專利名稱：非接觸生物探測掃描納米玻璃探針顯微鏡及其工作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物學(xué)探測用掃描探針顯微鏡技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種在生 理培養(yǎng)液體中非接觸式實時探測活體生物樣品的掃描納米玻璃探針顯微鏡技 術(shù)，即一種非接觸生物探測掃描納米玻璃探針顯微鏡及其工作方法。
(二)
背景技術(shù)：
隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，高分辨率地實時探測活體生物樣品一直以來 都是納米生物醫(yī)學(xué)專家，尤其是那些從事納米尺度生物樣品顯微成像的專家 們所必需面對的技術(shù)挑戰(zhàn)。普通光學(xué)顯微鏡由于受到光學(xué)衍射極限的限制， 其用于生物樣品探測的最高分辨率很難突破250納米。電鏡盡管具有足夠高 的分辨率，但需要對生物樣品進行固化和特別處理以實現(xiàn)樣品的導(dǎo)電性，這 勢必會改變、甚至破壞樣品表面的微觀結(jié)構(gòu)，因此不適合活體生物樣品的實
、1981年美國IBM公司設(shè)在瑞士蘇黎士的實驗室，研制出了世界上第一臺 具有原子分辨率的掃描隧道顯微鏡(scanning tunnelling microscopy, STM)， 并帶來了納米技術(shù)的迅猛發(fā)展，成為了人類認識微觀世界的有力工具。近年 來，在STM的原理與結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，相繼產(chǎn)生了一系列利用探針與樣品的不 同相互作用來探測納米尺度下表面或界面性質(zhì)的掃描探針顯微鏡技術(shù)
(scanning probe microscopy, SPM)。為了彌補STM只限于觀測導(dǎo)體和半導(dǎo) 體表面結(jié)構(gòu)的缺陷，Birmig等人發(fā)明了原子力掃描探針顯微鏡技術(shù)(atomic force microscopy, AFM) [1]。 AFM是一種專為研究非導(dǎo)電樣品而設(shè)計的基于 STM控制技術(shù)的SPM，它通過探測探針尖端的原子與樣品表面的原子之間產(chǎn)生 極其微弱的相互作用力，并利用該原子之間作用力的微弱變化來負反饋控制 探針在樣品表面掃描。AFM因采用輕敲模式(Tappingmode)克服了接觸模式 的某些不足，使高分辨率研究活體生物樣品成為可能[2]。由于AFM顯微鏡技術(shù) 利用探針與生物樣品表面間的作用力為負反饋控制來進行掃描，AFM掃描過程 中需要探針與生物樣品表面進行或多或少的接觸，即使是探針與生物樣品表 面間的輕微接觸也會對樣品細胞活性及表面微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生或多或少的影響[3]。國 內(nèi)一些單位也逐步嘗試用非接觸模式的AFM來探測生物樣品，控制探針在樣品表面上方一定距離處掃描且始終不與樣品表面接觸，因而針尖不會對樣品 造成污染或產(chǎn)生破壞，避免了輕敲模式中遇到的一些問題。然而，在非接觸
模式下，雖然采用針尖振動調(diào)制控制可以增加AFM顯微鏡的靈敏度，但相對 較長的針尖-樣品間距使得分辨率要低于輕敲模式。加之在實際操作中，由于 針尖很容易被樣品表面吸附氣體的表面壓吸附到樣品表面，造成圖像數(shù)據(jù)的 不穩(wěn)定和對樣品的損壞，使非接觸模式的AFM操作及在液體中成像比較困難， 因而不能適應(yīng)柔軟活體細胞在生理狀態(tài)下進行實時探測的需要。
1989年，加州大學(xué)的Hansma教授利用掃描探針顯微鏡的負反饋控制技術(shù)，
