專利名稱：一種同時分析氨基酸和有機酸代謝物譜的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及色譜分析技術(shù)，特別提供了一種通過毛細管電泳一質(zhì)譜聯(lián)用法 同時分析生物樣品中氨基酸和有機酸代謝物譜的方法。
背景技術(shù)：
氨基酸和有機酸是代謝組學(xué)研究中重要的代謝物，與糖、脂、蛋白質(zhì)和核 酸的代謝密切相關(guān)，研究表明人體內(nèi)氨基酸和有機酸的濃度變化與多種疾病有 密切關(guān)系。現(xiàn)有檢測氨基酸的方法主要是以離子交換色譜、高效液相色譜、氣 相色譜、毛細管電泳等為分離手段，以紫外或熒光檢測器為檢測方法，由于氨 基酸和有機酸大都紫外吸收較弱或無紫外吸收，不易氣化，因此用前述四種方 法時均需要衍生化步驟，操作繁瑣，分析時間長或靈敏度低，難以同時檢測常 見的幾十種氨基酸和有機酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述技術(shù)存在的不足，提供一種尿液中同時分析氨基酸和有機 酸代謝物譜的方法。本發(fā)明方法是將生物樣本經(jīng)常規(guī)沉蛋白處理后，采用毛細 管電泳為分離手段，檢測器選擇通用性強、靈敏度高的質(zhì)譜檢測器。本發(fā)明通 過以下步驟實現(xiàn)
(1) 樣品預(yù)處理
取樣品(尿液)200 pL，加入20 內(nèi)標液及400 甲醇，于旋渦混合 器上混合5 min， 12000 r/min離心10min，移取500 上清液，于離心濃縮儀 離心濃縮至干，殘渣加入200 |iL水溶解后，12000 r/min離心10min取上清液 進樣分析(用于標準曲線試驗的標準品溶液處理方式同樣品)。
標準品和內(nèi)標溶液制備分別取各氨基酸、有機酸標準品適量，精密稱定，
用水或含一定濃度氨水的水溶液溶解。作為標準品儲備溶液。低濃度的標準品 溶液通過用適量水稀釋儲備溶液得到。取適量鹽酸巴馬汀標準品，精密稱定， 用水溶解，作為內(nèi)標儲備液。
(2) 毛細管電泳一質(zhì)譜聯(lián)用法測定
A.毛細管電泳條件緩沖液含有3.0-6.0%甲酸和2.5-15%甲醇，分離 電壓為15-18kV，分離溫度為25。C，程序進樣50mbar壓力下進14。/。的濃氨水(v/v) 0-3秒后，再于50mbar壓力下進樣品溶液40秒，
B.質(zhì)譜條件SIM模式檢測，鞘液為含80-90%甲醇和0.05%甲酸的溶 液，流速為3 ^iL/min，霧化氣壓力為2 - 4 psig，干燥氣流速和溫度分別為7 - 8 L/min和250-275°C，毛細管電壓為4500V，各氨基酸、有機酸及內(nèi)標碎片電 壓均為10-70V。
本發(fā)明是一種不需要衍生化步驟，操作簡單，靈敏度高，選擇性好，普適 性強的能夠同時測定生物樣品中22種氨基酸和5種有機酸的分析方法。本發(fā) 明的方法具有良好的精密度(日內(nèi)4.96-14.93%，日間6.22-14.03%)和回 收率(高濃度83.62-111.41°/。，中濃度81.73-105.50%，低濃度80.17-110.94%), 檢測限為0.80- 2562 ng/mL。


圖1是22種氨基酸和5種有機酸標準品混合溶液的總離子流色譜圖 (TIC)。
圖2是22種氨基酸和5種有機酸標準品混合溶液的選擇離子色譜圖。 圖3是正常人尿液中氨基酸和有機酸代謝物譜分析的總離子流色譜圖 (TIC)。
圖4是正常人尿液中氨基酸和有機酸代謝物譜分析的選擇離子色譜圖。 圖5是乳腺癌病人尿液中氨基酸和有機酸代謝物譜分析的總離子流色譜圖 (TIC)。
圖6是乳腺癌病人尿液中氨基酸和有機酸代謝物譜分析的選擇離子色譜圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步的描述。 實施例1
