抗體中篩選出抗B區(qū)的抗體，從以B區(qū)缺失的凝血第八因子免疫動物產(chǎn)生的陽性單克隆抗體中篩選出抗A1+A2區(qū)的抗體；以混合抗體用于ELISA檢測，篩選出適合作為ELISA檢測的單克隆抗體。以本發(fā)明所述的方法可以得到高靈敏度和高特異度的適用于酶聯(lián)免疫吸附法檢測凝血第八因子的單克隆抗體。本發(fā)明篩選抗體條件易控制，成本低。文檔編號G01N33/577GK101303356SQ200810126759公開日2008年11月12日申請日期2008年6月20日優(yōu)先權(quán)日2008年6月20日發(fā)明者許賢豪申請人:許賢豪