專利名稱：：一種血卵渦鞭蟲兔抗血清及其應用的制作方法一種血卵渦鞭蟲兔,清及其應用駄領域本發(fā)明涉及海產甲殼類動物寄生蟲檢測，具,及血卵渦鞭蟲的檢測。背景駄血卵渦鞭蟲(他鵬to必m'鵬)是一類危害海水甲殼動物的重要病原性寄生蟲，致病性強。可引起挪^M下(^加/re^ms)、蘭蟹(6:6Hw'ote)、白氏雪蟹(6:Z^'r必)、珠雪蟹(G等許多，經濟甲殼皿病，導致大規(guī)模死亡。包括澳大利亞、蘇格蘭、加拿大以及美國東部沿岸等地均有該寄生蟲流行J隨，由于該蟲體造成宿主死亡率高，嚴重危害著甲殼類動物的生產。血卵渦鞭蟲(說鵬to必/n'鵬sp.)是近年來危害浙江省三疣梭子蟹(尸orf朋^te2'z^e/rw73&)、鋸歸蟹(5by77aserratec)養(yǎng)殖的主要寄生性原生動觀該蟲體對宿主感染時間長，流行范圍廣、死亡率高，給梭子蟹、青蟹產業(yè)帶來巨±^圣濟損失[1]。許文軍等■國內首次在#||梭子蟹、#^直青蟹，繊日本縛(fflar/Mz^p,h)中發(fā)現該寄生蟲，經過系統研究，并與國夕W開究結果比^鑒定為^鵬to&w'咖印.，經過后續(xù)研究證實該寄生蟲為引^M梭子蟹大規(guī)m^E亡的重大疾病"牛奶病"的主要病原之一。感染血卵渦鞭蟲宿主后期表現為游泳足關節(jié)膜白濁，血淋巴呈濁白色或濁黃色，正常血細胞大量M^、，血淋巴中大部分為與血細胞大小形態(tài)近似的寄生蟲體，在普通顯^[鏡下可分辨出蟲體。但是在潛在感染或初期感染時，由于蟲體S^而且某些階段與海產蟹血細胞形態(tài)差異很小，普通顯微鏡下《^隹準確區(qū)分蟲體與正常血細胞，容易造成漏檢及誤檢。國夕卜學者檢測血卵渦鞭蟲主要采取以下幾種方法血淋巴吉姆薩、HE染色結合顯微鏡觀察，ELISA、western-blot、熒光抗體、PCR等。PCR檢測技術僅能定性研究，無法對寄生蟲形態(tài)以及存在形式進行說明，因此開展該寄生蟲的其他檢測技術研究尤為必要。國外有Field和Appleton對寄生于挪戯蟲下的一種^鵬to必/u'"sp.進行了間接熒光抗體的檢測方^5開究，但是其采用的免疫原為人工培養(yǎng)蟲體，抗體制備時剛艮長，而且僅進行了間接熒光抗體定性檢測研究。
發(fā)明內容為解決現有技術存在的上述問題和缺點，本發(fā)明的目的首先是^i乓一種血卵渦鞭蟲兔抗血清。由于血卵渦鞭蟲的體外培養(yǎng)較為困難，因此要取得純的血卵渦鞭蟲抗原具有較大的難度。針對感棘期的病蟹(如梭子蟹)血淋巴中幾乎很少有正常血細胞，其被大量血卵渦鞭蟲所取代這Hf點，本發(fā)明A^用這種"血淋巴"作為抗原制備了血卵渦鞭蟲多克隆血清抗體。本發(fā)明人,的技術方案是-一種血卵渦鞭蟲兔Ml清，采用下述方法制備(1)免疫原制備取患病后期含血卵渦鞭蟲的病蟹體液，離心處理，離心獲得的沉淀物經洗滌、固定處理后，再經洗滌、稀釋處理，得到每新洗滌液含3.6X10'3.6X109個蟲體的溶液，反復凍融得到蟲體懸液，備用；(2),鰂備取步驟(1)獲得的蟲體懸液免疫大白兔，免疫操作如下:首次免疫采用蟲體懸液與福氏完全佐劑等比例乳化均勻而成的乳劑，大白兔脊柱兩側皮下注射，然后按照一定免疫間隔時間，翻蟲體懸、柳n強免疫數次，最后一次免疫后，采血，收集血清，得到艦清。