專利名稱：一種時間競爭放射免疫反應檢測待測抗原濃度的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及放射免疫反應中快速檢測待測抗原濃度的方法。
背景技術：
放射免疫反應(RIA)是標記抗原4Ag和非標記抗原Ag(待測抗原或其標準
品)對有限量的特異性抗體Ab進行競爭性結合反應，終產物中標記抗原抗體復合
物的放射性強度與非標記抗原的含量呈逆相關的數學關系。示意圖-1如下
*Ag+Ag+Ab *Ag-Ab+Ag-Ab
*Ag-Ab代表標記抗原抗體復合物,Ag-Ab代表非標記抗原抗體復合物。在上式
的反應體系中-Ag和Ag彼此競爭與有限量的Ab起結合反應，分別形成相應的
復合物。，Ag和Ag的免疫性完全相同，對Ab具有同樣的親和力，當+Ag與Ab
為恒量，*Ag與Ag的總量大于Ab上的有效結合位點時，*Ag、 Ag、 Ab三者
混合后，*Ag-Ab的形成量與Ag量成反比，剩下的未結合或游離的*八8則與
Ag成正比。因此，在反應達到平衡時*八§的放射性強度按一定比例在游離(F)
和結合(B)兩種狀態(tài)之間。如Ag量增加，將抑制*八8與八5的結合，游離的
*Ag量相對增加，Ag-Ab的形成量則增加。由此測定*Ag_Ab或Mg的放射性
強度，即可推算出未Ag的量。這種現象稱競爭結合反應，Ab的量(從
變量)與Ag的量(自變量)之間存在的競爭性抑制的數量函數關系是放射免疫的
定量基石出。
用一系列已知的不同濃度標準抗原(Ag)與固定量的*八8和Ab進行反應， 待競爭結合反應平衡后，分離抗原結合部分B和游離部分F，用放射性探測器分 別測定^Ag-Ab和*八§的放射性，則其不同濃度標準抗原就得到相應的不同的 *Ag_Ab復合物放射性計數。計算出B%B/(B+F)X 100;稱結合率或B/B。 ％(B0 為不含非標記Ag的最大結合放射性)。用橫坐標表示標準抗原的濃度，縱坐標 表示B。/?；駼/BG %繪制出Bn/?；駼/BQ %隨Ag量變化的曲線即為標準曲線(圖1 )。 在相同條件下，測得被測樣品的B。/?；駼/Boyo(或其他指標)，與標準曲線對照， 即可査出未知樣品的抗原(Ag)濃度，也就是將實驗測得的未知樣品的直接結 果(即反應值)換算成劑量，故標準曲線也稱劑量反應曲線(dose responsecurve )o
RIA測得的數據可用作圖法和數學模型法處理。實踐結果及數學推導表 明，RIA的標準曲線都是曲線，由于標準曲線的繪制是以少數離散點為依據的， 所以繪圖求值難免人為誤差，因此提出一些變換坐標和曲線直線化的作圖方法。 目前公認以結合率的logit值為縱坐標，標準Ag濃度的log值為橫坐標，用最 小二乘法對各離散點進行直線回歸得出標準曲線(也稱劑量反應曲線)(圖2) 是較好的方法。
本發(fā)明中名詞解釋
標記抗原是指抗原分子結構中某一原子被放射性核素原子取代的抗原； 放射性強度單位時間內核素的衰變數；
結合率用不同濃度的非標記抗原與固定量的標記抗原和相應的抗體反應，
待競爭結合達到平衡后，分離抗原的結合部分和游離部分，用放射性探測器分別 測定結合部分的標記抗原和固定量的標記抗原的放射性強度，結合部分的標記抗 原放射性強度(B)與固定量的標記抗原的放射性強度比率稱結合率。
最大結合率不含非標記抗原管的最大結合放射性(B。)， g卩，固定量標記抗 原與抗體反應，結合達到平衡后，分離抗原的結合部分和游離部分，用放射性探 測器分別測定結合部分的標記抗原的放射性強度，結合部分的標記抗原放射性強 度B與固定量的標記抗原的放射性強度比率。 現有的放射免疫實驗操作流程是-
1. 把不同濃度標準品(或待測血清)相對應編號試管放入試管架；