樣品預(yù)處理取混合標準品溶液200 iliL，加入400iliL甲醇，于渦旋混合 器上混合2min， 12000 r/min離心10min，移取500 上清液，于離心濃縮儀 離心濃縮至干，殘渣加入200 fxL水充分溶解后，12000 r/min離心10min取上
清液進樣分析。
標準品和內(nèi)標溶液制備分別取各氨基酸、有機酸標準品約1.0-8.0mg， 精密稱定，用水或含一定1%濃度氨水的水溶液溶解，制成濃度分別為1.0 - 8.0 mg/mL的標準品儲備溶液。臨用前，用水稀釋成一系列濃度的標準品溶液。取 鹽酸巴馬汀標準品約1.0 mg，精密稱定，用水溶解，制成濃度為0.01 mg/mL的內(nèi)標溶液。
毛細管電泳條件緩沖液含有6.0°/。甲酸和6%甲醇，分離電壓為15kV， 分離溫度為25i:。進樣50mbar壓力下進樣品溶液40s。
質(zhì)譜條件SIM模式檢測，m/z值見表l;鞘液為含80%甲醇和0.05%甲 酸的溶液，流速為3pL/min;霧化氣壓力為4psig;干燥氣流速和溫度分別為 7 L/mki和275 °C;毛細管電壓為4500V;各氨基酸、有機酸及內(nèi)標碎片電壓 均為10。
表lSIM離子的m/z及其對應(yīng)的代謝物名稱
離子質(zhì)荷比 物質(zhì)名稱離子質(zhì)荷比物質(zhì)名稱
76甘氨酸135蘋果酸
90P-丙氨酸、丙氨酸147賴氨酸、谷氨酰胺
104卩-氨基異丁酸148谷氨酸
1053-羥基丁酸150甲硫氨酸
106絲氨酸156組氨酸
116輔氨酸166苯丙氨酸
118纈氨酸175精氨酸
119琥珀酸182酪氨酸
120蘇氨酸193檸檬酸
122半胱氨酸205色氨酸
132肌酸、亮氨酸、異亮氨酸241胱氨酸
133鳥氨酸352鹽酸巴馬汀(內(nèi)標)
134天冬氨酸
應(yīng)用毛細管電泳一質(zhì)譜法對22個氨基酸和5個有機酸進行分析，分析結(jié)
果參見附圖1和圖2。圖2中1:甘氨酸，2: |3-丙氨酸，3:丙氨酸，4: p-氨基異丁酸，5: 3-羥基丁酸，6:絲氨酸，7:輔氨酸，8:纈氨酸，9:琥珀 酸，10:蘇氨酸，11:半胱氨酸，12:肌酸，13:亮氨酸，14:鳥氨酸，15: 天冬氨酸，16:蘋果酸，17:賴氨酸，18:谷氨酰胺，19:谷氨酸，20:甲硫 氨酸，21:組氨酸，22:苯丙氨酸，23:精氨酸，24:酪氨酸，25:檸檬酸， 26:色氨酸，27:胱氨酸。
實施例2
樣品預(yù)處理取正常人尿液200 L，加入400 L甲醇，于渦旋混合器上混 合2 min， 12000 r/min離心10min，移取500 L上清液，于離心濃縮儀離心濃 縮至干，殘渣加入200L水充分溶解后，12000 r/min離心10min取上清液進樣 分析。
5毛細管電泳條件緩沖液含有4.0%甲酸和15%甲醇，分離電壓為15kV， 分離溫度為25。C。進樣50mbar壓力下進樣品溶液40s。 質(zhì)譜條件同實施例l。
應(yīng)用毛細管電泳一質(zhì)譜法對正常人尿液中氨基酸和有機酸進行分析，結(jié)果 參見附圖3和圖4。圖4中1:甘氨酸，2: P-丙氨酸，3:丙氨酸，4: P-氨基異丁酸，5: 3-羥基丁酸，6:絲氨酸，7:輔氨酸，8:纈氨酸，9:琥珀 酸，10:蘇氨酸，11:半胱氨酸，12:肌酸，13:亮氨酸，14:鳥氨酸，15: 天冬氨酸，17:賴氨酸，18:谷氨酰胺，19:谷氨酸，20:甲硫氨酸，21: 組氨酸，22:苯丙氨酸，23:精氨酸，24:酪氨酸，25:檸檬酸，26:色氨酸， 27:胱氨酸
實施例3
樣品預(yù)處理取乳腺癌病人尿液200 L，加入400 L甲醇，于渦旋混 合器上混合5min， 12000 r/min離心10min，移取500 L上清液，于離心濃 縮儀離心濃縮至干，殘渣加入200 L水充分溶解后，12000 r/min離心10min
取上清液進樣分析。
