專利名稱：：Tgm2檢測方法、檢測試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及使用TGM2的檢測方法、檢測試劑盒及其應(yīng)用，具體而言，涉及含有單獨(dú)使用新的標(biāo)志物檢測HCC或者與AFP聯(lián)用檢測AFP陰性的HCC的方法、檢測試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：肝癌(Livercancer)是一種嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤，2000年全世界新發(fā)病例約564，000人，在所有惡性腫瘤中排第五位。由于其惡性程度高、預(yù)后不良，五年生存率不足10%。中國是肝癌的高發(fā)區(qū)，集中了全世界約54%的新發(fā)病例，其中肝細(xì)胞肝癌(hepatocellularcarcinomas,HCC)占原發(fā)性肝癌的90%以上[1'2]。據(jù)1991-2000年間，中國169，871人口的死因抽樣調(diào)查顯示，它的死亡率排在全部惡性腫瘤的第2位，年死亡率為54.7/100，000(男81.2，女29.0)[3]。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)是目前臨床上認(rèn)可的肝細(xì)胞肝癌標(biāo)志物。20世紀(jì)50年代，Bergstrand等人首次在人類胎兒血清中發(fā)現(xiàn)了這種電泳遷移率相當(dāng)于曱種球蛋白的蛋白質(zhì)，在正常成人血清中并沒有檢測到它的存在["。1960年，AbelevG及其同事在小鼠的肝細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)了這種甲種球蛋白，它不存在于正常小鼠的任何組織中，經(jīng)證實(shí)它是胎鼠血清中的主要成分，在成年鼠肝細(xì)胞再生時會重新出現(xiàn)[5]。后來，肝細(xì)胞肝癌患者和畸胎瘤患者血清中胚胎特異性的曱種球蛋白也被檢測出來[6'"。因此，人們將這種主要存在于胎兒組織的蛋白命名為甲胎蛋白。目前已知，AFP是一種分泌型糖蛋白，與白蛋白同屬于白蛋白樣類動物和人胚胎期血清中，由胚胎發(fā)育時期卵黃嚢內(nèi)胚層和胎肝合成并分泌到血液中。在人類胚胎中AFP最高濃度可達(dá)3-4mg/ml,出生后，血清中AFP濃度迅速下降，新生兒期約為10-50jag/ml,正常成人一般在10ng/ml以下。懷孕期間母體血清中AFP濃度的變化可以提示多種胚胎發(fā)育缺陷[8]。而成人中，升高的血清AFP水平不僅存在于60%-70%的肝細(xì)胞肝癌病人，也可見于大約20%的慢性肝炎，20%-60%的肝炎肝硬化和某些胚胎性癌患者[9〗。在有慢性肝炎和肝硬化背景的肝細(xì)胞肝癌患者中，AFP的診斷價(jià)值更低[1°'11]。綜上所述，AFP對于肝細(xì)胞肝癌患者的判別靈敏度介于41%-97%之間，特異度在80%-95%，而陽性預(yù)測值徘徊在9%-58%之間[1°-12]。更為重要的是，臨床上有20%-30%的肝細(xì)胞肝癌患者血清AFP水平并不升高，從而大大限制了其在肝細(xì)胞肝癌臨床檢查中的應(yīng)用價(jià)值。因此，目前迫切需要找到能夠與AFP聯(lián)合使用，提高HCC診斷準(zhǔn)確度的新標(biāo)志物，尤其是血清AFP水平不高的肝細(xì)胞肝癌分子標(biāo)志物，以及基于所述標(biāo)志物的新的肝癌檢測方法和可以進(jìn)行方便快捷的檢測試劑盒。
發(fā)明內(nèi)容為了解決上述問題，本發(fā)明人利用細(xì)胞培養(yǎng)中的穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)結(jié)合高精度質(zhì)譜(nanoLTQ-FTMS/MS)的定量蛋白質(zhì)組研究策略分析了兩個具有不同AFP表達(dá)特性的肝癌細(xì)胞系HepG2(AFP陽性)和SK-HEP-1(AFP陰性)與正常肝細(xì)胞系HL-7702之間的差異表達(dá)蛋白質(zhì)譜，鑒定出一個在AFP陰性的SK-HEP-1肝癌細(xì)胞中明顯高表達(dá)的蛋白質(zhì)，即組織轉(zhuǎn)谷氨酰氨酶2(Tissuetransglutaminase2,TGM2)。該蛋白具有多種異構(gòu)體形式，在SK-HEP-1中的表達(dá)水平是HepG2的15倍，是HL-7702中的35倍。TGM2屬于轉(zhuǎn)谷氨酰氨酶蛋白家族，具有0&2+依賴的轉(zhuǎn)酰氨基作用，能夠?qū)⒐劝彼釟埢宦?lián)到蛋白質(zhì)的賴氨酸e-氨基上，導(dǎo)致蛋白多聚化5或蛋白質(zhì)交聯(lián)。此外，TGM2還具有GTP結(jié)合能力(封閉其轉(zhuǎn)酰氛基作用)，發(fā)揮Goch蛋白活性，與Gph和oclB-腎上腺素受體形成四聚體，調(diào)節(jié)受體激活的PLC活性。新近發(fā)現(xiàn)，TGM2還具有脫氨基酶、二肽酶、二硫異構(gòu)酶活性，在人乳腺癌細(xì)胞膜上的TGM2還有Ser/Thr蛋白激酶活性，能夠?qū)GFBP3(具有IGF非依賴的促凋亡活性)磷酸化，從而誘導(dǎo)死亡受體中介的細(xì)胞凋亡信號[13—17]。因此，TGM2是一個多功能蛋白分子，參與細(xì)胞分化、凋亡、細(xì)胞黏附、受體中介的內(nèi)吞和細(xì)胞運(yùn)動遷移等多種生物學(xué)過程，尤其是其在細(xì)胞凋亡中的作用具有兩面性，其具體的作用依賴于不同細(xì)胞類型中特異存在的凋亡通路、刺激的種類、亞細(xì)胞定位和TGM2各種酶活性的轉(zhuǎn)換等因素["'18]。已有文獻(xiàn)證明，TGM2在乳腺癌、黑色素瘤和胰腺導(dǎo)管腺癌中高表達(dá)，并與化療耐藥和侵襲表型相關(guān)[19-21]。在胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞中，TGM2可以通過AIF依賴，caspase非依賴途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡[22]。定位于腫瘤基質(zhì)中的TGM2，還可以抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程[23'2"。因此，在肺瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，TGM2具有多樣的功能。針對肝臟的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGM2在肝纖維化的早期表達(dá)上調(diào)，但隨著病程進(jìn)展，其表達(dá)量又逐漸下降。此外，在肝再生過程中，它還可以作用于a1B-腎上腺素受體通路125—29)。在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，發(fā)明人首次建立了將該TGM2分子用于AFP陰性肝癌的輔助診斷來降低誤診的方法、檢測試劑盒及其應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明提供了檢測待測生物樣品中的TGM2水平是否異常，進(jìn)而獲得作為中間結(jié)果的信息的方法，所述方法包括步驟1)測定待檢生物樣品中的TGM2水平；2)比較待檢生物樣品中的TGM2水平和標(biāo)準(zhǔn)生物樣品對照的TGM2水平；3)獲得作為中間結(jié)果的信息，4)根據(jù)比較結(jié)果確定待檢生物樣品是否有可能是HCC樣品。2.所述1的方法，進(jìn)一步包括與AFP聯(lián)合檢測。3.所述1或2的方法，其中步驟1)的生物樣品是已經(jīng)脫離人體或者動物體的組織、體液或者排泄物。4.所述1或者2的方法，其中步驟l)的生物樣品是組織和血清。5.所述1或2的方法，其中步驟1)的測定是Western印記或者免疫組織化學(xué)或ELISA法。6.所述1的方法，其中步驟1)的測定是對TGM2水平的下調(diào)的測定。7.使用TGM2檢測AFP陰性的HCC的方法，所述方法包括步驟1)測定待檢生物樣品中的TGM2水平；2)比較待檢生物樣品中的TGM2水平和標(biāo)準(zhǔn)生物樣品對照的TGM2水平；3)根據(jù)比較結(jié)果確定待檢生物樣品是否是HCC樣品。7.所述6的方法，其中步驟1)的生物樣品是組織和血清。8.所述6的方法，其中步驟1)的測定是Western印記或者免疫組織化學(xué)或ELISA法。9.TGM2作為HCC的標(biāo)志物的用途。10.所述9的用途，其中TGM2與AFP聯(lián)合應(yīng)用。11.用于檢測TGM2的AFP陰性的HCC檢測試劑盒。12.所述ll的AFP陰性的HCC檢測試劑盒用途，其中包括作為標(biāo)準(zhǔn)的TGM2、抗TGM2抗體。13.用于聯(lián)合檢測TGM2和AFP的HCC檢測試劑盒，其中包括作為標(biāo)準(zhǔn)的TGM2、抗TGM2抗體；作為標(biāo)準(zhǔn)的AFP、抗AFP抗體。本發(fā)明提供了使用TGM2檢測AFP陰性HCC的方法，所述方法包括步驟1)測定待檢生物樣品中的TGM2水平；2)比較待檢生物樣品中的TGM2水平和標(biāo)準(zhǔn)生物樣品對照的TGM2水平；3)根據(jù)比較結(jié)果確定待檢生物樣品是否可能是HCC樣品。任選地，上述的方法的步驟1)的生物樣品是組織和血清。任選地，上述的方法的步驟l)的測定是Western印記或者免疫組織化學(xué)或ELISA法。任選地，上述的方法的步驟1)的測定對TGM2水平的下調(diào)的測定。一方面，本發(fā)明提供了TGM2作為HCC的標(biāo)志物的用途。任選地，上述的用途中，TGM2與AFP聯(lián)合應(yīng)用。另一方面，本發(fā)明提供了用于檢測TGM2的AFP陰性的HCC檢測試劑盒，還提供了用于聯(lián)合檢測TGM2和AFP的HCC檢測試劑盒。所述試劑盒，其中包括作為標(biāo)準(zhǔn)的TGM2、抗TGM2抗體；或者其中還包括作為標(biāo)準(zhǔn)的TGM2、抗TGM2抗體；作為標(biāo)準(zhǔn)的AFP、抗AFP抗體，此外圖1.TGM2在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)情況。其中，(A)TGM2在18例肝癌配對組織中的Western印記結(jié)果。圖中，N代表癌旁正常組織；C代表腫瘤組織。每一例右側(cè)的條形圖表示TGM2在癌旁正常組織和肺瘤組織中的相對表達(dá)量(TGM2/p-actin的灰度值)。(B)TGM2代表性的免疫組織化學(xué)染色圖(200x)。其中，l和2是一例AFP陰性病例的腫瘤和癌旁正常組織；3和4是一例AFP陽性病例的腫瘤和癌旁組織。圖2.HepG2細(xì)胞中AFP-siRNA的特異性沉默效應(yīng)。用如圖所示的20nM、50nM、100nM、150nM和200nMAFP-siRNA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染72h后收獲細(xì)胞，經(jīng)Western印記檢測AFP和TGM2的表達(dá)水平。|3-actin作為上樣量對照。圖3TGM2在標(biāo)準(zhǔn)健康對照和HCC患者血清中的濃度分布圖?？v軸代表了其在兩組人群中的分布變異，每一個盒子代表了中間50%數(shù)據(jù)的分布情況，盒子中間的線代表中位值，上、下邊界代表75%和25%百分位數(shù)。盒子上方和下方的短橫線代表數(shù)據(jù)的最大值和最小值。圓點(diǎn)代表異常值。