專利名稱：：巴戟天中藥材或其提取物中巴戟天寡糖的含量測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了一種巴戟天寡糖的檢測方法，其為一種含有多個寡糖成分的寡糖混合物的含量測定方法，尤其是指在巴戟天中藥材(包括中藥飲片)或巴戟天中藥材的提取物中的巴戟天寡糖的高效液相含量測定方法。
背景技術(shù)：
：在制藥領(lǐng)域，對于某種成分的含量測定，采用高效液相的色譜分析是很常規(guī)的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員常常設(shè)定某一成分為對照品，在標的物中參照該對照品進行某成分的分析測定，對于含有多種中藥有效成分且需要同時對該多種中藥成分進行定性和定量測定的時候，往往根據(jù)該多種成分找出其一一對應(yīng)的多種對照品，再依次進行測定，這種對統(tǒng)一標的物進行逐一測定的缺點是不可避免的，操作繁瑣、耗時費力、效率低下，同一化學部位中各成分相對含量標準各自獨立、互不相關(guān)，如此難免會造成一定程度的偏差，無法更有效、精確地控制質(zhì)量。對含巴戟天寡糖的巴戟天藥材或飲片或其制成的巴戟天中藥材的提取物而言，其有效成分為寡糖類物質(zhì)，該寡糖物質(zhì)是3—9糖的混合物，若采用化學顯色反應(yīng)，顯示與其它糖類(單糖、雙糖、多糖)相同的反應(yīng)特征，因此，數(shù)據(jù)證明對于檢測巴戟天寡糖，選擇HPLC的色譜鑒別更具有專屬性，而且為了測定的結(jié)果更加科學和嚴謹，需要研發(fā)出一種能在測定該化學部位總量的同時還能鑒別出其中各個成分、并給出各個成分相對含量、盡量減少對照品的種類、操作簡單的高效液相含量測定方法。
發(fā)明內(nèi)容目前在含有巴戟天寡糖的巴戟天藥材(包括飲片)或以巴戟天藥材制成的提取物中，其質(zhì)量監(jiān)控方面沒有規(guī)范成熟的含測方法，本發(fā)明的目的是提供一種巴戟天寡糖的含量測定方法，使用該方法以及該方法中的技術(shù)指標，可以很好的監(jiān)控含有巴戟天寡糖的巴戟天藥材或其制成的提取物的質(zhì)量，使中藥質(zhì)量穩(wěn)定可控，保障療效，能更好地服務(wù)社會。本發(fā)明的目的是開發(fā)一種含有巴戟天寡糖成分的巴戟天藥材(包括飲片)或其制成的提取物的質(zhì)量控制方法，該方法簡便、高效，適合科研、市場銷售、市場監(jiān)督、臨床應(yīng)用和工業(yè)化生產(chǎn)中質(zhì)量檢測的需要。本發(fā)明提供了一種巴戟天寡糖的含量測定方法，該巴戟天寡糖至少含有菊淀粉型寡糖5聚體，并且存在于巴戟天中藥材(包括飲片)或其提取物中，該含量測定方法包括(1)釆用高效液相色譜法進行測定；色譜條件是以含有乙腈的水溶液為流動相，采用示差檢測器或蒸發(fā)光散射檢測器檢測；(2)對照品溶液的制備稱取菊淀粉型寡糖5聚體作為對照品，加水或步驟(1)中所述的流動相制成對照品溶液；(3)供試品溶液的制備取巴戟天寡糖樣品，加水或步驟(1)中的流動相溶解，取上清液，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；所述的巴戟天寡糖樣品由以下方法制得，取巴戟天藥材(或飲片)，用水提取出浸出物，該浸出物為巴戟天中藥材的提取物，該浸出物上活性碳柱層析，先用水洗脫至還原糖檢出(硫酸-苯酚法)呈陰性，再用20-50°/。乙醇洗脫，收集乙醇洗脫部分，經(jīng)濃縮干燥得到巴戟天寡糖樣品；(4)測定分別吸取對照品溶液與供試品溶液，注入液相色譜儀，測定；(5)計算，按供試品圖譜中各個色譜峰與菊淀粉型寡糖5聚體對照品相對保留時間，鑒定總寡糖中各個寡糖的存在；按外標法以峰面積計算該巴戟天寡糖中所含有的菊淀粉型寡糖n聚體的含量，n為39的任一或其混合，進而確定該巴戟天寡糖中各菊淀粉型寡糖n聚體的相對含量比例，再將菊淀粉型寡糖n聚體的含量進行加和，即得所述的巴戟天總寡糖的含量。上述所采用的巴戟天中藥材既包括不經(jīng)任何加工的中藥材原料，也包括經(jīng)過加工的飲片，以及還包括經(jīng)過本領(lǐng)域公知的炮制工藝得到的巴戟天飲片。