專利名稱：：一種黃曲霉毒素B₁的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：一種黃曲霉毒素B,的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于光激化學(xué)發(fā)光免疫分析(LICLIA)
技術(shù)領(lǐng)域：
，用于對(duì)詞料，谷物及其制品中AFBi含量的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
：黃曲霉毒素B！(AFB!)是真菌黃曲霉Hspergillusflavus和寄生曲霉A.pamsilicus菌株產(chǎn)生的一組強(qiáng)毒性的次生代謝產(chǎn)物，尤其是AFB,為強(qiáng)污染物質(zhì)，分布范圍廣，能引起人類、各種飼料動(dòng)物的急性中毒死亡，還能引起致癌，致畸，致突變，即使幾十嗎/kg的含量仍有很大的毒性。食品和詞料中黃曲霉毒素lmg/kg以上有劇毒。其毒性為氯化鉀的10倍，為砒霜的68倍。食用被黃曲霉毒素污染嚴(yán)重的食品后可出現(xiàn)發(fā)熱，腹痛，嘔吐，食欲減退，嚴(yán)重者在23周內(nèi)出現(xiàn)肝脾腫大，肝區(qū)疼痛，皮膚黏膜黃染，腹水，下肢浮腫及肝功能異常等中毒性肝病癥狀，也可能出現(xiàn)心臟擴(kuò)大，肺水腫，甚至痙攣，昏迷等癥。由于不易防止食物被真菌污染，因此人們對(duì)長(zhǎng)期食用低劑量黃曲霉毒素污染的可能性非常關(guān)注。由于黃曲霉毒素特別是Bi是潛在的致癌物質(zhì)，人長(zhǎng)期接觸低劑量的黃曲霉毒素可能會(huì)有影響，1988年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將AFB!列為1A類致癌物質(zhì)。AFBi是最強(qiáng)的致癌物質(zhì)，它在食物中的法定限量非常低，其限量標(biāo)準(zhǔn)為2嗎/kg。歐盟委員會(huì)對(duì)嬰幼兒食品中的毒素限量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了補(bǔ)充。草案規(guī)定，在包括谷類食品在內(nèi)的嬰幼兒食品中，毒性最大的AFBi的最大限量為0.05嗎/kg。目前AFBi的測(cè)定方法有多種，如薄層色譜法TLC(靈敏度為5pg/kg)，高效液相色譜法HPLC(靈敏度為0.02|ig/kg)，但由于費(fèi)時(shí)，靈敏度低，儀器設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜且不適用于大批量樣品的檢測(cè)等缺點(diǎn)。酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA)，由于其特異性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，不需直接接觸毒素，且特別適于大批量樣品的檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)而越來(lái)越被人們重視和采用。光激化學(xué)發(fā)光免疫分析(LICLIA)是以納米級(jí)高分子微粒為基礎(chǔ)的新一代化學(xué)發(fā)光技術(shù)，該項(xiàng)技術(shù)將被廣泛地應(yīng)用于研究生物分子的相互作用。其主要原理是由光激發(fā)產(chǎn)生的均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)。它具有快速、均相(免沖洗)、高靈敏和操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。LICLIA試劑由含有感光化合物的感光微粒和含有發(fā)光化合物的發(fā)光微粒組成，微粒直徑約188nm，表面覆蓋多糖水凝膠。水凝膠能減少非特異性結(jié)合，同時(shí)，增加微粒的懸浮性。微粒通過(guò)水凝膠表面的功能團(tuán)與生物分子共價(jià)連接。納米級(jí)微粒大大增加了反應(yīng)的表面積，每個(gè)微粒的表面包被著成百上千個(gè)生物分子，可捕獲目標(biāo)分子。LICLIA技術(shù)的核心原理是單線態(tài)氧的產(chǎn)生和傳遞。在受到紅色激光(680nm)照射后，感光微粒能使周圍環(huán)境中的氧轉(zhuǎn)化為單線態(tài)氧，單線態(tài)氧的生存時(shí)間僅為4微秒。短暫的生存時(shí)間決定了單線態(tài)氧的傳播直徑很小(約為200nm)。如果發(fā)光微粒在200nm范圍之內(nèi)就能接受單線態(tài)氧，并發(fā)出高能級(jí)的光(520nm-620nm)。相反，如果在200nm直徑范圍內(nèi)沒有發(fā)光微粒，單線態(tài)氧就會(huì)回落到基態(tài)氧而沒有信號(hào)產(chǎn)生。這種依賴于兩種微粒相互接近的化學(xué)能量傳遞是LICLIA均相反應(yīng)的基礎(chǔ)。通常在該反應(yīng)體系中，微粒的濃度是很低的。兩種微粒相互隨機(jī)碰撞的幾率很低，因此，反應(yīng)體系的本底非常微弱。