的方案是，J^E步驟(1)中離心處理為3000-4000r/min離心8-10min，洗滌處用pH為7.4的0.01M的磷M緩沖液(PBS)作為洗滌液，固定處理為37。C下用lM畐爾馬林溶液固定lh;步驟(2)中免疫劑量為1-2ml/只/次，免疫間隔時間為18-24天，免疫織3-4次。本發(fā)明上述方法中病蟹選用的是感ML卵渦鞭蟲后期的三疣梭子蟹、鋸蟹或曰本蠔等；大白^ffl的^ff西蘭大白兔(雄性，體重1.5-2.5kg)。本發(fā)明所述的血卵渦,兔Ml清，優(yōu)選的方案是，id^步驟(2)WL清制備為取步驟(O獲得的蟲體懸液免疫大白兔，免SiS行3次，操作如下:首次免麟用蟲體懸液與福氏完全佐劑等比例乳化均勻而成的享L劑，大白兔脊柱兩側皮下分6點艦，劑量lml/只；然后每隔21天后，細蟲體懸働卩強免疫2次，每次劑量lml/只；最后一次免疫14天后，從兔耳靜脈采血，收^JfiL清，得到ML清，加入其體積20%的甘油，于-70'C凍藏備用o本發(fā)明所述的血卵渦鞭蟲兔Mr清，優(yōu)選的方案是，所述步驟(2)中的蟲體懸液濃度為3.6X108個/ml，即每新洗滌液中含3.6X108個蟲體，以pH為7.4的0.01M的磷麟緩沖液(PBS)作為洗滌液。間接ELISA方法檢測結果顯示，id^制備的血卵渦鞭蟲兔艦清效價最高可達10240，其對應OD4^值為0,2596，P/N值為2.32，符合間接熒光抗,領,抗體效價的要求。本發(fā)明采用的從病蟹中抽取的"血淋巴"(即含血卵渦鞭蟲蟲體的體液)作為抗原制備了多克隆血清抗體，此抗體成分雖然大部分為血卵渦鞭蟲抗體，但是不可避免帶有小部分蟹源蛋白成分的抗體，因此本發(fā)明對戰(zhàn)獲得的兔^L清做了進一步的純化處理，以期獲得更好的特異性和更高的效價。本發(fā)明所述的血卵渦鞭蟲兔ifci&清，優(yōu)選的方案是，戶;ML卵渦鞭蟲的制備方法還包括(3)!ML清純化，即將，步驟(2)獲得的Ml清采用下述方法純化(a)取健康蟹血淋巴，用1%福爾馬林溶液固定后，于30004000r/min離心，棄去上清液，血細胞沉淀用含有1%小牛血清的pH為7.4的0.1M磷,緩沖^m懸(比如3次)，稀釋成一定濃度的懸、鵬4'C保存?zhèn)溆茫♂対舛瓤筛鶕A微來調整；(b)于4。C將步驟(a)獲得的懸液與步驟(2)制備的兔艦清混合，反/Sii程中不間斷混勻，反應時間1224h;(c)將步驟(b)獲得的懸液于30004000r/min離心810min，棄去沉淀物，收集上清液，得到純化后的兔WL清，力口入其#^20%的甘油，于-7(TC凍藏備用。其中，戰(zhàn)步驟(a)中健康蟹選自三疣梭子蟹、鋸歸蟹或日本蟧等；戰(zhàn)步驟(b)中的反應時間是12h。采用蟹血淋巴對兔1^^行充分吸附處理后，間接ELISA方法檢測結果顯示，經過吸附后的兔WL清抗體具有更高的特異性和效價，效價最高可達7680，其對應OD^值為0.3673，P/N值為2.26，f始間接熒光抗微測用抗體效價的要求。與未經純化處理的兔Ml清相比，其效價降低了，原因在于除去了部分可能存在的蟹源蛋白的兔抗體干擾。此外，發(fā)明Ailil微也魁正了純化處理后的兔WL清其特異性更高，而且效價也能滿足間接熒光抗微測用對抗體的要求，因此，本發(fā)明具體實施例中間接熒光抗微測方法中細的都是純化處a^的血卵渦鞭蟲兔sa清。