專利名稱：：Hplc法同時測定蒲公英制劑中綠原酸、咖啡酸含量的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及中藥質(zhì)量檢測領域，特別是一種HPLC法同時測定蒲公英制劑中綠原酸v咖啡酸含量的方法。二、
背景技術：
蒲公英為常用中藥，對其質(zhì)量控制還沒有統(tǒng)一的標準。中國藥典對蒲公英的質(zhì)量控制僅局限于咖啡酸單種成分的薄層鑒別及含量測定，仍釆用了對西藥質(zhì)量控制的模式，不能全面地反映蒲公英的內(nèi)在質(zhì)量。現(xiàn)雖有人對不同地區(qū)蒲公英中咖啡酸的含量進行測定時，采用乙腈一0.2%磷酸為流動相、常溫梯度洗脫，建立了快速、穩(wěn)定的HPLC定量分析蒲公英中咖啡酸含量的方法。但是蒲公英藥材品種比較混亂，質(zhì)量不易控制，且常以浸膏作為制劑(蒲公英片劑、浸膏統(tǒng)稱制劑，)入藥，療效好，價格便宜，而蒲公英浸膏作為蒲公英制劑的中間產(chǎn)品，是影響成品質(zhì)量的關鍵因素之一。目前對蒲公英制劑的質(zhì)量控制還沒有統(tǒng)一的標準?？Х人?、綠原酸為蒲公英中清熱解毒主要成分，因蒲公英所含成分比較復雜，難以把咖啡酸、綠原酸與其它成分很好的分離，達到液相定量測定的要求，中國藥典(2005年版)中蒲公英的含量測定項下，僅用HPLC法(高效液相色譜法)測定其中一個咖啡酸的含量。而綠原酸也為蒲公英中主要的抗菌成分，僅測出咖啡酸含量，并不能全面反映出蒲公英制劑的質(zhì)量情況，故建立一種能同時測定蒲公英制劑中綠原酸、咖啡酸含量的方法具有重要的意義。三、
發(fā)明內(nèi)容針對上述情況，為克服現(xiàn)有蒲公英制劑的質(zhì)量控制缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種HPLC法同時測定蒲公英制劑中綠原酸、咖啡酸含量的方法，可有效解決以綠原酸和咖啡酸作為指標性成分，同時進行含量測定，對蒲公英制劑的質(zhì)量標準奠定基礎解決的問題，實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術方案是分別制備供試品溶液和對照品溶液，用RP-HPLC法(反相高效液相色譜法)測定綠原酸、咖啡酸含量，其特征是對照品為綠原酸、咖啡酸；色譜條件為色譜柱為AichromBond-AQ柱(250咖X4.6mm，5ura)，流動相為甲醇一0.015%磷酸水，其中流動相A為甲醇，流動相B為體積濃度0.015%的磷酸水，采用梯度洗脫，0.01—20min時，流動相A:流動相B的體積比為20%:80%(即O.Olmin時，流動相A與流動相B的體積比為20%:80%,保持到20min)，在20—40min，流動相A:流動相B的體積比為30%:70%(即在20—40min時，流動相A與B的體積比由初始時的2096:80%逐漸改變到30%:70%)，梯度洗脫程序見表l，流速為1.Oml/min，檢測波長為323nm，柱溫30。C4(TC。柱溫最優(yōu)為35i:。表1梯度洗脫程序時間(min)甲醇(A)(%)0.015%磷酸水溶液(B)(%)0,012080202080403070在測定綠原酸、咖啡酸含量前，利用流動相先對色譜柱進行平衡，流動相A與流動相B初始體積比為309&:7(m，在0—2min，流動相A與流動相B的體積比改變?yōu)?(m:8(m，保持到22min，流速為1.Oml/min，平衡色譜柱程序見表2。表2平衡色譜柱程序時間(min)流動相A(%)流動相B(%)0307022080222080本發(fā)明測定方法中，供試品溶液和對照品溶液的制備方法為:取蒲公英浸膏粉末O.16g左右(相當于1克藥材)，加入體積濃度為5%甲酸的甲酸甲醇溶液(5%甲酸的甲酸甲醇溶液或稱為5%甲酸的甲醇溶液，是指以體積計甲酸5%、甲醇95%構(gòu)成的溶液，以下同)20ml，稱定重量，超聲提取30min，取出，放至18—25'C，加體積濃度為5%甲酸的甲酸甲醇溶液補足減失重量，過濾，取續(xù)濾液，再過濾，即得蒲公英浸膏供試品溶液；取蒲公英片劑粉末0.27g左右，加入體積濃度為5%甲酸的甲酸甲醇溶液10ml，稱定重量，超聲提取30min，取出，放至18—25。C，加體積濃度為5%甲酸的甲酸甲醇溶液補足減失重量，過濾，取續(xù)濾液，再過濾，即得蒲公英片劑供試品溶液；取咖啡酸對照品，加甲醇配成咖啡酸質(zhì)量濃度為0.066mg/ml的咖啡酸溶液，過濾，即得咖啡酸對照品溶液。