用玻璃微探針作為掃描探針設(shè)計出了非接觸式的掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù) (scanning ion conductance microscopy, SICM) [4]。但是由于當時負反饋控
制方法及精確定位技術(shù)的局限與不足，纖細的玻璃微滴管探針在掃描時經(jīng)常 意外地與樣品表面接觸并導(dǎo)致針尖或樣品的毀損，所以掃描離子電導(dǎo)顯微鏡 技術(shù)在其發(fā)明后的很長一段時間僅適用于平坦的PET薄膜的掃描成像。1997 年英國倫敦帝國理工學(xué)院的Korchev教授對掃描離子電導(dǎo)探針顯微鏡的負反 饋控制等技術(shù)進行重大改進后，使該顯微鏡技術(shù)實現(xiàn)了對活體生物樣品表面 結(jié)構(gòu)的非接觸三維實時探測[5]，并逐步成為納米生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域具有發(fā)展?jié)?力及應(yīng)用前景的一種掃描探針顯微鏡技術(shù)[6]。掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)與目前 使用的用于生物樣品探測的其它顯微鏡技術(shù)相比，具有以下特點非接觸式 探測，樣品制備簡單，可以直接用于生理液態(tài)培養(yǎng)環(huán)境下活體生物樣品表面 微觀結(jié)構(gòu)的高分辨率實時探測。
掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)的基本操作原理如文獻報道[7'8]。具體來說，如 圖1所示將Ag/AgCl電極置于充滿電解液的玻璃微探針中作為掃描探針， 內(nèi)含生物樣品與細胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿置于掃描離子電導(dǎo)顯微鏡的樣品掃描臺 上，參比電極置于培養(yǎng)皿的細胞培養(yǎng)液中，并通過負反饋電路實時監(jiān)測探針 內(nèi)電極與參比電極之間電導(dǎo)的變化。當探針接近生物樣品表面時，由于允許 離子流入玻璃微探針針尖自由空間的減小，離子電導(dǎo)也隨之減小。在掃描過 程中，掃描離子電導(dǎo)顯微鏡控制電路通過壓電陶瓷來操控玻璃微探針上下移 動以保持電導(dǎo)守恒，從而保持玻璃微探針以接近針尖尖端內(nèi)半徑r的距離d 在生物樣品表面非接觸地掃過，圖中帶箭頭的虛線代表了玻璃微探針在樣品 表面掃描的軌跡，通過電腦記錄掃描范圍內(nèi)的玻璃微探針的位置及掃描軌跡 便可獲得該生物樣品掃描范圍表面的三維拓撲形貌。目前普遍采用交流調(diào)制(AC)負反饋控制模式并以經(jīng)調(diào)制的流入玻璃微 探針的離子電流(厶》作為負反饋信號來調(diào)節(jié)探針與樣品之間的距離[9]。在 AC模式下，為了保持穩(wěn)定的負反饋控制，玻璃微探針與細胞表面間保持的恒 定距離^應(yīng)接近于玻璃微探針的內(nèi)半徑r，更重要的是隨著探針與樣品間的 距離越來越近時，力c的變化對針尖-樣品距離的變化越來越敏感，微小距離的 改變便可引起厶c產(chǎn)生很大的改變，這種AC負反饋控制模式使我們在實驗過程 中可以對因直流漂移、電極堵塞、溶液離子強度變化和電壓變化造成的離子 電流變化進行有效的補償[11]，從而保證了掃描過程中玻璃微探針與平整的活 體生物樣品之間的非接觸。然而，因為掃描離子電導(dǎo)顯微鏡的分辨率與玻璃 微探針尖端內(nèi)半徑尺寸的數(shù)量級相同，隨著對掃描離子電導(dǎo)顯微鏡的納米尺 度分辨率要求的提高，掃描用玻璃微探針越來越細、尖端內(nèi)半徑尺寸越來越 小，導(dǎo)致負反饋控制下的掃描納米玻璃微探針離生物樣品越來越近。