本發(fā)明的另一個目的^3S^i乓了i^血卵渦鞭蟲兔tillfiL清在間接熒光抗體檢測方法上的應用。間接熒光抗懶測是一種操作簡單、時效性強的免疫快速檢測技術，可以對病原進行快速定性定量檢測，飽摘原形態(tài)標己上熒光，可非常彭見方便的實JW"血卵渦鞭蟲的準確檢測以及蟲軒同生活史時期的形態(tài)確定，可為血卵渦鞭蟲的防控以及生活史研究，鵬科學依據。本發(fā)明為實現發(fā)明目的提供的技術方案如下本發(fā)明戶腿的血卵渦鞭蟲兔m清在間接熒光抗Wt測方法上的應用，其中，戶脫間接熒光抗嫩則方法按如下操作6將適度稀釋的血卵渦鞭蟲兔餘清滴加至睏定待檢樣品的載玻片上，進行一抗孵育，洗滌，然后再滴加M稀釋的，氰酸熒光fH己羊抗兔抗,液，it，亍二抗孵育，洗滌，再繼片處理后鏡檢即可。本發(fā)明所述的應用，的方案是，間接熒光抗,測方法中所述的適度稀釋采用含1%牛血清白蛋白pH為7.4的0.01M的磷酸鹽緩沖液作為稀釋劑;洗》緣用含0.05%TVeen-20的pH為7.4的0.01M的磷酸鹽緩沖液作為洗滌液；血卵渦鞭蟲兔她清稀釋度為64320、熒光豐斜己羊抗兔抗^^液稀釋度為32160(視試劑質量調整)。更的方案是，，間接熒光抗,測方法中兔Wl清稀釋度為160，FITC-羊抗兔抗##釋度為100，濃度下進行反應，幾乎沒有非特異性熒光染色，蟲懶皮染上明亮熒光，背景呈黑色。吸收，及阻斷i，結果均呈現黑色背景，證明抗##異性較強。當兔抗血清抗懶釋度過低，熒光二抗稀釋度過低(如稀釋度為幼時容易出現非特異性熒光。本發(fā)明戶脫的應用，的方案是，戶腿的待檢樣品來自海水甲殼類動物，包括三疣梭子蟹、鋸蟹、脊尾白蟲下、海7jCMf或日本蟮的血淋巴，并將其預處理，戶腿的預處理為將血淋巴用1%福爾馬林溶液固定lh，然后3000r/min離心8min，用O.1MpH為7.4的磷麟緩沖體懸3次，備用。本發(fā)明所述的應用，的方案是，所述的間接熒光抗,測方法中封片采用甘油與0.5M碳麟緩沖液等比混賴U備的pH為9.6的緩沖液作為封片液;一抗孵育為37"免疫濕盒溫育lh;二抗孵育為37。C免疫濕盒溫育40min。艦的是，本發(fā)明微的間接熒光抗微測方法按以下步,行(A)載玻片處理與待檢樣品處理-新載玻片經鉻酸冼液浸泡，乙,泡，晾干后用熱的明膠甲醛溶液(35%甲醛2.5ffll，明膠0.5g，蒸餾水100mL)浸泡10min，烘干備用。從患病甲殼類動物體內抽取血淋巴，用1%福爾馬林溶液固定lh，3000r/min離心8min，PBS洗滌、M懸37飯得到待檢樣品。(B)間接熒艦微測過程將步驟(A)得到的待檢樣品滴加于載玻片上，均勻涂布成圓面，室溫晾干，55'C固定5min;固定處理后的待檢樣品滴加i^l制備的繊稀釋后的血卵渦鞭蟲兔i)tJfe清，37"免疫濕盒溫育，一抗孵育產物用洗滌液洗滌3^晾干;再滴加皿稀釋的熒光fei己羊抗兔抗體，37。C免疫濕盒溫育，二抗孵育產物用洗滌液洗滌3次后用pH為9.6的甘油碳,緩沖液做封片處理，得到玻片標本；最后將玻片標枯495咖縱光下做鏡檢。，間接熒光抗,測方法步驟(B)中以下參數所用血卵渦鞭蟲兔ML清稀釋度為160;熒光標記羊抗兔抗##釋度為100;待檢抗原點樣5ML，則滴加相應Jfofil清50lC，37。