從圖中可以看出，HCC患者的血清TGM2濃度明顯高于健康對照。具體實(shí)施例方式為了進(jìn)一步清楚地闡述本發(fā)明，下面提供了本發(fā)明的具體實(shí)施例，不過本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于所述實(shí)施例，任何本法的方法和產(chǎn)品的等價(jià)的變形和修飾等都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)施例1:AFP與TGM2的關(guān)系的Western印記分才斤鑒于TGM2在腫瘤發(fā)生發(fā)展以及肝再生、肝纖維化中的重要作用，發(fā)明人對其在肝癌組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了大樣本量的驗(yàn)證分析。使用TransglutaminaseIIAb-l抗體(美國Labvision公司，CloneCUB7402，Cat.No.MS-224-P)對18對配對肝癌組織作了Western印記分析，結(jié)果表明TGM2在50%(3/6)的AFP陰性的病例中表達(dá)上調(diào)，而12例AFP陽性病例全部表現(xiàn)為表達(dá)下調(diào)。更為重要的是，6例AFP陰性病例中，有4例表現(xiàn)出腫瘤組織內(nèi)存在多個低分子量的異構(gòu)體形式，而12例AFP陽性病例中，這種異構(gòu)體僅存在于9例癌旁正常組織中(圖1A)。經(jīng)過Fisher精確概率檢驗(yàn)，這一現(xiàn)象在兩組之間具有顯著性差異(p-0.0049)。實(shí)施例2:AFP與TGM2的關(guān)系的免疫組織化學(xué)染色分析對47例肝細(xì)胞肝癌樣本的免疫組織化學(xué)染色(圖IB)發(fā)現(xiàn)TGM2主要定位于胞漿和細(xì)胞膜。在29例AFP陰性的病例中，16例表現(xiàn)為腫瘤中表達(dá)上調(diào)(55.2%)，而18例AFP陽性病例中，僅有3例的TGM2在胂瘤中表達(dá)上調(diào)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，TGM2的表達(dá)水平與AFP表達(dá)狀態(tài)明顯相關(guān)，其在不同AFP表達(dá)特性的兩組中差異具有顯著性(p=0.0354)，但是，其表達(dá)與腫瘤大小、分化程度等指標(biāo)之間沒有明顯相關(guān)性。綜合Western印記和免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(有4例樣品為兩者共用)，TGM2在一半的AFP陰性病例(17/32)中表達(dá)上調(diào)，而29例AFP陽性病例中只有3例表達(dá)上調(diào)。這一差異與病例個體的AFP表達(dá)9狀態(tài)明顯相關(guān)(p=0.0034)。而且，經(jīng)Spearman等級相關(guān)檢驗(yàn)，組織中TGM2表達(dá)特性與血清中AFP表達(dá)水平呈現(xiàn)一種負(fù)相關(guān)關(guān)系(p<0.0001,相關(guān)系數(shù)=0.4693),也就是說個體血清AFP表達(dá)水平越低，其組織中越表現(xiàn)出TGM2在腫瘤中表達(dá)上調(diào)的趨勢。結(jié)合已有文獻(xiàn)，血清中高水平的AFP是肝細(xì)胞肝癌的一個獨(dú)立的不良預(yù)后因素(3°，認(rèn)為，TGM2在肝損傷中可能發(fā)揮保護(hù)作用，而且其與AFP之間存在一定的功能聯(lián)系。實(shí)施例3:TGM2與AFP之間的功能相關(guān)性的驗(yàn)證為了進(jìn)一步證明TGM2與AFP之間的功能相關(guān)性，發(fā)明人設(shè)計(jì)并化學(xué)合成了針對AFP的siRNA，在AFP高表達(dá)的HepG2細(xì)胞中，特異性的下調(diào)了AFP的表達(dá)。該siRNA針對人類AFPmRNA開放閱讀框的560-579位核苷酸，其序列為5，-CUUCCUGUAUGCACCUACAA-dTdT-3，。同時，使用了一段基因組無關(guān)的隨機(jī)序列作為該siRNA的陰性對照，其序列為5，-UUCUCCGAACGUGUCACGU-dTdT-3，.。具體轉(zhuǎn)染條件如下(1)細(xì)胞準(zhǔn)備取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞(肝癌細(xì)胞系，購自美國典型培養(yǎng)物收集中心)，胰酶消化，按照50%~60%的密度接種于24孔板中，每孔加入含10%胎牛血清的MEM完全培養(yǎng)基(MEM液體培養(yǎng)基產(chǎn)自美國GibcoBRL公司，胎牛血清產(chǎn)自奧地利PAA公司)500ju1,混勻備用；(2)瞬時轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備首先將上述siRNA序列退火處理(2.5nM的雙鏈siRNA加入125ju1通用緩沖液，90。C保溫2分鐘，自然冷卻到室溫后，4。C放置過夜備用)。使用美國invitrogen公司的LipofectAMINE2000(Cat.No.11668-019)轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行siRNA的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法詳見說明書。實(shí)驗(yàn)時，同時設(shè)立20nM、50nM、100nM、150nM和200nMAFP-siRM組，每組i殳立三個平行孔，同時設(shè)立陰性對照。