上述巴戟天寡糖為具有抗抑郁作用的活性成分，包括菊淀粉型寡糖3糖9糖，即，本發(fā)明所述的巴戟天寡糖是至少含有菊淀粉型寡糖5聚體(5糖)的寡糖，或同時含有菊淀粉型寡糖5聚體(5糖)以及菊淀粉型寡糖3聚體(3糖)、菊淀粉型寡糖4聚體(4糖)、菊淀粉型寡糖6聚體(6糖)、菊淀粉型寡糖7聚體(7糖)、菊淀粉型寡糖8聚體(8糖)和菊淀粉型寡糖9聚體(9糖)任意或其組合的混合物。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，上述方法中步驟(1)中色譜柱優(yōu)選采用氨基柱(氨基色譜柱)或C18反相柱;例如InertsilNH2柱(5pm，4.6x250mm)，采用的檢測器為示差檢測器或蒸發(fā)光散射檢測器，所述的流動相一般選擇含有40-80%(體積)的乙腈的水溶液；優(yōu)選為體積比3:11:l的乙腈與水的混合溶液。上述的巴戟天寡糖在含有菊淀粉型寡糖5聚體(5糖)的同時，優(yōu)選還含有菊淀粉型寡糖34、69聚體中任一寡糖或其混合物。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的巴戟天寡糖是含有菊淀粉型寡糖5聚體(5糖)、菊淀粉型寡糖3聚體(3糖)、菊淀粉型寡糖4聚體(4糖)、菊淀粉型寡糖6聚體(6糖)、菊淀粉型寡糖7聚體(7糖)、菊淀粉型寡糖8聚體(8糖)和菊淀粉型寡糖9聚體(9糖)的混合物。一般而言，可以將菊淀粉型寡糖n聚體簡稱為n糖，n為39，例如，菊淀粉型寡糖5聚體即為5糖，菊淀粉型寡糖9聚體即為9糖。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，為了改善色譜圖的拖尾現(xiàn)象，使得到的色譜圖的峰型完整美觀，本發(fā)明所述的含量測定方法中采用的含有乙腈的水溶液的流動相優(yōu)選還含有三乙胺，所述的三乙胺在該流動相中所占的體積一般不超過0.5%;—般可為0.01%-0.5o/o。本發(fā)明的供試品溶液的制備中所述的濾過的步驟優(yōu)選采用的是微孔濾膜，該微孔濾膜的孔徑一般可以是0.3、0.45、0.5、0.75um，更優(yōu)選0.45um。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，上述含量測定方法步驟(1)所述的流動相最優(yōu)選為體積比68:32的乙腈和水的混合溶液，該混合溶液中還含有不超過該流動相體積的0.5%的三乙胺；例如，可以是體積比68:32:0.1的乙腈、水和三乙胺的混合溶液作為流動相，得到的圖譜和峰型呈現(xiàn)令人驚喜的趨于完美效果。本發(fā)明的檢測方法中，步驟(3)所采用的水浸出物上活性碳柱層析，優(yōu)選先用水洗脫，再用大約20-50%乙醇洗脫，更優(yōu)選水洗脫后，以大約30%乙醇洗脫，經(jīng)濃縮干燥得到較佳的巴戟天寡糖樣品。然后，取巴戟天寡糖樣品50-200mg，精密稱定，置10ml量瓶中，用水或步驟(1)中的流動相溶解，稀釋至刻度，優(yōu)選再經(jīng)微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即可得到供試品溶液。本發(fā)明對照品選用菊淀粉型寡糖5聚體，選擇菊淀粉型寡糖5聚體作為對照是因為巴戟天寡糖是39聚體寡糖的混合物，在研究確定的HPLC色譜條件下，5糖相對保留時間居中、色譜峰峰高或峰面積適中，以其標定其它3-4、6-9糖，各糖與5糖峰相對位置差較均勻，可減少以色譜圖峰面積或峰高積分計算相對含量和總寡糖含量時存在的系統(tǒng)偏差。同時，采用5糖能夠使得其他糖(即，3、4、6、7、8和9糖)的HPLC的峰型清晰、分離度較好、準確度高。步驟(3)的供試品溶液優(yōu)選為每50-200mg巴戟天寡糖樣品加入水或流動相10ml得到的溶液，在制備供試品溶液的過程中，溶解過程中還經(jīng)歷了超聲，溶解后用0.45um微孔濾膜濾過的過程，取續(xù)濾液即為供試品溶液；所述的供試品如為巴戟天寡糖原料藥，則直接制備供試品溶液；如為中藥材或中藥材提取物，則按下述方法處理得到供試品巴戟天寡糖對含有巴戟天寡糖的中藥材(或中藥飲片)，用水提取出浸出物，浸出物上活性碳柱層析，先用水洗脫至還原糖檢出(硫酸-苯酚法)呈陰性，再用20-50°/。