如要達 到50納米的高分辨率，探針在負反饋控制下距生物樣品50納米左右的高度 掃過生物樣品表面。由于探針離生物樣品太近，在掃描高度差異很大的形態(tài) 復(fù)雜的生物樣品時，目前的掃描離子電導(dǎo)顯微鏡探針的掃描軌跡不能很好地 跟隨生物樣品表面形貌的復(fù)雜高度變化，甚至會在掃描時意外地與高度急劇 變化的生物樣品表面接觸并導(dǎo)致針尖或樣品的毀損使其研究領(lǐng)域和掃描速度 受到了很大限制。如呈三角形或多角形的神經(jīng)細胞，可以分為胞體、樹突和 軸突這三個區(qū)域，胞體的大小差異很大，直徑從5 6um到100um以上； 突起的形態(tài)、數(shù)量和長短也大不相同，其中軸突直徑約15-25微米；樹突 直徑0.5-l微米。由于這三個區(qū)域的高度差異大于數(shù)十微米，在掃描離子 電導(dǎo)顯微鏡用納米尺度的玻璃微探針進行的神經(jīng)細胞形態(tài)觀察中，若想在 同一次掃描中同時得到三個區(qū)域的納米尺度的高分辨率成像，顯微鏡負反 饋控制系統(tǒng)必需控制玻璃微探針在距離樣品表面納米尺度的距離的同時， 并頻繁進行數(shù)十微米高度的快速位置變化，這在目前的掃描離子電導(dǎo)顯微 鏡掃描控制模式下難以迅速實現(xiàn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的在于設(shè)計一種非接觸生物探測掃描納米玻璃探針顯微 鏡及其工作方法，它針對現(xiàn)有掃描離子電導(dǎo)顯微鏡掃描控制技術(shù)中的不足， 提供一種既能夠有效防止與生物樣品接觸的高分辨率的快速掃描控制方法， 又能保證掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)可以完成活體生物樣品表面復(fù)雜形貌的快速非接觸掃描探測。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種非接觸生物探測掃描納米玻璃探針顯微鏡，其 特征在于它包括納米玻璃探針、兩個電極、高速Z向平板壓電陶瓷、前置電
流放大器、鎖相放大器、數(shù)據(jù)采集模塊、DSP控制模塊、高精度XYZ三維平板 壓電陶瓷掃描臺及計算機；其中一個電極置于固定于高速Z向上下運動的平 板壓電陶上的納米玻璃探針中，另一電極置于細胞培養(yǎng)液中作為參比電極， 兩電極之間產(chǎn)生的流入納米玻璃探針的離子電流信號經(jīng)前置電流放大器放大 后輸入鎖相放大器；所說的鎖相放大器的輸出端連接數(shù)據(jù)采集模塊的輸入端； 所說的數(shù)據(jù)采集模塊的輸出端連接DSP控制模塊的輸入端；所說的DSP控制 模塊與計算機呈雙向連接；所說的DSP控制模塊包括調(diào)制控制單元和負反饋 控制單元，其中調(diào)制控制單元的輸出端連接高速Z向平板壓電陶瓷的輸入端， 負反饋控制單元的輸出端連接高精度XYZ三維平板壓電陶瓷掃描臺；所說的 高精度XYZ三維平板壓電陶瓷掃描臺的輸出端連接計算機的輸入端。 上述所說的電極為Ag/AgCl電極。
上述所說的計算機包括信號處理分析單元及圖像生成單元。 一種非接觸生物探測掃描納米玻璃探針顯微鏡的工作方法，其特征在于 它包括以下步驟
(1) 兩電極之間產(chǎn)生的流入納米玻璃探針的離子電流信號經(jīng)前置電流放 大器放大后輸入鎖相放大器；再經(jīng)數(shù)據(jù)采集模塊進行模數(shù)轉(zhuǎn)換后，輸入給DSP 控制模塊；
(2) DSP控制模塊保持與計算機的實時通訊，通過調(diào)制控制單元調(diào)制控 制固定有納米玻璃探針的獨立Z向平板壓電陶瓷的上下高速運動，完成納米 玻璃探針針尖對生物樣品表面形貌的感知；