取綠原酸對照品，加甲醇配成綠原酸質(zhì)量濃度為0.0784mg/ml的綠原酸溶液，過濾，即得綠原酸對照品溶液。稱取蒲公英制劑，分別加入O.0784mg/ml綠原酸對照品溶液lml，0.066mg/ml咖啡酸對照品溶液2.5ml，即加入綠原酸對照品0.0784mg，咖啡酸對照品0.165mg，得混合對照品溶液。上述制備的供試品溶液和對照品溶液用0.45um微孔濾膜過濾，進樣量為5y1，記錄時間40min。本發(fā)明中所稱的蒲公英制劑是指蒲公英浸膏和蒲公英片劑。本發(fā)明采用RP-HPLC法(反相高效液相色譜法)，梯度洗脫，測得蒲公英制劑中綠原酸、咖啡酸含量。結(jié)果咖啡酸在0.0264iig0.528ug范圍內(nèi)有良好的線性關系，平均回收率為99.09%，RSD為1.52%;綠原酸在0.03136ug0.6272ug范圍內(nèi)有良好的線性關系，平均回收率為98.52%，RSD為1.64%。本發(fā)明方法簡便、可靠、迅速，靈敏度高，重現(xiàn)性好,回收率高，以綠原酸和咖啡酸作為指標性成分，為蒲公英及其制劑質(zhì)量標準的制定奠定了基礎，提供了更科學的依據(jù)。四圖1為咖啡酸對照品色譜圖。圖2為綠原酸對照品色譜圖。圖3為蒲公英浸膏供試品色譜圖。圖4為蒲公英片劑供試品色譜圖。五具體實施方式以下結(jié)合具體情況對本發(fā)明的具體實施方式作詳細說明。實施例1:1.儀器與試藥LC-10AD(日本島津)高效液相色譜儀，紫外檢測器，HW-2000色譜工作站；METTLERAE240型十萬分之一分析天平，HANGPINGJA2003型電子天平，KQ-500DV型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；色譜甲醇(天津四友精細化學6品有限公司)，水(娃哈哈純凈水)，其它試劑均為分析純?？Х人帷⒕G原酸對照品為中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)，咖啡酸批號110885-200102，綠原酸批號110753-200413。蒲公英藥材購自鄭州市東升醫(yī)藥商店(河南產(chǎn)蒲公英)。蒲公英浸膏及蒲公英片為自制。2.方法與結(jié)果2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜條件為色譜柱為AichromBond-AQ柱(250ramX4.6mm，5wm)，流動相為甲醇一0.015%磷酸水，其中流動相A為甲醇，流動相B為體積濃度0.015%的磷酸水，梯度洗脫，梯度洗脫程序及平衡色譜柱程序見表1、2,流速為1.0ml/rriin，檢測波長為323nm，柱溫35'C，進樣量為1。在上述色譜條件下，對照品和供試品的色譜圖見圖1-4:表1梯度洗脫程序<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2平衡色譜柱程序<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.2對照品溶液的制備取咖啡酸對照品，加甲醇配成咖啡酸質(zhì)量濃度為0.066mg/ml的咖啡酸溶液，過0.45um微孔濾膜，即得咖啡酸對照品溶液。取綠原酸對照品，加甲醇配成綠原酸質(zhì)量濃度為0.0784mg/ml的綠原酸溶液，過0.45"m微孔濾膜，即得綠原酸對照品溶液。浸膏制備方法取蒲公英，加水煎煮1.5小時，濾過，70—80'C,濾液濃縮至相對比重為1.11.4，75。C時，溶縮至比重1.24，加2.5倍量的乙醇，靜置使其沉淀，濾取上清液，濃縮，在8(TC以下干燥成干浸膏。稱取蒲公英浸膏0.08g，分別加入0.0784mg/ml綠原酸對照品溶液lml，0.066mg/ml咖啡酸對照品溶液2.5ml，即加入綠原酸對照品0.0784mg，咖啡酸對照品O.165mg，得混合對照品溶液。2.3供試品溶液的制備稱定蒲公英浸膏粉末0.16g左右(相當于1克藥材)，加入體積濃度為5%甲酸的甲酸甲醇溶液20ml，稱定重量，超聲提取(功率250W，頻率40kHz)30min，取出放至18—25"C，加體積濃度為5%甲酸的甲酸甲醇溶液補足減失重量，過濾，取續(xù)濾液，用0.45um微孔濾膜過濾，即得蒲公英浸膏供試品溶液。