乙醇洗脫，優(yōu)選30%乙醇洗脫。收集乙醇洗脫部分，經(jīng)濃縮干燥得到巴戟天寡糖樣品；對含有巴戟天寡糖的中藥提取物，則直接上活性炭柱層析，然后按上述方法處理。在本發(fā)明的另一實施例中，所述的含量測定方法包括(1)采用高效液相色譜法進行測定；色譜條件是釆用氨基柱；以乙腈水三乙胺的體積比68:32:O.l為流動相；檢測器為示差檢測器;柱溫40。C，檢測器溫度40'C;理論板數(shù)按菊淀粉型寡糖5聚體計算不低于2000;(2)對照品溶液的制備，稱取菊淀粉型寡糖5聚體作為對照品，加水制成每lml含lmg的對照品溶液；(3)供試品溶液的制備，取經(jīng)過上述采用巴戟天藥材提取得到含有巴戟天寡糖的提取物再經(jīng)由活性炭柱層析得到的巴戟天寡糖樣品50-200mg，置具塞錐形瓶中，加入水10ml，功率100W頻率40KHz下超聲10分鐘，靜置，取上清液，用0.45um微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；(4)測定，分別吸取對照品溶液與供試品溶液20ul，注入液相色譜儀，測定；(5)計算，按供試品圖譜中各個色譜峰與菊淀粉型寡糖5聚體對照品相對保留時間，鑒定總寡糖中各個寡糖的存在；按外標法以峰面積分別計算菊淀粉型寡糖39聚體的含量，進而確定總寡糖中各個寡糖的相對含量比例，再將菊淀粉型寡糖39聚體的含量進行加和，即得巴戟天總寡糖的含量。本發(fā)明在寡糖混合物中以其中的菊淀粉型寡糖5聚體這種成分作為對照品，采用高效液相色譜法，利用示差檢測器或蒸發(fā)光散射檢測器來測定寡糖含量的方法。其創(chuàng)新點在于以該菊淀粉型寡糖5聚體這種成分為基準，將該成分的保留時間定為1，其他聚合體色譜峰的保留時間相應(yīng)換算成相對保留時間，用相對保留時間鑒別5糖外的其它寡糖的存在，再按外標法以峰面積分別計算各成分以及總的寡糖的含量，即可得到較為穩(wěn)定且準確的巴戟天寡糖的含量。這樣可以以一種對照品來測定多個結(jié)構(gòu)類似的化合物的含量，提高了含量測定的精確性，簡化了操作步驟，減少了對照品數(shù)量，縮短了測定時間，重復(fù)性好，適用性高。以下述實例來說明但不限制該專利.-該液相色譜圖中供試品圖譜中5糖色譜峰的保留時間，應(yīng)與菊淀粉型寡糖5聚體對照品保留時間一致，與菊淀粉寡糖5聚體相比，還應(yīng)出現(xiàn)相對保留時間為0.50-0.70的菊淀粉型寡糖3聚體峰；0.700.90的菊淀粉型寡糖4聚體峰；1.101.40的菊淀粉型寡糖6聚體峰；1.50~1.83的菊淀粉型寡糖7聚體峰；1.832.50的菊淀粉型寡糖8聚體峰；1.853.40的菊淀粉型寡糖9聚體峰，再按外標法以峰面積分別計算各寡糖的含量。本發(fā)明的色譜條件的選擇是基于大量的實驗數(shù)據(jù)，選擇各方面指標包括峰型、分離度、峰面積、重現(xiàn)性等等，綜合評價得出的最佳的色譜柱、流動相、檢測器以及柱溫等條件。具體如下對照品菊淀粉型寡糖5聚體(5糖)的HPLC分析取含量測定項下5糖對照品供試液20u1，在本發(fā)明所述的色譜條件下進行HPLC分析，記錄色譜圖，數(shù)據(jù)相對保留時間17.502，峰面積118018，峰面積(％)100.0000。巴戟天寡糖的HPLC分析取含量測定項下巴戟天寡糖供試液20W，在上述的色譜條件下進行HPLC分析，記錄色譜圖，圖中的峰由左至右依次為17號色譜峰，經(jīng)HPLC-MS-MS等波譜學方法確定依次(由左至右)為菊淀粉型寡糖3聚體(C18H32016，簡稱3糖)、菊淀粉型寡糖4聚體(C24H42021，簡稱4糖)、菊淀粉型寡糖5聚體(C3QH52026，簡稱5糖)、菊淀粉型寡糖6聚體(C36H62031，簡稱6糖)、菊淀粉型寡糖7聚體(C42H72036，簡稱7糖)、菊淀粉型寡糖8聚體(C48H82041，簡稱8糖)和菊淀粉型寡糖9聚體(C54H92046，簡稱9糖)。