如果包被在微粒表面的生物分子相互作用，拉近了兩個(gè)微粒的距離，例如形成免疫夾心或受體-配體復(fù)合物，這樣就能產(chǎn)生能量的有效傳遞并發(fā)出光信號(hào)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)AFBi的試劑盒及其檢測(cè)方法，采用光激化學(xué)發(fā)光免疫分析法(LICLIA)檢測(cè)AFBp用于對(duì)飼料、谷物及其制品中AFBt含量的檢測(cè)。本發(fā)明其技術(shù)方案一種黃曲霉毒素B！的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，黃曲霉毒素Bi簡(jiǎn)稱AFBp其由白色不透明微孔板(1)，AFB^示準(zhǔn)(2)，連接AFBrBSA人工抗原的發(fā)光微粒(3)，兔抗AFBi的抗體凍干品(4)，生物素化羊抗兔抗體凍干品(5)和包被有鏈霉親和素的感光微粒(6)組成。連接AFBrBSA人工抗原的發(fā)光微粒(3)的制備在離心管中加入lmg發(fā)光微粒，加入12.5質(zhì)量濃度1%的Tween-20，0.05mgAFB廣BSA人工抗原，10pL硼氫化氰鈉，用0.1M、pH6.0的2-(N-嗎啉)乙磺酸MES緩沖液將體積補(bǔ)充到200nL，37"C避光振蕩反應(yīng)48小時(shí)；加入10pL0.3M、pH5.0的羧甲氧基胺半鹽酸鹽CMO溶液封閉未結(jié)合位點(diǎn)，37"C避光孵育1小時(shí)后離心，分離得到已連接AFBrBSA的發(fā)光微粒，稀釋后備用。AFBJ示準(zhǔn)(3)，從AFB,純品中稀釋得到，稀釋液為甲醇水體積比3:7，AFB!標(biāo)準(zhǔn)共6瓶，AFB!濃度分別為Ong/mL，0.05ng/mL，0.5ng/mL，lng/mL，10ng/mL，100ng/mL。用所述的試劑盒檢測(cè)AFBt的方法，取包被有AFBrBSA人工抗原的發(fā)光微粒加入到白色不透明微孔板；加入AFBi標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中，然后各孔順序加入兔抗AFB,抗體、生物素化羊抗兔抗體進(jìn)行標(biāo)記免疫反應(yīng)；接著暗處加入包被有鏈霉親和素的感光微粒進(jìn)行反應(yīng)后檢測(cè)光信號(hào)，以加入AFB!標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以加入被測(cè)樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的AFB!含量。檢測(cè)AFB,的具體操作為取20pL包被有AFBrBSA人工抗原的發(fā)光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20pL的AFB,標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中；加20pL兔抗AFBi抗體；繼續(xù)加入20|iL生物素化羊抗兔抗體，37t:孵育15分鐘；暗處加175)LiL包被有鏈霉親和素的感光微粒，37。C暗處孵育15分鐘后在光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上檢測(cè)光信號(hào)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的AFB,含量。樣品處理，玉米、谷物樣品處理將樣品粉碎至20目，取5克樣品放在試管中，加入提取液12.5mL，提取液為甲醇水體積比7:3，加塞振蕩3分鐘，過(guò)濾，濾紙采用新華1號(hào)紙，取lmL濾液用lmL蒸餾水或去離子水進(jìn)行稀釋，備用。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明測(cè)定的基礎(chǔ)是標(biāo)記免疫反應(yīng)。該檢測(cè)試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便、廉價(jià)、檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高。圖1:檢測(cè)AFB!的試劑盒示意圖。1、白色不透明微孔板，2、AFBd示準(zhǔn)，3、連接AFBi人工抗原的發(fā)光微粒，4、AFBi的抗體凍干品，5、生物素化羊抗兔抗體凍干品，6、包被有鏈霉親和素的感光微粒。圖2:AFBrLICLIA反應(yīng)示意圖。圖3:AFBrLICLIA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施方案實(shí)施例l:制備試劑盒和檢測(cè)玉米樣品發(fā)光微粒和包被有鏈霉親和素的感光微粒均購(gòu)于博陽(yáng)生物科技(上海)有限公司。包被有AFB!人工抗原的發(fā)光微粒制備在離心管中加入lmg發(fā)光微粒，加入12.5(iL1%Tween-20，0.05mgAFB廠BSA人工抗原，10pL硼氫化氰鈉，用O.IM、pH6.0的2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)緩沖液將體積補(bǔ)充到200pL，37。