專利名稱：一種櫛孔扇貝基因的染色體定位方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種染色體基因定位方法——高效櫛孔扇貝基因的染色體定位方法，屬于分 子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景-熒光原位雜交(FISH)技術(shù)、引物原位延伸(PRINS)技術(shù)和原位PCR技術(shù)是常用的染色 體基因定位的技術(shù)。目前，F(xiàn)ISH和PRINS技術(shù)的應(yīng)用主要限制在定位高度重復(fù)的基因。與FISH 和PRINS技術(shù)相比，原位PCR技術(shù)在定位單或低拷貝的基因方面有著明顯的優(yōu)勢(shì)。但是，該 技術(shù)在實(shí)踐應(yīng)用中并未得到推廣，主要是由于當(dāng)溫度和壓力發(fā)生變化時(shí)，很難恒定地維持染 色體所在的玻片表面的反應(yīng)條件，造成基因的定位效果不穩(wěn)定。環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP) 技術(shù)是Notomi等人(2000)發(fā)明的一項(xiàng)恒溫DNA擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)依賴于可自循環(huán)的DNA鏈 替代式合成反應(yīng)，在較短的時(shí)間內(nèi)，等溫的條件下，不到1小時(shí)就能擴(kuò)增出109靶序列拷貝， 具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速準(zhǔn)確和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。該反應(yīng)需要一種具有高的鏈替代活 性的DNA聚合酶及特殊設(shè)計(jì)的兩個(gè)內(nèi)側(cè)引物和兩個(gè)外側(cè)引物。本發(fā)明用LAMP技術(shù)替代傳統(tǒng)的 原位PCR技術(shù)中的PCR技術(shù)，與傳統(tǒng)的原位PCR技術(shù)相比，原位LAMP技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn):(i) 原位LAMP反應(yīng)過程中，低的和恒定的溫度有利于維持恒定的反應(yīng)條件和降低染色體的損傷； (ii)應(yīng)用4條引物可提高反應(yīng)的特異性；(iii) LAMP產(chǎn)物易于沉積的特性可有效避免產(chǎn)物 的漂移。應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行基因的染色體定位，重復(fù)性好，特異性高，染色體上基因的雜交信 號(hào)明顯，易于分辨，上述優(yōu)點(diǎn)使之在定位單或低拷貝的基因方面也有很好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種高效櫛孔扇貝基因的染色體定位方法， 解決當(dāng)溫度和壓力發(fā)生變化時(shí)，很難恒定地維持染色體所在的玻片表面的反應(yīng)條件，造成基 因的定位效果不穩(wěn)定的問題。本發(fā)明方法的操作步驟如下第一步，利用氣干法在載玻片上進(jìn)行櫛孔扇貝染色體制片首先將櫛孔扇貝的擔(dān)輪幼蟲經(jīng)0. 01%的秋水仙素常溫浸泡后，再用0. 075M的氯化鉀溶液 浸泡30分鐘，然后用新鮮配制的卡諾固定液(乙醇冰醋酸=3: 1)固定3次，每次15分鐘。 經(jīng)過50%的醋酸溶液浸泡后，固定的幼蟲被解離成細(xì)胞懸液，然后滴到6(TC濕熱的載玻片上， 6(TC風(fēng)干。第二步，根據(jù)待定位基因序列，進(jìn)行在線引物設(shè)計(jì)并合成引物根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)梓孔扇貝ITS2序列(AY776156)用PrimerExplorer軟件設(shè)計(jì)4 條引物 (BIP ，F(xiàn)IP ，B3 和 F3 )。