其中5糖色譜峰的保留時間與對照品保留時間一致。39聚合體色譜峰的保留時間，圖譜解析如下，數(shù)據(jù)見表l。(表中Resolution:分離度，T.Plate存理論塔板數(shù)，Ret.Time:保留時間，Area:面積)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>213.25914274615.22224.4964409.893317.40516372917.45994.5544637.704422.77317466318.62584.6134873.221530.17315232316.24354.9024956.905639.83612133712.93924.8014754.490752.7059479810.10925.0425691.831色譜鑒別結(jié)果對上述結(jié)果進行統(tǒng)計分析，得到39糖各色譜峰相對保留時間的最大值、最小值及平均值，見表2。表2巴戟天寡糖各色譜峰的相對保留時間統(tǒng)計值糖名稱相對保留時間最大值最小值平均值3糖0.5770.5720.5744糖0.7600.7570.7585糖1.0001.0001.0006糖1.3161.3111.3147糖1.7551.7401.7488糖2.3302.2892.3169糖3.0983.0533.075溶劑的HPLC分析取純水溶劑，或取流動相溶液，照供試品溶液制備方法處理，分別取20u1，注入HPLC，測定，上述色譜條件下進行HPLC分析，記錄色譜圖。色譜圖與含巴戟天樣品色譜圖對照，結(jié)果顯示空白樣品色譜圖中，在與巴戟天寡糖5糖對照品色譜圖相應(yīng)的保留時間處、及與含巴戟天寡糖樣品的色譜圖中相應(yīng)各寡糖相對保留時間處，均未見色譜峰。表明不存在空白溶劑干擾。巴戟天寡糖，為菊淀粉型寡糖3聚體(C18H32016，簡稱3糖)、菊淀粉型寡糖4聚體(C24H42021，簡稱4糖)、菊淀粉型寡糖5聚體(C3QH52026，簡稱5糖)、菊淀粉型寡糖6聚體(C36H62031，簡稱6糖)、菊淀粉型寡糖7聚體(C42H72036，簡稱7糖)、菊淀粉型寡糖8聚體(C48H8204I，簡稱8糖)和菊淀粉型寡糖9聚體(C54H92046，簡稱9糖)的混合物。本發(fā)明建立了該巴戟天寡糖的HPLC含量測定方法。實驗說明如下1儀器與試劑-島津20AT高效液相色譜系統(tǒng)RID-10A示差檢測器LCsolution色譜工作站色譜柱Inertsil朋2柱(5um，4.5X250腿)試劑乙腈一色譜純(天津四友生物醫(yī)學技術(shù)開發(fā)公司)，水一高純水，其余試劑均為分析純對照品:菊淀粉型寡糖5聚體，中國藥品生物制品檢定所提供，批號200701，純度99.99%。2.方法與結(jié)果-2.l.色譜分析條件色譜柱Inertsil,2柱(5um，4.5X250mm)流動相乙腈水三乙胺(68:32:0.1)檢測器RID-IOA示差檢測器溫度柱溫40。C,檢測器溫度4(TC流速1.2mL/min;在此條件下，樣品中各組分達到基線分離。測得菊淀粉型寡糖5聚體峰理論板數(shù)不低于2000。2.2.線性關(guān)系考察精密吸取菊淀粉型寡糖5聚體對照品溶液(2.37mg/ml)5、10、15、20、25、30ul，注入液相色譜儀，照上述色譜條件測定，以峰面積積分值為縱坐標，菊淀粉型寡糖5聚體進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程y=5555523.8X-6336r二0.9999。結(jié)果表明，菊淀粉型寡糖5聚體在0.01190.0711mg范圍內(nèi)具良好的線性關(guān)系。見表3。表3線性關(guān)系的考察<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2.3精密度實驗精密吸取菊淀粉型寡糖5聚體對照品溶液(2.37mg/ml)10ul，連續(xù)進樣6次，照上述色譜條件測定，計算平均峰面積和相對標準偏差，見表4。