簡而言之，針對每一孔來說，將不同終濃度的siRM加入50p1Opti-MEM培養(yǎng)基中，同時，將LipofectAMINE2000試劑輕柔混勻，取ljalLipofectAMINE2000試劑在另一管中與50jalOpti-MEM培養(yǎng)基混合，室溫孵育5分鐘。將稀釋好的siRNA與稀釋后的LipofectAMINE2000在30分鐘之內(nèi)混合，輕輕顛倒混勻，室溫孵育20分鐘。而后將不同濃度的siRNA與LipofectAMINE2000的混合物lOOp1加入培養(yǎng)孔中，每孔的LipofectAMINE2000最終用量為0.17%。(3)細(xì)胞在37。C，5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h,而且裂解細(xì)胞，用Western印記進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，設(shè)計(jì)的AFP-siRNA序列以濃度依賴性的方式，有效下調(diào)HepG2細(xì)胞中AFP的表達(dá)，200nM的AFP-siRNA能減少50%~60%的AFP表達(dá)。與此同時，發(fā)現(xiàn)隨著AFP-siRM用量的增加，TGM2的表達(dá)水平逐漸增加(圖2)。這一結(jié)果表明，在肝癌細(xì)胞中，AFP可能是TGM2的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，部分調(diào)控TGM2的表達(dá)。實(shí)施例4:TGM2的血清ELISA檢測及該方法的臨床檢測應(yīng)用雖然TGM2不具有信號肽和跨膜區(qū)，但文獻(xiàn)報(bào)道，約有10-20%的TGM2可以存在于細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)中，因此，目前i人為，它可以經(jīng)非經(jīng)典分泌途徑分泌到細(xì)胞外(13]。然而，在人類血漿蛋白質(zhì)組計(jì)劃(H蘭nPlasmaProteomeProject,HPPP)產(chǎn)生的正常人血漿蛋白高可信數(shù)據(jù)集(含3020個蛋白質(zhì))中，并沒有檢測到該蛋白的存在。同時，目前沒有任何TGM2可以出現(xiàn)在正常或各種腫瘤患者血漿中的相關(guān)報(bào)道?；谶@一蛋白的表達(dá)特性和申請人在肝癌組織中的驗(yàn)證結(jié)果，申請人:推測，TGM2可以被肝癌細(xì)胞分泌并進(jìn)入血清/血漿，并作為肝癌早期血清學(xué)檢測的特異性標(biāo)志物。因此，申請人首次建立了高靈敏度的人類TGM2的血清間接雙夾心ELISA檢測方法，并對其檢測結(jié)果進(jìn)行了評價(jià)。該方法的具體步驟為1.包被用pH9.6的50mM碳酸鹽緩沖液(15mMNa2C03;35mMNaHC03)作為稀釋液，將山羊抗人TGM2抗體(TGase2(N-18)，SantaCruzBiotechnology公司，Cat.No.sc-34543)稀釋為2yg/ml。在聚苯乙烯的96孔酶標(biāo)板的微孔中加入50u1包被液，用保鮮膜封好，在4'C冰箱中放置過夜(>16h)。次日，用350ja1150mM的PBST緩沖液(137mMNaCl,2mMKH2P04，10mMNa2HP04，加入0.05%的Tween-20調(diào)節(jié)至pH7.4)浸泡式洗板，3rainx3次。2.封閉每孔加入300Ml的2%BSA(Sigma-Aldrich公司，Cat-No.A7906),室溫封閉4h。用350y1PBST緩沖液浸泡式洗板，1minx3次。3.抗原孵育在每個反應(yīng)孔中加入50y1的HCC患者血清，37。C孵育1.5h，同時，用洗滌緩沖液替代抗原作為陰性對照，設(shè)立4個陰性對照孔。每個樣品設(shè)置2個平行孔。孵育結(jié)束后，棄去抗原，用350jalPBST緩沖液浸泡式洗板，3minx3次。4.檢測抗原反應(yīng)在每個反應(yīng)孔中加入50m1用pbst緩沖液稀釋的0.4jug/ml的小鼠抗人TGM2抗體(Labvision公司，Cat.No.MS-224-P)作為檢測抗體，室溫孵育lh。而后棄去，用350m1PBST緩沖液浸泡式洗板，3minx3次。5.二抗孵育在每個反應(yīng)孔中加入50ja1用PBST緩沖液1:5000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠lgG(JacksonImmunoReasearch公司，Cat.No.115—005-003)，室溫孵育1h。而后棄去，用350ulPBST緩沖液浸泡式洗板，3rainx3次。6.TMB(3，3，，5，5，-四甲基聯(lián)苯胺)底物顯色稱取10mgTMB(Sig歸-Aldrich公司，Cat.No.15053)溶于5ml無水乙醇中,配置成TMB貯存液。而后取0.5mlTMB貯存液加入10ml磷酸檸檬酸底物緩沖液(51.4mMNa2HP04,24.3mM檸檬酸,pH5.O)中,并加入3210.75%的仏02混勻，配置成TMB顯色溶液。在每個反應(yīng)孔中加入100ia1TMB顯色溶液，輕輕混勻，室溫孵育20min。7.終止待顏色滿意并穩(wěn)定以后，每孔加入100jnl2MH2S0r溶液終止反應(yīng)，并輕輕混勻。8.OD值的測定立即將酶標(biāo)板置于Model680酶標(biāo)儀(Bio-rad乂^司)中，OD450/57Q雙波長讀數(shù)。9.結(jié)果的判讀首先確定4個陰性對照孔的讀數(shù)，取平均值作為12本底讀數(shù)。對于每一例血清樣品，先計(jì)算2個平行孔的孔間變異(孔間變異=兩孔OD值之差/兩孔OD值的平均值)，對于那些孔間變異值小于15%的樣品，取2次重復(fù)的平均值作為該樣品的OD值；否則，舍棄該例樣品。而后，利用OD值相對定量的表示健康對照和HCC患者之間血清TGM2濃度差異。