C避光振蕩反應(yīng)48小時(shí)。加入10pL0.3M、pH5.0的羧甲氧基胺半鹽酸鹽(CMO)溶液封閉未結(jié)合位點(diǎn)，37"C避光孵育1小時(shí)后離心，分離得到已連接AFBrBSA的發(fā)光微粒，稀釋后備用。試劑的配制AFB,標(biāo)準(zhǔn)品的配制AFBt標(biāo)準(zhǔn)(0ng/mL,0.05ng/mL，0.5ng/mL，lng/mL，10ng/mL，100ng/mL)，從AFBt純品中稀釋得到，稀釋液為甲醇水=3:7。試劑盒的組成(1)、白色不透明微孔板(12條x8孔，可以拆分為單孔)。(2)、lx包被有AFB,人工抗原的發(fā)光微粒2mL。(3)、6xAFB!標(biāo)準(zhǔn)液，1.0mL/瓶，標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0，0.05，0.5，1，10，100ng/mL。(4)、lx兔抗AFB,抗體凍干品，用時(shí)2mL蒸餾水溶解。(5)、lx生物素化羊抗兔抗體凍干品，用時(shí)2mL蒸餾水溶解。(6)、lx包被有鏈霉親和素的感光微粒20mL。測(cè)定時(shí)注意事項(xiàng)1、使用之前將所有試劑回升至室溫(18-3(TC)。2、使用之后立即將所有試劑放回2-8"。3、在所有恒溫孵育過(guò)程中避免光線照射。具體檢測(cè)步驟如下先將樣品進(jìn)行處理將玉米樣品粉碎至20目，取5克樣品放在試管中，加入提取液12.5mL(甲醇水=7:3)。加塞振蕩3分鐘，過(guò)濾，濾紙采用新華1號(hào)紙。取lmL濾液用lmL蒸餾水或去離子水進(jìn)行稀釋，備用。取20|nL包被有AFBrBSA發(fā)光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20pL的AFBt標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品到各自的微孔中；力Q20pL兔抗AFBt抗體；繼續(xù)加入20|iL生物素化羊抗兔抗體，37"C孵育15分鐘；暗處加175|aL包被有鏈霉親和素的感光微粒，37"C暗處孵育15分鐘后在光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上檢測(cè)光信號(hào)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的AFB〗含量。結(jié)果見表l，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得該例樣品所含AFBi濃度為0.45ng/mL。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例2:大麥樣品測(cè)定試劑盒提供的試劑與實(shí)施例1相同，用于檢測(cè)大麥樣品。具體檢測(cè)步驟如下先將大麥樣品進(jìn)行處理將大麥樣品粉碎至20目，取5克樣品放在試管中，加入提取液12.5mL(甲醇水=7:3)。加塞振蕩3分鐘，過(guò)濾，濾紙采用新華1號(hào)紙。取lmL濾液用lmL蒸餾水或去離子水進(jìn)行稀釋，備用。取20pL包被有AFBrBSA發(fā)光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20pL的AFBi標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中；加20pL兔抗AFB,抗體；繼續(xù)加入2(HiL生物素化羊抗兔抗體，37'C孵育15分鐘；暗處加175pL包被有鏈霉親和素的感光微粒，37'C暗處孵育15分鐘后在光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上檢測(cè)光信號(hào)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的AFB,含量。結(jié)果見表2，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得該例樣品所含AFB廣濃度為0.17ng/mL。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1、一種黃曲霉毒素B1的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，黃曲霉毒素B1簡(jiǎn)稱AFB1，其特征是由白色不透明微孔板(1)，AFB1標(biāo)準(zhǔn)(2)，連接AFB1-BSA人工抗原的發(fā)光微粒(3)，兔抗AFB1的抗體凍干品(4)，生物素化羊抗兔抗體凍干品(5)和包被有鏈霉親和素的感光微粒(6)組成。