結(jié)果表明該方法的精密度良好。表4精密度測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2.4.空白試驗取純水溶劑，或流動相溶液，照"含量測定"項下供試品處理方法處理，取20pl，在上述的色譜條件下進行HPLC分析，記錄色譜圖，結(jié)果表明無干擾。2.5.供試品溶液穩(wěn)定性考察供試品溶液(批號0762)，于制樣后0、2、4、8、10、22小時，依法測定，結(jié)果表明，供試品溶液在22小時內(nèi)基本穩(wěn)定。結(jié)果見表5。表5穩(wěn)定性試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.6.重復(fù)性試驗按正文方法，取同批(0762)樣品，平行制樣6份，測定，結(jié)果見表6，結(jié)果表明重復(fù)性較好。表6重復(fù)性試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.7.回收率試驗采用加樣回收法，精密稱取已知含量的同批(0762)(5糖含量54.1mg/g)樣品150mg，分別精密加入5糖對照品(7.716mg)，平行制樣6份，測定，按下式計算回收率，結(jié)果表明本方法具有良好的準確度，數(shù)據(jù)見表7?；厥章?%)=測出灘總量—樣品中彌的含量x酵/。V;加入5糖對照品量表7回收率試驗結(jié)果Ns樣品取樣量(g)樣品中5糖量(mg)添加5糖量(mg)測得5糖總量(mg)回收率(%)均值(%)RSD(%)10.15028.12815.876100.4220.15058.14415.80299.2430.15118.17716.001101.4040.15068.1507.71615.76598.69100.831.7250.15098.16616.142103.3860.15178.20916.068101.852.8.樣品測定結(jié)果測定3批樣品，結(jié)果見表8。表8、樣品測定結(jié)果批號5糖含量總糖含量(mg/g)(mg/g)0701-1114.0612.70701-2112.0622.50701-3112.3605.33方法耐用性研究3.1色譜柱MERKLichrosorb朋2柱(5um，4.5X250ram)流動相乙腈水三乙胺(68:32:0.1)檢測器RID-IOA示差檢測器溫度柱溫4(TC，檢測器溫度40'C流速1.2mL/min;結(jié)果見表9、10。表9、耐用性結(jié)果l批號5糖含量(mg/g)總糖含量(mg/g)0701-1111.6618.9表IO、巴戟天寡糖各色譜峰的相對保留時間糖名稱相對保留時間3糖0.68憤0.825糖1.006糖1.227糖1.508糖1.869糖2.303.2色譜柱SEPAXAmethystamino柱(5(orn,4.6x250mm)流動相乙腈水三乙胺(68:32:0.1)檢測器RID-10A示差檢測器溫度柱溫4(TC，檢測器溫度4(TC流速1.2mL/min;結(jié)果見表ll、12。表ll、耐用性結(jié)果2批號5糖含量(mg/g)總糖含量(mg/g)0701-2_^_625.1_表12、巴戟天寡糖各色譜峰的相對保留時間糖名稱相對保留時間3糖0.634糖0.795糖1.006糖1.267糖1.608糖2.049糖2.614、相對保留時間范圍的確定對多批巴戟天寡糖進行了測定，菊淀粉型寡糖39聚體的保留時間相對較為固定，菊淀粉型寡糖3~9聚體相對于5聚體的相對保留時間也較為穩(wěn)定，見表13。表13、相對保留時間范圍糖名稱相對保留時間-5%+5%3糖0.5740.550.614糖0.7580.720.805糖1.000//6糖1.3141.251.387糖1.7481.651.838糖2.3162.192.429糖3.0752.903.21經(jīng)過系統(tǒng)研究，本發(fā)明采用菊淀粉性寡糖5聚體為對照品，以3-9糖的峰面積之和計算巴戟天寡糖含量的方法是切實可行的。該方法準確、靈敏、專一、空白輔料對測定無干擾，能有效控制本品含量。