注上述實(shí)驗(yàn)方法所用材料，除特殊注明以外，均為國產(chǎn)分析純試劑。利用上述方法，申請人對年齡、性別相匹配的31例健康成人(平均年齡55歲，最大年齡68歲，最小年齡36歲)和87例HCC患者(平均年齡53歲，最大年齡74歲，最小年齡15歲)的血清TGM2濃度進(jìn)行了測定。由于申請人建立的這一系統(tǒng)比較穩(wěn)定，絕大部分病例結(jié)果均有效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，健康成人血清TGM2的濃度中位值為0.0523,檢測區(qū)間為0~0.1073。而HCC患者的血清TGM2濃度中位值是0.0863，檢測區(qū)間為0~2.0080。經(jīng)過Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)，兩者差異具有顯著性(p=0.0011)。同時，健康對照中的血清TGM2濃度與其年齡、性別之間沒有明顯的相關(guān)性(p-0.4590，p=0.4287)。而且，在HCC患者中，TGM2血清水平與組織學(xué)分級相關(guān)，低分化患者(中位值為0.2665)的血清濃度明顯高于高分化患者(中位值為0.0618)(p-0.0334)。肺瘤大小介于3cm到5cm之間的腫瘤患者(中位值為0.1687)，血清TGM2水平明顯高于小肝癌患者(中位值為0.0685)(p-0.0220)。但是，AFP陽性和陰性的HCC患者，血清TGM2表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異(p-0.8782)。TGM2在健康對照和HCC患者血清中的濃度分布圖見圖3。上述結(jié)果表明，申請人建立的血清TGM2ELISA檢測方法具有重復(fù)性好、靈敏度高的特點(diǎn)，將其用于118例健康成人和HCC患者的血清TGM2測定發(fā)現(xiàn)，這一指標(biāo)具有很高的檢測靈敏度，而且HCC患者血清中TGM2濃度明顯高于健康對照(就中位值之間的比較，腫瘤中上調(diào)至少L7倍)，表明它可能是一個很有潛力的血清診斷指標(biāo)。而且，其血清表達(dá)水平和腫瘤的組織學(xué)分級和腫瘤大小之間具有明顯相關(guān)性。因?yàn)?，這一指標(biāo)與血清AFP濃度之間沒有相關(guān)性，表明其除了可以單獨(dú)用于HCC檢測外，還可以與AFP聯(lián)合使用，提高診斷效力。本發(fā)明提供了一種肝癌檢測試劑盒，可以有效區(qū)分健康對照和HCC患者人群，目前已完成臨床試驗(yàn)118例。綜上所述，本發(fā)明研究了TGM2在肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)(1)TGM2在一半的AFP陰性組織中高表達(dá)，而在AFP陽性組織中幾乎全部表達(dá)下調(diào)；(2)TGM2具有多種異構(gòu)體形式，這一現(xiàn)象目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。發(fā)現(xiàn)AFP陰性的腫瘤組織中，存在較多的異構(gòu)體形式TGM2,而在AFP陽性病例中，這些異構(gòu)體主要位于癌旁正常組織中，這一特性與血清AFP水平存在明顯相關(guān)性；(3)發(fā)現(xiàn)TGM2在肝癌組織中的表達(dá)特性與血清AFP水平之間存在明顯的負(fù)相關(guān)性，即血清AFP水平越低，肝細(xì)胞肝癌病例中，腫瘤組織TGM2高表達(dá)的趨勢越明顯；(4)特異性下調(diào)AFP的表達(dá)后，TGM2的表達(dá)水平呈現(xiàn)增加趨勢，表明AFP可能是TGM2的負(fù)性調(diào)控因子。(5)血清ELISA結(jié)果表明，TGM2在肺瘤患者血清中明顯升高，表明TGM2可能成為一種新的潛在的血清標(biāo)志物。結(jié)合TGM2已知的功能，認(rèn)為它在肝損傷過程中發(fā)揮保護(hù)性作用，尤其在AFP表達(dá)陰性的肝細(xì)胞肝癌癌變過程中發(fā)揮重要作用。更為重要的是，不同AFP表達(dá)狀態(tài)的肝細(xì)胞肝癌中，TGM2的表達(dá)特性，提示其可能發(fā)展成為一個有潛力的肝癌細(xì)胞的標(biāo)志物。根據(jù)文獻(xiàn)檢索，目前國內(nèi)外尚無相同的工作的報(bào)道。參考文獻(xiàn)1.ParkinDM，BrayF，F(xiàn)erlayJ，PisaniP，全球癌癥統(tǒng)計(jì)，2002(Globalcancerstatistics,2002).CA:臨床醫(yī)生腫瘤雜志(CA.CancerJ.Clin)，2005;55(2):74-108。2.FaraziPA，DePinhoRA,肝細(xì)胞肝癌致病因素從基因到環(huán)境(Hepatocellularcarcinomapathogenesis:fromgenestoenvironment).自然綜述癌癥(NatRevCancer)，2006，6(9):674-687。3.HeJ，GuDF，WuXG，ReynoldsK，DuanXF，YaoCH，Wang幾，ChenCS，ChenJ，WildmanRP，KlagMJ，WheltonPK，中國男性和女性的主要死因分析(MajorCausesofDeathamongMenandWomeninChina).新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(NEnglJMed)，2005;353:1124-34。4.BergstrandCG，CzarB，從人類胎兒血清中新發(fā)現(xiàn)的一種蛋白片段(Demonstrationofanewproteinfractioninserumfromthehumanfetus).