這四條引物的序歹U分另U為 5' -CCGGCGAGCGGTCTTAAA-CTGGTTTGTTTTTGGTTCGATTGGA-3' (BIP)， 5' -TTTGCCGACCCTCAGACA-CATCGATATCTTGAACGCACATTGC-3'(FIP)， 5' -GCGTCTCTTGTAATTTGTTCCGTA-3，(B3)， 5' -TGTGAATTGCAGGACACATTGA-3'(F3)。第三步，對(duì)rRNA基因進(jìn)行染色體定位先利用連接酶對(duì)載玻片上的染色體進(jìn)行連接處理，再對(duì)載玻片上的染色體進(jìn)行甲酰胺變 性處理，并用-20〔的70%, 90%和100%乙醇梯度脫水之后，風(fēng)干，預(yù)熱，然后將載玻片置于 溫度循環(huán)儀的加熱板上，加入LAMP反應(yīng)混和物，開始在載玻片上進(jìn)行原位LAMP反應(yīng)，反應(yīng) 結(jié)束后清洗載玻片，置于blocking緩沖液中孵育，再加入熒光標(biāo)記的生物素抗體孵育，使生 物素與抗體結(jié)合，最后用碘化丙錠(PI)抗衰減溶液對(duì)玻片上的染色體進(jìn)行復(fù)染，用熒光顯 微鏡對(duì)染色體進(jìn)行觀察和拍照，利用穩(wěn)定清晰的雜交信號(hào)確定目標(biāo)基因在染色體上的位置。LAMP反應(yīng)混合物總體積為20微升，由8uM的FIP和BIP， 2yM的F3和B3， 200yM的 脫氧腺苷三磷酸，脫氧胞苷三磷酸和脫氧S苷三磷酸，20uM的脫氧胸苷三磷酸，20iiM的生 物素標(biāo)記的脫氧尿苷三磷酸，1M的betaine (Sigma公司)，lXThermerPol緩沖液，8個(gè)單 位的Bst DNA聚合酶混合形成lamp反應(yīng)體系混合物。LAMP反應(yīng)程序由兩步完成65°C K 30分鐘的擴(kuò)增步驟及其后的8(TC下10分鐘的終止步驟。木發(fā)明方法充分利用LAMP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，使之與原位PCR技術(shù)相結(jié)合，用LAMP技術(shù)替代 傳統(tǒng)的原位PCR技術(shù)中的PCR技術(shù)，使櫛孔扇貝基因在恒溫條件下能快速得到大量擴(kuò)增產(chǎn)物， 雜交信號(hào)清晰穩(wěn)定，提高基因定位的準(zhǔn)確性和特異性。
具體實(shí)施例方式下面以櫛孔扇貝核糖體rRNA基因的染色體定位為例通過具體的實(shí)施例詳細(xì)敘述本發(fā)明 方法(1)利用氣干法在載玻片上進(jìn)行櫛孔扇貝染色體制片 .首先將櫛孔扇貝的擔(dān)輪幼蟲經(jīng)0. 01%的秋水仙素常溫浸泡2個(gè)小時(shí)后，再用0. 075M的氯 化鉀溶液浸泡30分鐘，然后用新鮮配制的卡諾固定液(乙醇冰醋酸體積比=3: 1)固定3 次，每次15分鐘。經(jīng)過50%的醋酸溶液浸泡后，固定的幼蟲被解離成細(xì)胞懸液，然后滴到60 'C濕熱的載玻片上，6CTC風(fēng)干。(2)根據(jù)待定位的rRNA (18S-5.8S-28S)基因序列，進(jìn)行在線引物設(shè)計(jì)并合成引物根據(jù)GenBank內(nèi)t節(jié)孔扇貝ITS2序列(AY776156 )用PrimerExplorer軟件 (http:〃primerexplorer. jp/e/)設(shè)計(jì)4條引物(BIP， FIP， B3和F3)。這四條引物的序列分別為5' -CCGGCGAGCGGTCTTAAA-CTGGTTTGTTTTTGGTTCGATTGGA-3' (B丄P) 5' -TTTGCCGACCCTCAGACA-CATCGATATCTTGAACGCACATTGC-3' (FIP) 5' -GCGTCTCTTGTAATTTGTTCCGTA-3' (B3) 5' -TGTGAATTGCAGGACACATTGA-3' (F3) (3)對(duì)rRNA基因進(jìn)行染色體定位在進(jìn)行LAMP反應(yīng)前，玻片先用5個(gè)單位的T4連接酶(MBI公司)在50微升的緩沖液內(nèi) 常溫處理1. 