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是連接AFBrBSA人工抗原的發(fā)光微粒(3)的制備在離心管中加入lmg發(fā)光微粒，加入12.5(iL質(zhì)量濃度1%的Tween-20，0.05mgAFB廣BSA人工抗原，10nL硼氫化氰鈉，用O.IM、pH6.0的2-(N-嗎啉)乙磺酸MES緩沖液將體積補(bǔ)充到200jiL，37°C避光振蕩反應(yīng)48小時(shí)；加入lO(iL0.3M、pH5.0的羧甲氧基胺半鹽酸鹽CMO溶液封閉未結(jié)合位點(diǎn)，37'C避光孵育1小時(shí)后離心，分離得到已連接AFB,-BSA的發(fā)光微粒，稀釋后備用。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是AFBi標(biāo)準(zhǔn)(3)，從AFB,純品中稀釋得到，稀釋液為甲醇水體積比3:7，AFB:標(biāo)準(zhǔn)共6瓶，AFBi濃度分別為0ng/mL，0.05ng/mL，0.5ng/mL，lng/mL，10ng/mL，100ng/mL。4、一種用權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測(cè)AFBi的方法，其特征是取包被有AFBrBSA人工抗原的發(fā)光微粒加入到白色不透明微孔板；加入AFB,標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中，然后各孔順序加入兔抗AFB〗抗體、生物素化羊抗兔抗體進(jìn)行標(biāo)記免疫反應(yīng)；接著暗處加入包被有鏈霉親和素的感光微粒進(jìn)行反應(yīng)后檢測(cè)光信號(hào)，以加入AFB^示準(zhǔn)的檢測(cè)數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以加入被測(cè)樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的AFBi含量。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)AFBi的方法，其特征是操作為取20pL包被有AFBrBSA人工抗原的發(fā)光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20pL的AFBJ示準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中；加20pL兔抗AFB,抗體；繼續(xù)加入20pL生物素化羊抗兔抗體，37"C孵育15分鐘；暗處加175pL包被有鏈霉親和素的感光微粒，37"C暗處孵育15分鐘后在光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上檢測(cè)光信號(hào)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的AFBi含量。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)AFBi的方法，其特征是樣品處理，玉米、谷物樣品處理將樣品粉碎至20目，取5克樣品放在試管中，加入提取液12.5mL，提取液為甲醇水體積比7:3，加塞振蕩3分鐘，過(guò)濾，濾紙采用新華1號(hào)紙，取lmL濾液用lmL蒸餾水或去離子水進(jìn)行稀釋，備用。全文摘要一種黃曲霉毒素B₁的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于光激化學(xué)發(fā)光免疫分析
技術(shù)領(lǐng)域：
。包被AFB₁-BSA發(fā)光微粒加入微孔板，順序加入AFB₁標(biāo)準(zhǔn)或樣品、兔抗AFB₁抗體和生物素化羊抗兔抗體避光反應(yīng)，避光加入包被有鏈霉親和素的感光微粒孵育后檢測(cè)。包被在發(fā)光微粒上AFB₁-BSA與標(biāo)準(zhǔn)或樣品中AFB₁競(jìng)爭(zhēng)連接到AFB₁抗體，與生物素化羊抗兔抗體及包被有鏈霉親和素的感光微粒形成復(fù)合體，在光激發(fā)下，通過(guò)單線態(tài)離子氧的產(chǎn)生和傳遞，將能量傳遞給發(fā)光微粒產(chǎn)生熒光，用光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)，光信號(hào)強(qiáng)度與樣品中AFB₁濃度成反比，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線確定被測(cè)樣品中AFB₁含量。本發(fā)明用于對(duì)糧食，飼料及其制品中AFB₁含量檢測(cè)，提供的試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便、廉價(jià)、檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高。文檔編號(hào)G01N33/543GK101393208SQ20081015549公開日2009年3月25日申請(qǐng)日期2008年10月7日優(yōu)先權(quán)日2008年10月7日發(fā)明者藝張,堅(jiān)金,雷高,飚黃申請(qǐng)人:江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所