2. 加入一定量標準品(或待測樣品)。
3. 加入固定量的標記抗原(與標準品相同的抗原)。
4. 加入固定量的抗體。
5. 混勻，37t:溫育45分鐘或45分鐘以上，4°C18小時或4°C18小時以上。
6. 加入分離試劑混勻靜置15分鐘。
7. 3500轉/分離心15分鐘一20分鐘(如磁性分離置于磁性試管架上靜置10
分鐘)。
7.抽取上清液。
最后放入r一計數器測量沉淀物的放射性強度。根據標準品的放射計數制 作出標準曲線。標準曲線的繪制準品管濃度的log值為橫坐標，相對百分結合 率(B/B。)的logit值為縱坐標，繪制出標準曲線，根據待測樣品的放射性強度在標準曲線上找出相應的濃度。這樣就求得待測樣品的濃度。 目前r一計數器全部由微電腦控制、管理以及數據處理。 r一計數器操作流程
把不同濃度標準品(或待測樣品)相對應編號試管放入待測地方，接通電源， 屏幕顯示不同測量程序，鍵入放射免疫實驗測量程序；屏幕顯示標準管復管數、 測量時間、數據處理模式、標準品濃度編號數、質量控制管數、待測樣品起始管 數，鍵入標準管復管數l (如有要求做雙管則鍵入2);移動光標到測量時間，鍵 入30秒；移動光標到數據處理模式，鍵入logit-log數據處理模式(以B/B0 的logit值為縱坐標，標準Ag濃度的log值為橫坐標)；移動光標到標準品濃度 編號數，依次鍵入標準品濃度數；移動光標到質量控制管數，鍵入質量控制管數; 移動光標到待測樣品起始管數，鍵入l。再次鍵入，屏幕顯示是否開始測量，如 開始測量則再次鍵入，測量開始。當標準品測量完畢，屏幕顯示標準品曲線和是 否修改數據，如修改則移動光標到修改位置，按提示修改數據，修改完畢，鍵入 確定，如不修改再次鍵入屏幕顯示是否打印標準曲線，鍵入確定，打印標準品曲 線，再次鍵入，樣品測量開始，每測量一個樣品自動打印出待測樣品的濃度。
如現有技術中甲狀腺素的實驗操作流程如下
1. 把不同濃度標準品(或待測血清}相對應編號試管放入試管架；
2. 加入0. lml不同濃度甲狀腺素標準品(或待測血清)。
3. 加入O. lml標記甲狀腺素。
4. 加入0. lml甲狀腺素抗體。
5. 混勻37"恒溫箱溫育45分鐘。
6. 加入O. 5ml分離試劑。
7. 混勻靜置15分鐘。
8. 3500轉/分離心15分鐘.
9. 抽取上清液.
10. 用r一計數器測量沉淀物的放射性強度.
甲狀腺素標準品濃度分別為20. 40. 80.160. 320nmol/ml，如圖2 ，樣品的濃 度自動打印出來。
目前的放射免疫實驗技術是用不足量的抗體(最大結合率在30%—60%左右) 經過37°C45分鐘或45分鐘以上溫育,4°C18小時或18小時以上溫育，待反應達 到平衡后加入分離試劑，離心或磁性分離，去掉游離的標記抗原和待測抗原(或其標準品)，然后測其放射性強度。根據標準品放射性強度制作標準曲線，待測 樣品的放射性強度在標準曲線中有相應的濃度，這樣求得待測樣品的濃度。目前 這種方法穩(wěn)定性好，重復性好，但反應時間長，出結果慢，只能手工操作，不能 實現自動化。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的旨在提供一種時間競爭放射免疫反應測待測抗原濃度的方法， 可有效地克服原有的平衡法測待測抗原濃度時，在溫育過程中所需時間長，通過 本發(fā)明的方法都能在短時內獲得滿意的檢測結果。
本發(fā)明的目的是通過下述方式實現的
采用足量濃度的抗體，用對倍稀釋法，稀釋成不同倍數濃度的抗體，分別與