臨床和實(shí)驗(yàn)觀察的斯堪的納維亞雜志(Scand.J.Clin.Lab.Invest.),1956;8:174-179。5.AbelevGI，PerovaS，KhramkovaNI，PostnikovaZA，IrlinI,由移植鼠肝細(xì)胞瘤產(chǎn)生的胚源性alpha球蛋白(Productionofembryonalalpha-globulinbytransplantablemousehepatomas).移植公報(bào)(Transplant.Bull),1963;1:74-180。6.TatarinovIuS,人類血清中當(dāng)前已知的胚胎特異性抗原成分(Currentdataonembryo—specificantigeniccomponentsinthehumanbloodserum).Voprosymeditsinskokhimii雜志(Vopr.Med.Khim.)，1964;10:584-589。7.AbelevGI，AssecritovaIV，KraevskyNA，PerovaSD，PerevodchikovaNI，癌癥病人中的胚源性血清alpha球蛋白診斷價(jià)值。(Embryonalserumalpha-globulinincancerpatients:diagnosticvalue).國際癌癥雜志(Int.J.Cancer)，1967;2:551-558。8.MizejewskiGJ,正常和疾病狀態(tài)下懷孕和嬰幼兒期的血清alpha甲月臺蛋白7JC平(Levelsofalpha—fetoproteinduringpregnancyandearlyinfancyinnormalanddiseasestates)，婦產(chǎn)科外科手術(shù)雜志(ObstetGynecolSurv)，2003;58(12):804-826。9.FujiyamaS，TanakaM，MaedaS,AshiharaH，HirataR，TomitaK，肝細(xì)胞肝癌的早期診斷和隨訪標(biāo)志物以及患者管理(Tumormarkersinearlydiagnosis,follow—upandmanagementofpatientswithhepatocellularcarcinoma).腫瘤學(xué)(Oncology)，2002;62Suppl1:57-63。10.DeMasiS，TostiME，MeleA，肝細(xì)胞肝癌的篩查(Screeningforhepatocellularcarcinoma).消化道和肝疾病雜志(Dig.LiverDis)，2005;37(4):260-268。11.SpangenbergHC，Thi購R，BlumHE,肝細(xì)胞肝癌的血清學(xué)標(biāo)志物(Serummarkersofhepatocellularcarcinoma).肝疾病研討(Semin.LiverDis)，2006;26(4):385-390。12.MarreroJA，肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma).胃腸病學(xué)當(dāng)前觀點(diǎn)(Curr.Opin.Gastroenterol)，2003;19(3):243-249。13.ZemskovEA，JaniakA，HangJ，WaghrayA，BelkinAM,組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用中的作用(Theroleoftissuetransglutaminaseincell-matrixinteractions).生命科學(xué)前沿(Front.Biosci.)，2006;11:1057-1076。14.FesusL，PiacentiniM，組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2:—種迷樣的多功負(fù)巨酵(Transglutaminase2:anenigmaticenzymewithdiversefunctions).生物化學(xué)科學(xué)趨勢(TrendsBiochem.Sci.),2002;27(10):534-539。15.MangalaLS，MehtaK，腫瘤生物學(xué)研究中的組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酵2(Tissuetransglutaminase(TG2)incancerbiology).實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤研究進(jìn)展(Prog.Exp.TumorRes.)，2005;38:125-138。16.FesusL，SzondyZ，平衡細(xì)胞死亡和生存的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2(Transglutaminase2inthebalanceofcelldeathandsurvival).FEBS通訊(FEBSLett.)，2005;579(15):3297-3302。17.FacchianoF，F(xiàn)acchianoA，F(xiàn)acchianoAM,轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2及其底物在人類疾病中的作用(Theroleoftransglutaminase-2anditssubstratesinhumandiseases).生物科學(xué)前沿(Front.Biosci.)，2006;11:1758-1773。