本發(fā)明的質(zhì)量控制方法快速便捷，重復(fù)性良好，適合實驗室的小樣檢測以及工業(yè)化大生產(chǎn)的質(zhì)量檢測。具體實施方式以下結(jié)合實施例詳細說明本發(fā)明，但不限定本發(fā)明的實施范圍實施例一.巴戟天藥材的含量測定1儀器與試劑島津20AT高效液相色譜系統(tǒng)LCsolution色譜工作站試劑乙腈一色譜純(天津四友生物醫(yī)學技術(shù)開發(fā)公司)，水一高純水，其余試劑均為分析純對照品菊淀粉型寡糖5聚體，中國藥品生物制品檢定所提供，批號200701，純度99.99%。2.方法與結(jié)果2.l.色譜分析條件色譜柱InertsilNH2柱(5拜，4.5x250mm)流動相乙腈水三乙胺(68:32:0.1)檢測器RID-10A示差檢測器溫度柱溫40。C，檢測器溫度4(TC流速1.2mL/min;在此條件下，樣品中各組分達到基線分離。測得菊淀粉型寡糖5聚體峰理論板數(shù)不低于2000。對照品溶液的制備取菊淀粉型寡糖5聚體(5糖)對照品適量，精密稱定，加水制成每lml含lmg的溶液，即得。供試品溶液的制備取巴戟天藥材20g，照中國藥典2005年版一部附錄XA項下冷浸法，提取出浸出物，蒸干，干燥物用水溶解，使成濃度為lg/ml的溶液，上活性碳柱層析，先用水洗脫至還原糖檢出(硫酸-苯酚法)呈陰性，再用大約6倍柱體積的30%乙醇洗脫。收集30%乙醇洗脫部分，經(jīng)濃縮干燥得到巴戟天寡糖(樣品)。取樣品約150mg，精密稱定，置10ml量瓶中，用水稀釋至刻度，經(jīng)0.45pm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20^d，注入液相色譜儀，測定，按外標法以峰面積分別計算菊淀粉型寡糖3聚體(3糖)、菊淀粉型寡糖4聚體(4糖)、菊淀粉型寡糖5聚體(5糖)、菊淀粉型寡糖6聚體(6糖)、菊淀粉型寡糖7聚體(7糖)、菊淀粉型寡糖8聚體(8糖)和菊淀粉型寡糖9聚體(9糖)的含量，將39糖的含量進行加和，即得巴戟天寡糖有效成分的含量。巴戟天藥材按干燥品計算，含菊淀粉型寡糖5聚體((33。1152026)不得少于2.0%，含巴戟天寡糖(即菊淀粉型寡糖3聚體-9聚體的總量)以菊淀粉型寡糖5聚體(C30H52O26)計，不得少于10.0%。實施例二.巴戟天藥材的提取物1儀器與試劑島津20AT高效液相色譜系統(tǒng)LCsolution色譜工作站試劑乙腈—色譜純(天津四友生物醫(yī)學技術(shù)開發(fā)公司)，水一高純水，其余試劑均為分析純對照品:菊淀粉型寡糖5聚體，中國藥品生物制品檢定所提供，批號200701，純度99.99%。2.方法與結(jié)果-2.l.色譜分析條件色譜柱,2柱(5pm，4.5x250mm)流動相乙腈水三乙胺(68:32:0.1)檢測器RID-10A示差檢測器溫度柱溫4(TC,檢測器溫度4(TC流速1.2mL/min;在此條件下，樣品中各組分達到基線分離。測得菊淀粉型寡糖5聚體峰理論板數(shù)不低于2000。對照品溶液的制備取菊淀粉型寡糖5聚體(5糖)對照品適量，精密稱定，加流動相制成每lml含lmg的溶液，即得。供試品溶液的制備取巴戟天藥材提取物5g，用水溶解，使成濃度為lg/ml的溶液，上活性碳柱層析，先用水洗脫至還原糖檢出(硫酸-苯酚法)呈陰性，再用30%乙醇洗脫。收集30%乙醇洗脫部分，經(jīng)濃縮干燥得到巴戟天寡糖(樣品)。取樣品約150mg，精密稱定，置10ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，經(jīng)0.45pm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2(Hi1，注入液相色譜儀，測定，按外標法以峰面積分別計算菊淀粉型寡糖3聚體(3糖)、菊淀粉型寡糖4聚體(4糖)、菊淀粉型寡糖5聚體(5糖)、菊淀粉型寡糖6聚體(6糖)、菊淀粉型寡糖7聚體(7糖)、菊淀粉型寡糖8聚體(8糖)和菊淀粉型寡糖9聚體(9糖)的含量，將39糖的含量進行加和，即得巴戟天寡糖有效成分的含量。