5個(gè)小時(shí)。然后，玻片上的染色體用70%的甲酰胺和2X標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽溶液的混合 液70度變性2分鐘，接著用冷的(-20'C)乙醇梯度(70%， 90%和100%)脫水，每次5分鐘。 在風(fēng)干后，玻片被置于65度預(yù)熱2分鐘，然后加入LAMP反應(yīng)混和物。LAMP反應(yīng)體系混合物 總體積為20微升，包括8uM的FIP和BIP， 2uM的F3禾口B3， 200u M的脫氧腺苷三磷酸， 脫氧胞苷三磷酸和脫氧鳥苷三磷酸，20nM的脫氧胸苷三磷酸，20nM的生物素標(biāo)記的脫氧尿 苷三磷酸，1M的betaine (Sigma公司)，lXTherraerPol緩沖液，8個(gè)單位的Bst DNA聚合 酶，形成LAMP反應(yīng)體系混合物。每張載玻片被置丁溫度循環(huán)儀(Biotnetra公司)的加熱板上，然后將上述LAMP反應(yīng)體 系混合物添加到載玻片上面。再在載玻片上覆以蓋玻片，周邊用指甲油進(jìn)行密封，以防蒸發(fā)。 LAMP反應(yīng)程序由兩步完成65。C下30分鐘的擴(kuò)增步驟及其后的80。C下10分鐘的終止步驟。 反應(yīng)終止后，玻片用wash緩沖液(4X標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽溶液，0. 1%吐溫20， pH7. 0)常溫沖洗5 分鐘。然后玻片置于blocking緩沖液(3%牛血清白蛋白，4X標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽溶液，0. 1%吐溫 20， p117.0)中37。C孵育20分鐘，接著加入生物素抗體孵育1個(gè)小時(shí)，使生物素和抗體充分 結(jié)合。玻片上的染色體用含1.5ug/mL的碘化丙錠(PI)抗衰減溶液對(duì)細(xì)胞核和染色體進(jìn)行 染色。玻片用配有CCD相機(jī)的尼康Eclipse-6000型熒光顯微鏡觀察基因在染色體上的位置。信 號(hào)用合適的濾光片和LUCIA軟件進(jìn)行收集。穩(wěn)定清晰的雜交信號(hào)可用于確定目標(biāo)基因在染色 體上的位置。根據(jù)王永平和郭希明(2004)的報(bào)道，櫛孔扇貝核糖體rRNA基因位于5號(hào)染色體短臂的 端部區(qū)域。本發(fā)明方法應(yīng)用原位LAMP技術(shù)對(duì)櫛孔扇貝核糖體rRNA基閑的染色體定位，陽(yáng)性 信號(hào)用箭頭標(biāo)示，標(biāo)尺示5微米，得到的這一結(jié)果與王永平和郭希明(2004)報(bào)道的結(jié)果完 全一致。該結(jié)果驗(yàn)證了應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行基因的染色體定位結(jié)果的可行性和可靠性。權(quán)利要求
1、一種櫛孔扇貝基因的染色體定位方法，其特征在于按照如下步驟操作第一步，首先將櫛孔扇貝的擔(dān)輪幼蟲經(jīng)0.01％的秋水仙素常溫浸泡后，再用0.075M的氯化鉀溶液浸泡30分鐘，用新鮮配制的卡諾固定液固定3次，經(jīng)過50％的醋酸溶液浸泡后，固定的幼蟲被解離成細(xì)胞懸液，然后滴到60℃濕熱的載玻片上，60℃風(fēng)干；第二步，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)櫛孔扇貝ITS2序列設(shè)計(jì)4條引物BIP，F(xiàn)IP，B3和F3；第三步，利用連接酶對(duì)載玻片上的染色體進(jìn)行連接處理，再對(duì)載玻片上的染色體進(jìn)行甲酰胺變性處理，并用-20℃的70％，90％和100％乙醇梯度脫水之后，風(fēng)干，預(yù)熱，然后將載玻片置于溫度循環(huán)儀的加熱板上，加入LAMP反應(yīng)混和物，開始在載玻片上進(jìn)行原位LAMP反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后清洗載玻片，置于blocking緩沖液中孵育，再加入熒光標(biāo)記的生物素抗體孵育，使生物素與抗體結(jié)合，最后用碘化丙錠抗衰減溶液對(duì)玻片上的染色體進(jìn)行復(fù)染，用熒光顯微鏡對(duì)染色體進(jìn)行觀察和拍照，利用穩(wěn)定清晰的雜交信號(hào)確定目標(biāo)基因在染色體上的位置。