毛細管電泳條件緩沖液含有4.0°/。甲酸和2.5%甲醇，分離電壓為18kV, 分離溫度為25"C。進樣50 mbar壓力下進14°/。的濃氨水(v/v) 3 s后，再于 50 mbar壓力下進樣品溶液40 s。
質(zhì)譜條件SIM模式檢測，m/z值如表1所示；鞘液為含80%甲醇和0.05% 甲酸的溶液，流速為3 L/min;霧化氣壓力為2psig;干燥氣流速和溫度分別 為8L/min和250 °C;毛細管電壓為4500V;各氨基酸、有機酸及內(nèi)標碎片電 壓均為70。
應(yīng)用毛細管電泳 一 質(zhì)譜法對乳腺癌病人尿液中氨基酸和有機酸進行測定，
結(jié)果見附圖5和圖6。圖6中1:甘氨酸，2: |3-丙氨酸，3:丙氨酸，4:卩-氨基異丁酸，5: 3-羥基丁酸，6:絲氨酸，7:輔氨酸，8:纈氨酸，9:琥珀 酸，10:蘇氨酸，11:半胱氨酸，12:肌酸，13:亮氨酸，15:天冬氨酸，16: 蘋果酸，17:賴氨酸，18:谷氨酰胺，19:谷氨酸，20:甲硫氨酸，21:組氨 酸，22:苯丙氨酸，23:精氨酸，24:酪氨酸，25:檸檬酸，26:色氨酸，27: 胱氨酸。
權(quán)利要求
1. 一種尿液中同時分析氨基酸和有機酸代謝物譜的方法，其特征在于通過以下步驟實現(xiàn)(1)樣品預(yù)處理取樣品200μL，加入20μL內(nèi)標液及400μL甲醇，于旋渦混合器上混合5分鐘，高速離心10分鐘，移取500μL上清液，于離心濃縮儀離心濃縮至干，殘渣加入200μL水溶解后，高速離心10分鐘取上清液進樣分析；(2)毛細管電泳—質(zhì)譜聯(lián)用法測定A. 毛細管電泳條件緩沖液含有3.0-6.0％甲酸和2.5-15％甲醇，分離電壓為15-18kV，分離溫度為25℃，程序進樣50mbar壓力下進體積百分含量為14％的濃氨水0-3秒后，再于50mbar壓力下進樣品溶液40秒，B. 質(zhì)譜條件SIM模式檢測，鞘液為含80-90％甲醇和0.05％甲酸的溶液，流速為3μL/min，霧化氣壓力為2-4psig，干燥氣流速和溫度分別為7-8L/min和250-275℃，毛細管電壓為4500V，氨基酸、有機酸及內(nèi)標碎片電壓均為10-70V。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時分析尿液中氨基酸和有機酸代謝物譜 的方法，其特征在于步驟(1)所用內(nèi)標液的制備是取鹽酸巴馬汀標準品， 用水溶解，作為內(nèi)標液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時分析尿液中氨基酸和有機酸代謝物譜 的方法，其特征在于步驟(2) B中所述的是22種氨基酸和5種有機酸，分別是甘氨酸、絲氨酸、輔氨酸、纈氨酸、琥珀酸、蘇氨酸、半胱氨酸、蘋果酸、谷氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、檸檬酸、色氨酸、卩-丙氨酸、丙氨酸、卩-氨基異丁酸、3-羥基丁酸、賴氨酸、谷氨酰胺、肌酸、亮氨酸、異亮氨酸、鳥氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、鹽酸巴馬汀。
全文摘要
本發(fā)明提供一種尿液中同時分析氨基酸和有機酸代謝物譜的方法，是將生物樣本經(jīng)常規(guī)沉蛋白處理后，采用毛細管電泳為分離手段，檢測器選擇通用性強、靈敏度高的質(zhì)譜檢測器。本發(fā)明方法具有良好的精密度和回收率，是一種不需要衍生化步驟，操作簡單，靈敏度高，選擇性好，普適性強的能夠同時測定生物樣品中22種氨基酸和5種有機酸的分析方法。
文檔編號G01N33/48GK101430307SQ20081016316
公開日2009年5月13日 申請日期2008年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月18日
發(fā)明者劉昌孝, 朋 沈, 王書芳, 程翼宇, 青 邵 申請人:浙江大學(xué)