C免疫濕盒溫育lh;滴加熒光標記抗體30ML，37。C免疫濕盒溫育40min。戰(zhàn)間接熒光抗微測方法步驟(A)和步驟(B)中j頓的試劑為抗##釋液含0.5%的牛血清白蛋白pH為7.4的0.01M磷,緩沖液。洗滌液含0.05%Tween-20的PH為7.4的0.1M磷,緩沖液。封片液pH為9.6的甘油碳離緩沖液(是由0.5M碳酸鹽緩沖液與甘油按j材只比1:1混，備而得)。本發(fā)明間接熒光抗,測方法中，以福爾馬Wt液固定的血卵渦鞭蟲蟲體為標準陽性樣本、^Jt梭子蟹血細胞為陰性樣本，以待檢樣本熒光呈現清晰蟲體形態(tài)為陽性、無熒光或明顯比陽1W照顯色暗的樣本為陰性。利用本發(fā)明齒共的血卵渦鞭蟲兔iitlfiL清即間接熒光撤維測方法，可檢測到血卵渦鞭蟲營養(yǎng)體、腰鞭孢子及合孢體階段等不同生活階段的蟲體。本發(fā)明的優(yōu)點表現在檢測血卵渦鞭蟲的兔m清特異性強，靈驗高，檢測時間短，一般34h可出檢測結果；可用于血卵渦鞭蟲潛在感染以及糊感染的診斷，與PCR檢測技糊互補，可為血卵渦鞭蟲的流行監(jiān)控與防e^較為方便的技術保障。本發(fā)明檢測方'總作簡單，可以對海產甲殼類動物是否感卵渦鞭^4行批量定性定量檢測；可用于多種樣品的檢測，對海水甲殼類動物如三疣梭子蟹、鋸,蟹、脊尾白蟲下、海7JdMF、日本轉等均可檢測是否感卵渦鞭蟲，并且可以對血卵渦鞭蟲形態(tài)進行辨別，從而對研^L卵渦鞭蟲生活3t&其致病機理M^f究依據。因JW發(fā)明應用廣泛，適合水產動物疾病的流行病學調査與監(jiān)測。附圖簡要說明圖l敲CR檢測血卵渦鞭蟲結果，圖中M為DNAmarker,1-15分別對應表格1中1-15號樣品，16是陽'腕照；圖2是本發(fā)明間接熒光抗微測方法檢測三疣梭子蟹血淋巴中血卵渦鞭蟲檢測結果的圖片，圖2-A是在普通光源與熒光光MT的觀察結果(標尺二20um);圖2-B是熒光光源下的觀察結果(標尺:45um);圖3是本發(fā)明兔ifefl清間接熒艦微測血卵渦鞭蟲結果圖片(標尺=20um)，A.是陽fefiL淋巴在激發(fā)光下觀察結果；B.是陽性血淋巴普通光學顯微鏡下觀察結果；C.是陽1淋巴左光下和普通光下觀察結果；D.營養(yǎng)體階段、E.:||孢子階段、F.孢子體階段，三個不同生活階段血卵渦鞭蟲熒光抗微測結果，右上角顯示蟲條相差顯微下的形態(tài)，圖中箭頭a顯示帶熒光血卵渦鞭蟲營養(yǎng)體，箭頭b顯示梭子蟹血細胞。具體^fl^式下面結合實施例，更具體地說明本發(fā)明的內容。應當理解，本發(fā)明的實施并不局限于下面的實施例，對本發(fā)明所做的樹可形式上的變通和/或改變都將落A^發(fā)明保護范圍。本發(fā)明實施例,的間接熒光抗Wt測方法，是在純化處M的血卵渦鞭蟲兔^Jfil清基礎±^行的，其中1、載玻片處理與待檢樣品處理新載玻片經鉻酸洗液浸泡24h，乙Sim泡lh，晾干后用熱的明膠甲醛溶液(35%甲醛2.5ml,明膠0.5g，蒸餾7ja00raL)浸泡10min,55。C烘干備用。從患病甲殼類體內抽:淋巴，0.5%福爾馬林固定lh，PBS洗滌^m懸3次后，待檢。