專利名稱：利用四唑藍(lán)法快速測定發(fā)光細(xì)菌活細(xì)菌總數(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速測定發(fā)光細(xì)菌活細(xì)菌總數(shù)的方法，特別是一種基于MTT顯色原理的活細(xì)菌計(jì)數(shù)方法。
背景技術(shù)：
據(jù)本發(fā)明人通過査閱資料、文獻(xiàn)檢索所知
目前，在微生物學(xué)、免疫學(xué)以及其他學(xué)科的實(shí)驗(yàn)中，常用一定濃度的活細(xì)菌作為實(shí)驗(yàn)材料，這就涉及 到一個活菌計(jì)數(shù)的問題。微生物學(xué)常用的幾種細(xì)菌計(jì)數(shù)方法有比濁法、平板計(jì)數(shù)法等。比濁法操作方法簡 單但只能測量細(xì)菌數(shù)量，不能判斷細(xì)菌的活性；平板計(jì)數(shù)法雖然測量的是活菌數(shù)，但方法繁瑣，重復(fù)性較
差，所需時間長，在菌落計(jì)數(shù)時容易造成誤差。
四唑藍(lán)(tetrazoliumsalt，MTT)比色法是一種于1983年首創(chuàng)用于檢測細(xì)胞生長和存活的新方法。其原 理是活細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶可將MTT(淡黃色)還原成藍(lán)紫色的formazan，而且形成的量與活細(xì)胞數(shù)量成 正比關(guān)系。此方法具有簡單、快速、靈敏、穩(wěn)定的特點(diǎn)，克服了常規(guī)方法的不足之處。近年來，在體外藥 敏試驗(yàn)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性和活性測定等方面有諸多的應(yīng)用。已成為哺乳動物細(xì)胞活性測定的基本方法， 具有快速、簡便、準(zhǔn)確、避免使用同位素等優(yōu)點(diǎn)。
目前尚未有將MTT法應(yīng)用于發(fā)光細(xì)菌活細(xì)菌總數(shù)測定的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種快速測定發(fā)光細(xì)菌活細(xì)菌總數(shù)的方法，特別是一種基于MTT顯色原理的活 細(xì)菌計(jì)數(shù)方法。
本發(fā)明采用MTT比色法測定發(fā)光細(xì)菌活菌數(shù)，通過對MTT比色法的檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化選擇。確定 最佳的測定發(fā)光細(xì)菌活細(xì)菌總數(shù)的方法。
本發(fā)明首先將MTT和活菌體內(nèi)琥珀酸脫氫酶反應(yīng)生成的產(chǎn)物formazan溶于DMSO后，在400nm — 800nm范圍內(nèi)測定光吸收值，確定檢測的最大吸收波長為500nm。通過優(yōu)化時間、溫度對吸光值的影響， 確定最佳的測定條件為反應(yīng)時間2h,反應(yīng)溫度25'C。
本發(fā)明檢測原理新穎，檢測方法簡便快速，重復(fù)性好，可適用于食品衛(wèi)生與安全、環(huán)境檢測等領(lǐng)域發(fā) 光細(xì)菌活細(xì)胞數(shù)量的定量檢測。同時可應(yīng)用于微生物學(xué)、免疫學(xué)以及其他學(xué)科的實(shí)驗(yàn)中，作為活細(xì)菌材料 活性和數(shù)量的測定。本發(fā)明還可發(fā)展成為細(xì)菌總數(shù)測定的方法，用于替代傳統(tǒng)的測定活體細(xì)胞總數(shù)的方法。


附圖1 MTT與活菌作用后生成的物質(zhì)溶于DMSO的吸收光譜。 附圖2 MTT法測定發(fā)光細(xì)菌活菌數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
0.3mL MTT溶液加到3mL經(jīng)適當(dāng)稀釋的發(fā)酵液中，混勻后25。C下放置2h，在10，000r/min下離心10min， 棄去上清液，加3mLDMSO充分溶解沉淀，用紫外可見分光光度計(jì)掃描最大吸收波長，在400nm — 800nm 范圍內(nèi)測定光吸收值。由圖1可知其最大吸收峰在500nm處。
實(shí)施例2
以DMSO為參比，無菌生理鹽水、無菌空白培養(yǎng)基、發(fā)酵上清液(10,000r/min 離心后，吸取上清液)和死菌體(沸水浴30min)作為待測樣，用MTT法測得的光吸收值見表1。由該表可知， 這些物質(zhì)對測定結(jié)果干擾很小。由此可見，MTT法是與活菌量有關(guān)，而與培養(yǎng)基中所含固型物以及代謝產(chǎn) 物的性質(zhì)無關(guān)，這在很大程度上解決了由于培養(yǎng)基含有固型物而用濁度法與菌體干重法測活菌帶來的嚴(yán)重干擾。
3表l不同物質(zhì)為空白對照時吸光值
DMSO 無菌生理無菌空白發(fā)酵上淸PBS 菌體沸水'菌體沸水
_鹽水 培養(yǎng)基_浴10min 浴30min
A500nm~~5 0.0050扁0.0190.0060.016 0,004
實(shí)施例3
0.3mL MTT溶液加到3mL經(jīng)適當(dāng)稀釋的發(fā)酵液中，混勻后25'C下分別放置2h，在10，000r/min下離 心10min，充去上清液，加3mLDMSO充分溶解沉淀后于500nm處測定吸光值。同時將離心后的菌體用生 理鹽水復(fù)溶，梯度稀釋后，涂布平板，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。
權(quán)利要求
1一種快速測定發(fā)光細(xì)菌活細(xì)菌總數(shù)的方法，其特征是(1)基于MTT顯色的原理；(2)測定波長為500nm；(3)測定溫度為25℃；(4)反應(yīng)時間為2h。
全文摘要
本發(fā)明的目的是建立一種快速測定發(fā)光細(xì)菌活細(xì)菌總數(shù)的方法，特別是一種基于MTT顯色原理的活細(xì)菌計(jì)數(shù)方法。本發(fā)明采用MTT比色法測定發(fā)光細(xì)菌活菌數(shù)，通過對MTT比色法的檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化選擇。確定最佳的測定發(fā)光細(xì)菌活細(xì)菌總數(shù)的方法。本發(fā)明首先將MTT和活菌體內(nèi)琥珀酸脫氫酶反應(yīng)生成的產(chǎn)物formazan溶于DMSO后，在400nm一800nm范圍內(nèi)測定光吸收值，確定檢測的最大吸收波長為500nm。通過優(yōu)化時間、溫度對吸光值的影響，確定最佳的測定條件為反應(yīng)時間2h，反應(yīng)溫度25℃。本發(fā)明檢測原理新穎，檢測方法簡便快速，重復(fù)性好，可適用于食品衛(wèi)生與安全、環(huán)境檢測等領(lǐng)域發(fā)光細(xì)菌活細(xì)胞數(shù)量的定量檢測。同時可應(yīng)用于微生物學(xué)、免疫學(xué)以及其他學(xué)科的實(shí)驗(yàn)中，作為活細(xì)菌材料活性和數(shù)量的測定。本發(fā)明還可發(fā)展成為細(xì)菌總數(shù)測定的方法，用于替代傳統(tǒng)的測定活體細(xì)胞總數(shù)的方法。
文檔編號G01N21/76GK101620188SQ20081014009
公開日2010年1月6日 申請日期2008年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月22日
發(fā)明者洪 林, 王亞群, 王靜雪 申請人:中國海洋大學(xué)