(3) DSP控制模塊保持與計算機的實時通訊，對流入納米玻璃探針的離 子電流信號進行處理分析，再通過實時DSP負反饋控制單元來控制高精度XYZ 三維平板壓電陶瓷掃描臺上生物樣品與高速Z向運動的納米玻璃探針的非接 觸狀態(tài)；
(4) 通過計算機進行信號處理分析得到高精度XYZ三維平板壓電陶瓷掃 描臺在不同掃描點的空間位置并生成生物樣品的三維拓撲圖。
本發(fā)明的優(yōu)越性在于本發(fā)明中納米玻璃微探針不必緊貼細胞樣品表面 掃描，從而在生物樣品的高分辨率探測中，既有效防止了探針與生物樣品表
6面的接觸，又因為玻璃微探針有足夠的運動幅度和運動速度，進而彌補了傳 統(tǒng)掃描控制方法掃描高度差異大的形態(tài)復(fù)雜的生物樣品時的不足。
(四)


圖1為現(xiàn)有技術(shù)中掃描離子電導(dǎo)顯微鏡的工作原理圖(其中，帶箭頭的 虛線代表了玻璃微探針在樣品表面接觸掃描的相對運動軌跡)。
圖2為本發(fā)明所涉一種非接觸生物探測掃描納米玻璃探針顯微鏡的工作 原理的結(jié)構(gòu)示意圖(其中，帶箭頭的虛線為納米玻璃微探針在樣品表面非接 觸掃描的相對運動軌跡)。
其中，1為納米玻璃探針，2為高速Z向平板壓電陶瓷，3為電極，4為 細胞。
(五)
具體實施例方式
實施例 一種非接觸生物探測掃描納米玻璃探針顯微鏡(見圖2)，其特
征在于它包括納米玻璃探針l、兩個電極3、高速Z向平板壓電陶瓷2、前置 電流放大器、鎖相放大器、數(shù)據(jù)采集模塊、DSP控制模塊、高精度XYZ三維平 板壓電陶瓷掃描臺及計算機；其中一個電極置于固定于高速Z向上下運動的 平板壓電陶2上的納米玻璃探針中，另一電極置于細胞4培養(yǎng)液中作為參比 電極，兩電極3之間產(chǎn)生的流入納米玻璃探針玻璃微探針1的離子電流信號 經(jīng)前置電流放大器放大后輸入鎖相放大器；所說的鎖相放大器的輸出端連接 數(shù)據(jù)采集模塊的輸入端；所說的數(shù)據(jù)采集模塊的輸出端連接DSP控制模塊的 輸入端；所說的DSP控制模塊與計算機呈雙向連接；所說的DSP控制模塊包 括調(diào)制控制單元和負反饋控制單元，其中調(diào)制控制單元的輸出端連接高速Z 向平板壓電陶瓷2的輸入端，負反饋控制單元的輸出端連接高精度XYZ三維 平板壓電陶瓷掃描臺；所說的高精度XYZ三維平板壓電陶瓷掃描臺的輸出端 連接計算機的輸入端。
上述所說的電極3為Ag/AgCl電極。
上述所說的計算機包括信號處理分析單元及圖像生成單元。 一種非接觸生物探測掃描納米玻璃探針顯微鏡的工作方法，其特征在于 它包括以下步驟
(1)兩電極3之間產(chǎn)生的流入納米玻璃探針1的離子電流信號經(jīng)前置電 流放大器放大后輸入鎖相放大器；再經(jīng)數(shù)據(jù)采集模塊進行模數(shù)轉(zhuǎn)換后，輸入 給DSP控制模塊；(2) DSP控制模塊保持與計算機的實時通訊，通過調(diào)制控制單元調(diào)制控 制固定有納米玻璃探針1的獨立Z向平板壓電陶瓷2的上下高速運動，完成 納米玻璃探針1針尖對生物樣品表面形貌的感知；
(3) DSP控制模塊保持與計算機的實時通訊，對流入納米玻璃探針1的 離子電流信號進行處理分析，再通過實時DSP負反饋控制單元來控制高精度 XYZ三維平板壓電陶瓷掃描臺上生物樣品與高速Z向運動的納米玻璃探針1的 非接觸狀態(tài)；
(4) 通過計算機進行信號處理分析得到高精度XYZ三維平板壓電陶瓷掃 描臺在不同掃描點的空間位置并生成生物樣品的三維拓撲圖。
以上所述僅為本發(fā)明用于復(fù)雜形貌的活體生物樣品的高分辨率非接觸快 速探測方式，應(yīng)當指出，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，依據(jù)本發(fā)明的原理， 還可以將該技術(shù)直接用于導(dǎo)電樣品、半導(dǎo)體樣品的探測，這些均落入本發(fā)明 的保護范圍。