18.RodolfoC，MormoneE，MatarreseP，CiccosantiF，F(xiàn)arraceMG，GarofanoE，PireddaL，F(xiàn)imiaGM，MalorniW，PiacentiniM，組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2是一種多功能的僅有BH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(TissuetransglutaminaseisamultifunctionalBH3-onlyprotein).生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，2004;279(52):54783-54792。19.Her,JF，MangalaLS,MehtaK，組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2在耐藥乳腺癌細(xì)胞MCF-7中表達(dá)增加的意義(Implicationsofincreasedtissuetransglutaminase(TG2)expressionindrug-resistantbreastcancer(MCF-7)cells).癌基因(Oncogene)，2006;25(21):3049-3058。20.FokJY，EkmekciogluS，MehtaK，惡性黑色素瘤中組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2表達(dá)的意義(Implicationsoftissuetransglutaminaseexpressioninmalignantmelanoma).腫瘤分子治療(MolCancerTher.)，2006;5(6):1493-1503。21.Ve簡A，WangH，ManavathiB，F(xiàn)okJY，MannAP，KumarR，MehtaK,組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在胰腺導(dǎo)管腺癌中表達(dá)增加及其在耐藥和轉(zhuǎn)移中的意義(Increasedexpressionoftissuetransglutaminaseinpancreaticductaladenocarcinomaanditsimplicationsindrugresistanceandmetastasis).腫瘤研究(CancerRes.)，2006;66(21):10525-10533。1722.FokJY，MehtaK，組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶誘導(dǎo)凋亡誘發(fā)因子表達(dá)并導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞凋亡(Tissuetransglutaminaseinducesthereleaseofapoptosisinducingfactorandresultsinapoptoticdeathofpancreaticcancercells),凋亡雜志(Apoptosis),2007;12(8):1455-1463。23.XuL，BegumS，HearnJD，HynesR0，GPR56,—個非典型的G-蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2(TG2)并抑制黑色素瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移(GPR56,anatypicalGprotein-coupledreceptor,bindstissuetransglutaminase,TG2，andinhibitsmelanomatumorgrowthandmetastasis).美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，2006;103(24):9023-9028。24.MangalaLS,ArunB，SahinAA，MehtaK，組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶"i秀發(fā)的細(xì)胞外基質(zhì)改變抑制腫瘤^f曼襲(Tissuetransglutaminase—inducedalterationsinextracellularmatrixinhibittumorinvasion).分子腫瘤(MolCancer)，2005;4:33。25.MirzaA，LiuSL，F(xiàn)rizellE，ZhuJ，MaddukuriS，MartinezJ，DaviesP，SchwartingR，NortonP，ZernMA，組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶被NF-kappaB調(diào)節(jié)，及其在肝損傷和肝纖維化中的作用(Arolefortissuetransglutaminaseinhepaticinjuryandfibrogenesis，anditsregulationbyNF—kappaB).美國生理學(xué)雜志(Am.J.Physiol.)，1997;272(2Pt1):G281-288。26.GrenardP，Bresson-陽niS，ElAlaouiS,ChevallierM，VuittonDA，Ricard-BlumS,轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶中介的交聯(lián)反應(yīng)參與人肝纖維化過程中的細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定過程(Transglutaminase-mediatedcross-linkingisinvolvedinthestabilizationofextracellularmatrixinhumanliverfibrosis).肝臟病學(xué)雜志(J,Hepatol.)，2001;35(3):367-375。