稱定蒲公英片劑粉末0.27g左右，加入體積濃度為5%甲酸的甲酸甲醇溶液10ml，稱定重量，超聲提取(功率250W，頻率40kHz)30min，取出放至18—25°C，加體積濃度為5%甲酸的甲酸甲醇溶液補足減失重量，過濾，取續(xù)濾液，用0.45ym微孔濾膜過濾，即得蒲公英片劑供試品溶液。2.4樣品含量的測定取待測10批浸膏，按照2.3項下供試品制備方法進行處理，制備浸膏溶液，注入液相色譜儀，每個樣品進樣兩針，進樣后根據(jù)峰面積用標準曲線法計算樣品含量，取其平均值為平均百分含量，結(jié)果見表3。結(jié)果表明蒲公英浸膏中咖啡酸、綠原酸含量較穩(wěn)定。表3十批浸膏含量<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>取待測10批片劑，按照2.3項下供試品制備方法進行處理，制備片劑溶液，注入液相色譜儀，每個樣品進樣兩針，進樣后根據(jù)峰面積用標準曲線法計算樣品含量，.取其平均值為平均百分含量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明蒲公英浸膏中咖啡酸、綠原酸含量較穩(wěn)定。表4十批片劑含量<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例2方法學考察1.線性關系考察稱取咖啡酸對照品適量，加甲醇配成0.066mg/ml的對照品溶液，分別進樣0.4、0.8、2、3、8ul，按照實施例1中色譜條件進樣測定峰面積，以質(zhì)量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程為Y二l.444e+006X，r=0.9999，在0.0264yg0.528ug范圍內(nèi)有良好的線性關系。稱取綠原酸對照品適量，加甲醇配成0.0784mg/ml的對照品溶液，分別進樣0.4、1、2、3、8ul，按照實施例1中色譜條件進樣測定峰面積，以質(zhì)量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程為Y二l.003e+006X，r=0.9999，在0.03136ug0.6272ug范圍內(nèi)有良好的線性關系。2.穩(wěn)定性試驗稱定蒲公英浸膏J10號樣品0.16g，按照實施例1中2.3項下蒲公英浸膏供試品制備方法進行處理，制備浸膏溶液，分別在0h、lh、2h、4h、8h、12h、24h進樣，共進樣7次，記錄綠原酸、咖啡酸的峰面積，綠原酸峰面積變異系數(shù)為1.54%，咖啡酸峰面積變異系數(shù)為1.22%，表明蒲公英浸膏供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。3.色譜系統(tǒng)的精密度試驗稱定蒲公英浸膏J10號樣品0.16g，按照實施例1中2.3項下蒲公英浸膏供試品制備方法進行處理，制備浸膏溶液，連續(xù)進樣5次，記錄綠原酸、咖啡酸的峰面積，綠原酸峰面積變異系數(shù)為2.13%、咖啡酸峰面積變異系數(shù)為1.02%，表明色譜系統(tǒng)精密度良好。4.方法重復性試驗稱定蒲公英浸膏J10號樣品0.16g，共取5份，按照實施例1中2.3項下蒲公英浸膏供試品制備方法進行處理，制備浸膏溶液，進樣后記錄咖啡酸、綠原酸的峰面積，5份樣品中綠原酸含量變異系數(shù)為1.87%，咖啡酸峰含量變異系數(shù)為1.43%，表明方法重復性良好。5.回收率試驗稱取蒲公英浸膏J10號樣品0.08g，共5份，分別加入0.0784mg/ml綠原酸標準溶液lml,0.066mg/ml咖啡酸標準溶液2.5ml，即加入綠原酸對照品0.0784mg，咖啡酸對照品0.165mg，得混合對照品溶液，按照實施例1中2.3項下蒲公英浸膏供試品制備方法進行處理，制備浸膏溶液，進樣后根據(jù)峰面積用標準曲線法計算含量，求出回收率，綠原酸平均回收率為98.52%，RSD為1.64%，咖啡酸平均回收率為99.09%，RSD為1.52呢，結(jié)果見表5。表5加樣回收試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>綜上，本發(fā)明方法是在一個條件下同時對兩個有效成分進行含量測定，方法簡單、快速、準確，是蒲公英及其制劑有效成分含量測定的理想方法。