標記抗原進行放射免疫反應，測定放射性強度，找出的最大結合率B。在75-95% 的稀釋倍數濃度的抗體；用此稀釋倍數濃度的抗體再與標記抗原進行放射免疫反 應，測放射性強度，找出最大結合率在30-60免范圍內的恒溫溫育時間T;用此溫 育時間T和最大結合率在75-95%的稀釋倍數濃度的抗體進行放射免疫反應，測 定待測抗原濃度；所述足量濃度的抗體是指能與標記抗原進行充分放射免疫反應 的抗體；最大結合率固定量標記抗原與抗體反應，結合達到平衡后，分離抗原 的結合部分和游離部分，用放射性探測器分別測定結合部分的標記抗原的放射性 強度，結合部分的標記抗原放射性強度B與固定量的標記抗原的放射性強度比 率。
本發(fā)明所用濃度的抗體(是最大結合率在75-95%時，所選用的抗體的濃度)， 經過37'C3—10分鐘溫育即可加入分離試劑。
本發(fā)明的時間競爭放射免疫反應基本操作方法如下
首先用對倍稀釋法稀釋足量的抗體，用對倍稀釋法稀釋4個點，制作出抗體 濃度與最大結合率的曲線(如圖3)，找出最大結合率在75-95%左右的抗體的稀釋 倍數的濃度M。這個稀釋倍數必須是整數。用這種濃度的抗體制作出時間與最大 結合率的曲線(如圖4)，找出最大結合率在30-60%左右的時間點作為溫育的時間 T，這個時間必須是分的整數。即可用所述的抗體的濃度M和溫育時間T檢測待 測抗原的濃度。
本發(fā)明對于原有技術中4'C溫育條件下的均要在18小時以上的反應也很適 合，通過本發(fā)明的方法都能在短時內獲得滿意的檢測結果。


圖1為采用常規(guī)的平衡法所制得的甲狀腺素標準濃度曲線圖。
圖2是對圖1的B/B。M用B/B。%logit值進行修正后甲狀腺素標準濃度曲線圖。
圖3為實施例1足量的抗體在對倍稀釋后的各自的最大結合率曲線圖。其中 Al為最大結合率在75-95%范圍內的抗體稀釋倍數的整數。
圖4為實施例1中用圖3所得的抗體A1的濃度在不同時間段的最大結合率。 其中T2為最大結合率在30-60%范圍內的溫育時間。
圖5為實施例2足量的抗體在對倍稀釋后的各自的最大結合率曲線圖。其中 A2為最大結合率在75-95%范圍內的抗體稀釋倍數的整數。
圖6為實施例2中用圖5所得的抗體A2的濃度在不同時間段的最大結合率。 其中T2為最大結合率在30-60%范圍內的溫育時間。
圖7為實施例3足量的抗體在對倍稀釋后的各自的最大結合率曲線圖。其中 A3為最大結合率在75-95%范圍內的抗體稀釋倍數的整數。
圖8為實施例3中用圖5所得的抗體A2的濃度在不同時間段的最大結合率。 其中T3為最大結合率在30-60%范圍內的溫育時間。
圖9為實施例4足量的抗體在對倍稀釋后的各自的最大結合率曲線圖。其中 A4為最大結合率在75-95%范圍內的抗體稀釋倍數的整數。
圖10為實施例4中用圖9所得的抗體A2的濃度在不同時間段的最大結合率。 其中T4為最大結合率在30-60%范圍內的溫育時間。
具體實施例方式
實施例1.
甲狀腺素的實驗操作流程
取抗體進行對倍稀釋，分別與標記抗原進行放射免疫反應，制作出抗體濃度 與最大結合率B。的曲線，找出最大結合率在75-95%左右的稀釋倍數為5倍(見圖 3)，用這種濃度的抗體再與標記抗原進行放射免疫反應，制作出不同時間下的最 大結合率B。的曲線，找出最大結合率B。在30-60%左右的時間點為3分鐘，3分 鐘為溫育的時間(見圖4)。
1. 把不同濃度標準品(或待測血清}相對應編號試管放入試管架；
2. 加入0. lml不同濃度甲狀腺素標準品(或待測血清)。
3. 加入O. lml標記甲狀腺素。4. 加入0. lml稀釋倍數為5倍的濃度的甲狀腺素抗體。
5. 混勻37'C恒溫箱溫育3分鐘。 后面的流程與平衡法相同
6. 加入O. 5ml分離試劑。
7. 混勻靜置15分鐘。
8. 3500轉/分離心15分鐘。
9. 抽取上清液.