27.PiacentiniM，F(xiàn)arraceMG，HassanC，SerafiniB，AutuoriF,組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在肝纖維化過程中由凋亡細(xì)胞釋放入細(xì)胞外基質(zhì)('Tissue'transglutaminasereleasefromapoptoticcellsintoextracellularmatrixduringhumanliverfibrogenesis)，病理學(xué)雜志(J.Pathol.)，1999;189(1):92-98。28.NardacciR，LoIacono0，CiccosantiF，F(xiàn)alascaL，AddessoM，AmendolaA，AntonucciG，CraxiA，F(xiàn)imiaGM，IadevaiaV，MelinoG，RucoL，TocciG，IppolitoG，PiacentiniM，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2在肝損傷過程中發(fā)揮保護(hù)作用(TransglutaminasetypeIIplaysaprotectiveroleinhepaticinjury).美國病理學(xué)雜志(Am.J.Pathol.)，2003;162(4):1293-1303。29.SarangZ，MolnarP,NemethT，GombaS，KardonT，MelinoG，CotecchiaS，F(xiàn)esusL，SzondyZ，組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2(TG2)具有G蛋白活性，在小鼠中拮抗Fas-中介的肝細(xì)胞死亡(Tissuetransglutaminase(TG2)actingasGproteinprotectshepatocytesagainstFas-mediatedcelldeathinmice)肝臟病學(xué)(Hepatology)，2005;42(3):578-587。30.PengSY，ChenWJ，LaiPL,JengYM,SheuJC，HsuHC，肝細(xì)胞肝癌中高水平的甲胎蛋白與臨床分期、早期復(fù)發(fā)和不良預(yù)后相關(guān)肝炎病毒感染、年齡、p53和beta-catenin突變的意義(Highalpha-fetoproteinlevelcorrelateswithhighstage,earlyrecurrenceandpoorprognosisofhepatocellularcarcinoma:significanceofhepatitisvirusinfection,age,p53andbeta-cateninmutations)國際癌癥雜志(Int.J.Cancer.),2004;112(1):44-50。權(quán)利要求1.檢測待測生物樣品中的TGM2水平，進(jìn)而獲得作為中間結(jié)果的信息的方法，所述方法包括步驟1)測定待檢生物樣品中的TGM2水平；2)比較待檢生物樣品中的TGM2水平和標(biāo)準(zhǔn)生物樣品的TGM2水平；3)獲得作為中間結(jié)果的信息；4)根據(jù)比較結(jié)果確定待檢生物樣品是否有可能是HCC樣品。2.權(quán)利要求l的方法，進(jìn)一步包括與AFP聯(lián)合檢測。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中步驟l)的生物樣品是已經(jīng)脫離人體或者動物體的組織、體液或者排泄物。4.權(quán)利要求1或者2的方法，其中步驟l)的生物樣品是組織和血清。5.權(quán)利要求1或2的方法，其中步驟1)的測定是用Western印記、免疫組織化學(xué)或ELISA法。6.權(quán)利要求1的方法，其中步驟1)的測定是對TGM2水平與血清AFP水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系的測定。7.使用TGM2檢測AFP陰性的HCC的方法，所述方法包括步驟1)測定待檢生物樣品中的TGM2水平；2)比較待檢生物樣品中的TGM2水平和正常生物樣品對照的TGM2水平；3)根據(jù)比較結(jié)果確定待檢生物樣品是否是HCC樣品。8.權(quán)利要求6的方法，其中步驟l)的生物樣品是組織。9.權(quán)利要求6的方法，其中步驟1)的測定是Western印記或者免疫組織化學(xué)或ELISA法。10.TGM2作為HCC的標(biāo)志物的用途。11.權(quán)利要求10的用途，其中TGM2與AFP聯(lián)合應(yīng)用。12.用于檢測TGM2的AFP陰性的HCC檢測試劑盒。13.權(quán)利要求12的AFP陰性的HCC檢測試劑盒用途，其中包括作為標(biāo)準(zhǔn)的TGM2、抗TGM2抗體。14.用于聯(lián)合檢測TGMZ和AFP的HCC檢測試劑盒，其中包括作為標(biāo)準(zhǔn)的TGM2、抗TGM2抗體；作為標(biāo)準(zhǔn)的AFP、抗AFP抗體。全文摘要本發(fā)明涉及使用TGM2的檢測方法、檢測試劑盒及其應(yīng)用，具體而言，涉及含有單獨(dú)使用新的標(biāo)志物TGM2檢測HCC或者與AFP聯(lián)用檢測HCC的方法、檢測試劑盒及其應(yīng)用。文檔編號G01N33/574GK101629958SQ20081013259公開日2010年1月20日申請日期2008年7月17日優(yōu)先權(quán)日2008年7月17日發(fā)明者喬媛媛,芳劉,周蘭萍,孫玉琳,張達(dá)矜,佳曲,蔡建強(qiáng),楊許,趙曉航申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所;中國人民解放軍海軍總醫(yī)院