發(fā)明人曾嘗試用等度洗脫測定綠原酸、咖啡酸含量，但發(fā)現(xiàn)雖然出峰時間較快，但峰形及分離度都不佳，后采用梯度洗脫，30分鐘內(nèi)綠原酸和咖啡酸都出峰，且分離良好，峰形較佳，重復性較好。流動相采用甲醇一磷酸水，且PH值適宜，同時測定綠原酸和咖啡酸兩個有效成分，優(yōu)于藥典法。權(quán)利要求1、HPLC法同時測定蒲公英制劑中綠原酸、咖啡酸含量的方法，是分別制備供試品溶液和對照品溶液，用RP-HPLC法測定綠原酸、咖啡酸含量，其特征是對照品為綠原酸、咖啡酸；色譜條件為色譜柱為AichromBond-AQ柱，250mm×4.6mm，5μm，流動相為甲醇-0.015％磷酸水，其中流動相A為甲醇，流動相B為體積濃度0.015％的磷酸水，采用梯度洗脫，0.01-20min時，流動相A∶流動相B的體積比為20％∶80％即0.01min時，流動相A與流動相B的體積比為20％∶80％，保持到20min，在20-40min，流動相A∶流動相B的體積比為30％∶70％，即在20-40min時，流動相A與B的體積比由初始時的20％∶80％逐漸改變到30％∶70％，流速為1.0ml/min，檢測波長為323nm，柱溫30℃～40℃；在測定綠原酸、咖啡酸含量前，利用流動相先對色譜柱進行平衡，流動相A與流動相B初始體積比為30％∶70％，在0-2min，流動相A與流動相B的體積比改變?yōu)?0％∶80％，保持到22min，流速為1.0ml/min；供試品溶液和對照品溶液的制備方法為取蒲公英浸膏粉末0.16g左右，加入體積濃度為5％甲酸的甲酸甲醇溶液20ml，稱定重量，超聲提取30min，取出，放至18-25℃，加體積濃度為5％甲酸的甲酸甲醇溶液補足減失重量，過濾，取續(xù)濾液，再過濾，即得蒲公英浸膏供試品溶液；取蒲公英片劑粉末0.27g左右，加入體積濃度為5％甲酸的甲酸甲醇溶液10ml，稱定重量，超聲提取30min，取出，放至18-25℃，加體積濃度為5％甲酸的甲酸甲醇溶液補足減失重量，過濾，取續(xù)濾液，再過濾，即得蒲公英片劑供試品溶液；取咖啡酸對照品，加甲醇配成咖啡酸質(zhì)量濃度為0.066mg/ml的咖啡酸溶液，過濾，即得咖啡酸對照品溶液；取綠原酸對照品，加甲醇配成綠原酸質(zhì)量濃度為0.0784mg/ml的綠原酸溶液，過濾，即得綠原酸對照品溶液；稱取蒲公英制劑，分別加入0.0784mg/ml綠原酸對照品溶液1ml，0.066mg/ml咖啡酸對照品溶液2.5ml，即加入綠原酸對照品0.0784mg，咖啡酸對照品0.165mg，得混合對照品溶液。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的HPLC法同時測定蒲公英制劑中綠原酸、咖啡酸含量的方法，其特征在于，所說的柱溫為35'C。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的HPLC法同時測定蒲公英制劑中綠原酸、咖啡酸含量的方法，其特征在于，所說的制備的供試品溶液和對照品溶液用0.45ym微孔濾膜過濾，進樣量為5ul，記錄時間40min。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的HPLC法同時測定蒲公英制劑中綠原酸、咖啡酸含量的方法，其特征在于，所說的蒲公英制劑是指蒲公英浸膏和蒲公英片劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種HPLC法同時測定蒲公英制劑中綠原酸、咖啡酸含量的方法，可有效解決以綠原酸和咖啡酸作為指標性成分，同時進行含量測定，對蒲公英制劑的質(zhì)量標準奠定基礎解決的問題，實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術方案是分別制備供試品溶液和對照品溶液，用RP-HPLC法，梯度洗脫，流動相采用甲醇—磷酸水，測定綠原酸、咖啡酸含量，本發(fā)明方法簡便、可靠、迅速，靈敏度高，重現(xiàn)性好，回收率高，以綠原酸和咖啡酸作為指標性成分，為蒲公英及其制劑質(zhì)量標準的制定奠定了基礎，提供了更科學的依據(jù)。文檔編號G01N30/06GK101324546SQ200810140829公開日2008年12月17日申請日期2008年7月28日優(yōu)先權(quán)日2008年7月28日發(fā)明者璐孟,師繪敏,朱艷琴,李喜鳳,董誠明,閩許,陳隨清申請人:河南中醫(yī)學院