權(quán)利要求
1、一種非接觸生物探測掃描納米玻璃探針顯微鏡，其特征在于它包括納米玻璃探針、兩個電極、高速Z向平板壓電陶瓷、前置電流放大器、鎖相放大器、數(shù)據(jù)采集模塊、DSP控制模塊、高精度XYZ三維平板壓電陶瓷掃描臺及計算機；其中一個電極置于固定于高速Z向上下運動的平板壓電陶上的納米玻璃探針中，另一電極置于細胞培養(yǎng)液中作為參比電極，兩電極之間產(chǎn)生的流入納米玻璃探針的離子電流信號經(jīng)前置電流放大器放大后輸入鎖相放大器；所說的鎖相放大器的輸出端連接數(shù)據(jù)采集模塊的輸入端；所說的數(shù)據(jù)采集模塊的輸出端連接DSP控制模塊的輸入端；所說的DSP控制模塊與計算機呈雙向連接；所說的DSP控制模塊包括調(diào)制控制單元和負反饋控制單元，其中調(diào)制控制單元的輸出端連接高速Z向平板壓電陶瓷的輸入端，負反饋控制單元的輸出端連接高精度XYZ三維平板壓電陶瓷掃描臺；所說的高精度XYZ三維平板壓電陶瓷掃描臺的輸出端連接計算機的輸入端。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所說的一種非接觸生物探測掃描納米玻璃探針顯微鏡， 其特征在于所說的電極為Ag/AgCl電極。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所說的一種非接觸生物探測掃描納米玻璃探針顯微鏡， 其特征在于所說的計算機包括信號處理分析單元及圖像生成單元。
4、 一種上述非接觸生物探測掃描納米玻璃探針顯微鏡的工作方法，其特 征在于它包括以下步驟(1) 兩電極之間產(chǎn)生的流入納米玻璃探針的離子電流信號經(jīng)前置電流放 大器放大后輸入鎖相放大器；再經(jīng)數(shù)據(jù)采集模塊進行模數(shù)轉(zhuǎn)換后，輸入給DSP 控制模塊；(2) DSP控制模塊保持與計算機的實時通訊，通過調(diào)制控制單元調(diào)制控 制固定有納米玻璃探針的獨立Z向平板壓電陶瓷的上下高速運動，完成納米 玻璃探針針尖對生物樣品表面形貌的感知；(3) DSP控制模塊保持與計算機的實時通訊，對流入納米玻璃探針的離 子電流信號進行處理分析，再通過實時DSP負反饋控制單元來控制高精度XYZ 三維平板壓電陶瓷掃描臺上生物樣品與高速Z向運動的納米玻璃探針的非接 觸狀態(tài)；(4) 通過計算機進行信號處理分析得到高精度XYZ三維平板壓電陶瓷掃 描臺在不同掃描點的空間位置并生成生物樣品的三維拓撲圖。
全文摘要
一種非接觸生物探測掃描納米玻璃探針顯微鏡，其特征在于它包括納米玻璃探針、兩個電極、高速Z向平板壓電陶瓷、前置電流放大器、鎖相放大器、數(shù)據(jù)采集模塊、DSP控制模塊、高精度XYZ三維平板壓電陶瓷掃描臺及計算機；工作方法為離子電流信號輸入給DSP控制模塊；Z向平板壓電陶瓷的上下高速運動；控制高精度XYZ三維平板壓電陶瓷掃描臺上生物樣品與高速Z向運動的納米玻璃探針的非接觸狀態(tài)；生成生物樣品的三維拓撲圖。優(yōu)越性在于既有效防止了探針與生物樣品表面的接觸，又因為玻璃微探針有足夠的運動幅度和運動速度，進而彌補了傳統(tǒng)掃描控制方法掃描高度差異大的形態(tài)復(fù)雜的生物樣品時的不足。
文檔編號G01N13/10GK101430321SQ20081015402
公開日2009年5月13日 申請日期2008年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月12日
發(fā)明者張彥軍 申請人:國家納米技術(shù)與工程研究院