巴戟天藥材提取物按干燥品計算，含菊淀粉型寡糖5聚體(C3QH52026)不得少于3.0%，含巴戟天寡糖(即菊淀粉型寡糖3聚體-9聚體的總量)以菊淀粉型寡糖5聚體(C3QH52026)計，不得少于20.0%。實施例三.巴戟天藥材的含量測定1儀器與試劑島津20AT高效液相色譜系統(tǒng)LCsolution色譜工作站試劑乙腈一色譜純(天津四友生物醫(yī)學技術(shù)開發(fā)公司)，水一高純水，其余試劑均為分析純對照品:菊淀粉型寡糖5聚體，中國藥品生物制品檢定所提供，批號200701，純度99.99%。2.方法與結(jié)果2.l.色譜分析條件色譜柱NH2柱(5(om，4.5x250mm)流動相乙腈水(40:60)檢測器RID-10A示差檢測器溫度柱溫4(TC，檢測器溫度4(TC流速L0mL/min;在此條件下，樣品中各組分達到基線分離。測得菊淀粉型寡糖5聚體峰理論板數(shù)不低于2500。對照品溶液的制備取菊淀粉型寡糖5聚體(5糖)對照品適量，精密稱定，加流動相制成每lml含lmg的溶液，即得。供試品溶液的制備取巴戟天藥材20g，照中國藥典2005年版一部附錄XA項下冷浸法，提取出浸出物，蒸干，干燥物用水溶解，使成濃度為lg/ml的溶液，上活性碳柱層析，先用水洗脫至還原糖檢出(硫酸-苯酚法)呈陰性，再用大約8倍柱體積的20%乙醇洗脫。收集20%乙醇洗脫部分，經(jīng)濃縮干燥得到巴戟天寡糖(樣品)。取樣品約150mg，精密稱定，置10ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，經(jīng)0.45pm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20^d,注入液相色譜儀，測定，按外標法以峰面積分別計算菊淀粉型寡糖3聚體(3糖)、菊淀粉型寡糖4聚體(4糖)、菊淀粉型寡糖5聚體(5糖)、菊淀粉型寡糖6聚體(6糖)、菊淀粉型寡糖7聚體(7糖)、菊淀粉型寡糖8聚體(8糖)和菊淀粉型寡糖9聚體(9糖)的含量，將39糖的含量進行加和，即得巴戟天寡糖有效成分的含量。巴戟天藥材按干燥品計算，含菊淀粉型寡糖5聚體((:3()1152026)不得少于2.0%，含巴戟天寡糖(即菊淀粉型寡糖3聚體-9聚體的總量)以菊淀粉型寡糖5聚體(C30H52O26)計，不得少于10.0%。實施例四.巴戟天藥材的含量測定1儀器與試劑島津20AT高效液相色譜系統(tǒng)LCsolution色譜工作站試劑乙腈一色譜純(天津四友生物醫(yī)學技術(shù)開發(fā)公司)，水一高純水，其余試劑均為分析純對照品:菊淀粉型寡糖5聚體，中國藥品生物制品檢定所提供，批號200701，純度99.99%。2.方法與結(jié)果2.l.色譜分析條件色譜柱C18柱(5Mm，4.5x250mm)流動相乙腈水三乙胺(78:22:0.2)檢測器蒸發(fā)光散射檢測器溫度柱溫35。C，檢測器溫度35'C流速L2mL/min;在此條件下，樣品中各組分達到基線分離。測得菊淀粉型寡糖5聚體峰理論板數(shù)不低于3000。對照品溶液的制備取菊淀粉型寡糖5聚體(5糖)對照品適量，精密稱定，加水制成每lml含lmg的溶液，即得。供試品溶液的制備取巴戟天藥材20g，照中國藥典2005年版一部附錄XA項下冷浸法，提取出浸出物，蒸干，干燥物用水溶解，使成濃度為lg/ml的溶液，上活性碳柱層析，先用水洗脫至還原糖檢出(硫酸-苯酚法)呈陰性，再用大約4倍柱體積的50%乙醇洗脫。收集50%乙醇洗脫部分，經(jīng)濃縮干燥得到巴戟天寡糖(樣品)。取樣品約150mg，精密稱定，置10ml量瓶中，用水稀釋至刻度，經(jīng)0.45pm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2(V1，注入液相色譜儀，測定，按外標法以峰面積分別計算菊淀粉型寡糖3聚體(3糖)、菊淀粉型寡糖4聚體(4糖)、菊淀粉型寡糖5聚體(5糖)、菊淀粉型寡糖6聚體(6糖)、菊淀粉型寡糖7聚體(7糖)、菊淀粉型寡糖8聚體(8糖)和菊淀粉型寡糖9聚體(9糖)的含量，將39糖的含量進行加和，即得巴戟天寡糖有效成分的含量。