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種櫛孔扇貝基因的染色體定位方法，其特征在于第一步中使 用的卡諾固定液按照乙醇冰醋酸體積比=3: l配制，每次固定時(shí)間為15分鐘。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種櫛孔扇貝基因的染色體定位方法，其特征在于LAV1P反應(yīng) 體系混合物總體積為20微升，由8uM的FIP和BIP， 2uM的F3和B3， 200uM的脫氧腺苷 三磷酸，脫氧胞苷三磷酸和脫氧鳥苷三磷酸，20uM的脫氧胸苷三磷酸，20uM的生物素標(biāo)記 的脫氧尿苷三磷酸，1M的betaine， 1 XThermerPol緩沖液，8個(gè)單位的Bst DNA聚合酶混合 形成LAMP反應(yīng)體系混合物。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種櫛孔扇貝基因的染色體定位方法，其特征在于LAMP反應(yīng) 由兩步完成65'C下30分鐘的擴(kuò)增步驟及其后的8(TC下10分鐘的終止步驟。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種櫛孔扇貝基因的染色體定位方法，其特征在于LAMP反應(yīng) 終止后，玻片用4X標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽溶液，0. 1%吐溫20, pH7. 0的wash緩沖液常溫沖洗5分鐘， 然后玻片置于3%牛血清白蛋白，4X標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽溶液，0. 1°/。吐溫20， pH7. 0的blocking緩 沖液中37t:孵育20分鐘，接著加入生物素抗體孵育1個(gè)小時(shí)；玻片上的染色體用含1. 5u g/mL 的碘化丙錠抗衰減溶液復(fù)染。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高效櫛孔扇貝基因的染色體定位方法。首先利用氣干法在載玻片上進(jìn)行櫛孔扇貝染色體制片；然后根據(jù)待定位基因序列，進(jìn)行在線引物設(shè)計(jì)并合成引物；再對(duì)rRNA基因進(jìn)行染色體定位先利用連接酶處理載有染色體的載玻片，再對(duì)染色體進(jìn)行甲酰胺變性處理，加入LAMP反應(yīng)混合物，進(jìn)行原位LAMP反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后清洗載玻片，加入熒光標(biāo)記的生物素抗體孵育，最后用碘化丙錠抗衰減溶液對(duì)染色體進(jìn)行復(fù)染，利用穩(wěn)定清晰的雜交信號(hào)確定目標(biāo)基因在染色體上的位置。本發(fā)明方法使櫛孔扇貝基因在恒溫條件下能快速得到大量擴(kuò)增產(chǎn)物，雜交信號(hào)清晰穩(wěn)定，提高基因定位的準(zhǔn)確性和特異性。對(duì)于定位單或低拷貝的基因，該方法也具有極大的應(yīng)用潛力。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101323881SQ20081013864
公開日2008年12月17日 申請(qǐng)日期2008年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月25日
發(fā)明者包振民, 孟慶磊, 張玲玲, 師 王, 珊 王, 胡曉麗, 胡景杰, 黃曉婷 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)