10. 用r—計數器測量沉淀物的放射性強度。 實施例2白細胞介素6的實驗操作流程
取抗體進行對倍稀釋，制作出抗體濃度與最大結合率的曲線(見圖5)，找出 最大結合率在75-95%左右的稀釋倍數為5倍，用這種濃度的抗體再與標記抗原 進行放射免疫反應，制作出不同時間與最大結合率的曲線，找出最大結合率在 30-50%左右的時間點為10分鐘，10分鐘為溫育的時間(見圖6)。
I
1. 把不同濃度標準品(或待測血清}相對應編號試管放入試管架；
2. 加入0. lml不同濃度的白細胞介素6標準品(或待測血清)。
3. 加入0. lml標記白細胞介素6。
4. 加入0. lral稀釋倍數為5倍的濃度的白細胞介素6抗體。
5. 混勻37'C溫育IO分鐘。 后面的流程與平衡法相同
6. 加入O. 5ml分離試劑。
7. 混勻靜置15分鐘。
8. 3500轉/分離心15分鐘。
9. 抽取上清液。
10. 用r—計數器測量沉淀物的放射性強度。 實施例3皮質醇的實驗操作流程
取抗體進行對倍稀釋，分別與標記抗原進行放射免疫反應，制作出抗體濃度 與最大結合率的曲線(見圖7)，找出最大結合率在75-95%左右的稀釋倍數為5 倍，用這種濃度的抗體再與標記抗原進行放射免疫反應，制作出不同時間與最大 結合率的曲線，找出最大結合率在30-50%左右的時間點為5分鐘，5分鐘為溫育 的時間(見圖8)。1.把不同濃度標準品(或待測血清}相對應編號試管放入試管架；
2. 加入0. lml不同濃度的皮質醇標準品(或待測血清)。
3. 加入0. lml標記皮質醇。
4. 加入0. lml稀釋倍數為5倍的濃度的皮質醇抗體。
5. 混勻37。C溫育5分鐘。 后面的流程與平衡法相同
6. 加入0. 5ml分離試劑。
7. 混勻靜置15分鐘。
8. 3500轉/分離心15分鐘。
9. 抽取上清液。
10. 用r一計數器測量沉淀物的放射性強度。 實施例4三碘甲狀腺原氨酸的實驗操作流程
取抗體進行對倍稀釋，分別與標記抗原進行放射免疫反應，制作出抗體濃 度與最大結合率的曲線(見圖9)，找出最大結合率在75-95%左右的稀釋倍數為4 倍，用這種濃度的抗體再與標記抗原進行放射免疫反應，制作出不同時間與最大 結合率的曲線，找出最大結合率在30-50%左右的時間點為5分鐘，5分鐘為溫育 時間(見圖10)。
1. 把不同濃度標準品(或待測血清}相對應編號試管放入試管架；
2. 加入0. lml不同濃度的三碘甲狀腺原氨酸標準品(或待測血清)。
3. 加入0. lml標記三碘甲狀腺原氨酸。
4. 加入0. lml稀釋倍數為4倍的濃度的三碘甲狀腺原氨酸抗體。
5. 混勻37"C溫育5分鐘。 后面的流程與平衡法相同
6. 加入O. 5ml分離試劑。
7. 混勻靜置15分鐘。
8. 3500轉/分離心15分鐘。
9. 抽取上清液。
10. 用r一計數器測量沉淀物的放射性強度。 不同廠家的試劑溫育時間略有不同，但都適合時間競爭法。放射免疫反應能夠
檢測的項目很多，現僅舉4例，且以上實施例旨在說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的 進一步限定。
權利要求
1、一種時間競爭放射免疫反應檢測待測抗原濃度的方法，其特征在于，采用足量濃度的抗體，用對倍稀釋法稀釋成不同倍數濃度的抗體，分別與標記抗原進行放射免疫反應，測定放射性強度，找出最大結合率B0在75-95％的稀釋倍數濃度的抗體；用此稀釋倍數濃度的抗體再與標記抗原進行放射免疫反應，測放射性強度，找出最大結合率在30-60％范圍內的恒溫溫育時間T；用此溫育時間T和最大結合率在75-95％的稀釋倍數濃度的抗體進行放射免疫反應，測定待測抗原濃度；所述足量濃度的抗體是指能與標記抗原進行充分放射免疫反應的抗體；所述的最大結合率是指固定量標記抗原與抗體反應，結合達到平衡后，分離抗原的結合部分和游離部分，用放射性探測器分別測定結合部分的標記抗原的放射性強度，結合部分的標記抗原放射性強度B與固定量的標記抗原的放射性強度比率。
全文摘要
一種時間競爭放射免疫反應檢測待測抗原濃度的方法，采用足量濃度的抗體，用對倍稀釋法，稀釋成不同倍數濃度的抗體，分別與標記抗原進行放射免疫反應，測定放射性強度，找出最大結合率B₀在75-95％的稀釋倍數濃度的抗體；用此稀釋倍數濃度的抗體再與標記抗原進行放射免疫反應，測放射性強度，找出最大結合率在30-60％范圍內的恒溫溫育時間；用此溫育時間和最大結合率在75-95％的稀釋倍數濃度的抗體進行放射免疫反應，測定待測抗原濃度；所述足量濃度的抗體是指能與標記抗原進行充分放射免疫反應的抗體。本發(fā)明可有效地克服原有的平衡法檢測待測抗原濃度時，在溫育過程中所需時間長的狀況，通過本發(fā)明的方法都能在短時內獲得滿意的結果。
文檔編號G01N33/53GK101413942SQ20081014387
公開日2009年4月22日 申請日期2008年12月9日 優(yōu)先權日2008年12月9日
發(fā)明者王克超 申請人:王克超