巴戟天藥材按干燥品計算，含菊淀粉型寡糖5聚體((:3。1152026)不得少于2.0%，含巴戟天寡糖(即菊淀粉型寡糖3聚體-9聚體的總量)以菊淀粉型寡糖5聚體(C30H52O26)計，不得少于10.0%。權(quán)利要求1.一種巴戟天寡糖的含量測定方法，該巴戟天寡糖至少含有菊淀粉型寡糖5聚體，并且存在于巴戟天中藥材或其提取物中，該含量測定方法包括(1)采用高效液相色譜法進行測定，色譜條件是以含有乙腈的水溶液為流動相，采用示差檢測器或蒸發(fā)光散射檢測器檢測；(2)對照品溶液的制備，稱取菊淀粉型寡糖5聚體作為對照品，加水或步驟(1)中所述的流動相制成對照品溶液；(3)供試品溶液的制備，取巴戟天寡糖樣品，加水或步驟(1)中的流動相溶解，取上清液，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；所述的巴戟天寡糖樣品由以下方法制得，取巴戟天藥材，用水提取出浸出物，該浸出物為巴戟天中藥材的提取物，該浸出物上活性碳柱層析，先用水洗脫至還原糖檢出呈陰性，再用20-50％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫部分，經(jīng)濃縮干燥得到巴戟天寡糖樣品；(4)測定，分別吸取對照品溶液與供試品溶液，注入液相色譜儀，測定；(5)計算，按供試品圖譜中各個色譜峰與菊淀粉型寡糖5聚體對照品相對保留時間；按外標法以峰面積計算該巴戟天寡糖中所含有的菊淀粉型寡糖n聚體的含量，n為3～9的任一或其混合，進而確定該巴戟天寡糖中各菊淀粉型寡糖n聚體的相對含量比例，再將菊淀粉型寡糖n聚體的含量進行加和，即得所述的巴戟天總寡糖的含量。2.權(quán)利要求1所述的含量測定方法，該方法中步驟(1)所述的色譜條件包括采用氨基柱或C18反相柱，所述的流動相含有40-80%體積的乙腈。3.權(quán)利要求1所述的含量測定方法，該方法中步驟(1)所述的流動相為體積比3:11:l的乙腈與水的混合溶液。4.權(quán)利要求1所述的含量測定方法，其中，所述的巴戟天寡糖還含有菊淀粉型寡糖34、69聚體中任一寡糖或其混合物。5.權(quán)利要求l所述的含量測定方法，其中，所述的巴戟天寡糖為含有菊淀粉型寡糖5聚體、菊淀粉型寡糖34聚體、菊淀粉型寡糖69聚體的混合物。6.權(quán)利要求l所述的含量測定方法，其中，該方法中步驟(1)所述的流動相為體積比68:32的乙腈和水的混合溶液，該混合溶液中還含有不超過該流動相體積的0.5%的三乙胺。7.權(quán)利要求1所述的含量測定方法，其中，該方法中步驟(3)所述的水浸出物上活性碳柱層析，先用水洗脫，再用30%乙醇洗脫，經(jīng)濃縮干燥得到所述的巴戟天寡糖樣品。8.權(quán)利要求1所述的含量測定方法，該方法中步驟(3)包括取巴戟天寡糖樣品50-200mg，精密稱定，置10ml量瓶中，用水或步驟(1)中的流動相溶解，稀釋至刻度，經(jīng)微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。9.權(quán)利要求1所述的含量測定方法，其中，該方法步驟(1)中采用的檢測器為示差檢測器或蒸發(fā)光散射檢測器。全文摘要本發(fā)明提供了一種巴戟天寡糖的含量測定方法，包括采用高效液相色譜法進行測定；以含有乙腈的水溶液為流動相；按外標法以峰面積分別計算菊淀粉型寡糖3～9聚體的含量，再將菊淀粉型寡糖3～9聚體的含量進行加和，即得巴戟天寡糖的含量；本發(fā)明以單一對照品來測定以巴戟天中藥材或巴戟天提取物中巴戟天寡糖中多個結(jié)構(gòu)類似的化合物總量的同時，還對所測化學部位中各個成分及其相對含量進行測定，簡化了操作步驟，提高了含量測定的精確性，減少了對照品數(shù)量，縮短了測定時間，重復(fù)性好，適用性高。文檔編號G01N30/02GK101334390SQ20081013409公開日2008年12月31日申請日期2008年7月24日優(yōu)先權(quán)日2008年6月26日發(fā)明者劉柏剛,華勵,薇張,張學著,張紹來,張維鈞,鵬彭,銀李,李志猛,菁杜,落邱,顧海鷗申請人:北京同仁堂股份有限公司