2、間接熒光抗皿測過程(1)待檢樣品5PL滴加于載玻片，均勻涂布成圓面，室溫晾干，55。C固定5rain。以血卵渦鞭蟲蟲體為陽性對照，,梭子蟹血細胞為陰'IW照。(2)滴加稀釋比例為1:160的海產甲殼類寄生她卵渦鞭蟲兔m清50ML，37'C免疫濕盒溫育lh，洗滌液洗滌3次。(3)滴力口稀釋比例為l:100的FITCl^i己羊抗兔抗體，37。C免疫濕織育40min，洗滌液洗滌3次后用甘油碳,緩沖,片，(4)熒艦微鏡495nm纖光下鏡檢。以f腿示清晰亮雜熒光蟲體為陽性，繊色黑暗背景為陰性。J^檢測過程中娜試劑為抗懶釋液含0.5%的牛血清白蛋白pH為7.4的0.01M磷離緩沖液。洗滌液含0.05%Tween-20的pH為7.4的0.1M磷M^緩沖液。封片液pH為9.6的甘油碳麟緩沖液(O.5M碳^緩沖液與甘油按^R比1:1混合制備而成)。以血卵渦鞭蟲蟲體為標準陽'IW照，健康梭子蟹血細胞為標準陰'IW照，待檢樣本熒光呈現清晰蟲體形態(tài)為陽性，無熒光或明顯比陽性對照顯色暗的樣本為陰性。試劑和儀器福氏完全佐劑購于Sigma公司；FITC-羊抗兔IgG、羊抗兔IgG購于武漢博士德生物公司；新西蘭大白兔(雄性，2kg)購于浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心；Mkon80i顯微鏡。鄉(xiāng)例H取浙江舟山桃碟l^直池處于患病末期的三疣梭子蟹微，3000r/min離心8min，棄上清液，將離心獲得的沉淀物用pH為7.4的0.1M的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三次，然后在37。C下用0.5站勺福爾馬林溶液固定lh，再用pH為7.4的0.1M的PBS洗滌3次，M3i顯微計數，用？83適當稀釋后獲得^*^洗滌液含3.6><107個蟲體的溶液，反復凍融4次，獲得蟲體懸液。然后用Jr^獲得的蟲體懸液免私新西蘭大白兔(雄性，體重2.0kg左右)。免疫分4次:第一次免疫用福氏完全佐劑與蟲體懸液等比例乳化均勻而成的乳劑，大白兔脊柱兩側皮下分6點注射，劑量lmL;第一次免疫間隔24天后，同法操作^ltlmL蟲體懸液加強免疫；第二次免疫間隔24天后，同，作再,lmL蟲體懸液再次加強免疫一次；第三次免疫間隔24天后，同賺作再鄉(xiāng)lmL蟲體懸液再^d3B強免疫一次；最后一次免疫14天后，從兔耳靜脈，收觸清，得到兔i)tlfiL清。用間接ELISA方法對獲得的tfDfiL離行效價測定，測得效價為7680。JfCJ&清中加入其體積2TO的甘油，-70。C凍藏備用。實施例1-2將實施例1-1獲得的^t!fiL清^a—步的純化處理，如下取健康梭子蟹血淋巴，經0.5呢福爾馬,液固定lh后，用含有0.5M小牛血清的pH為7.4的0.1M的PBS洗滌，用tt細胞懸液與實施例1-1獲得的兔M;清混合，4'C黑暗^I牛下反應，反應ii^呈中不間斷混勻，反應時間24h。獲得的溶液3000r/min離心8rain除去沉淀物即血淋巴，收ftJ:清液，得到純化后的兔m清。用間接ELISA方法對吸附處理后的兔皿清抗體再7，行效價測定，測得效價為2560。純化后的^tlfll清中加入其^IR20%的甘油，-70。C凍藏備用。實施例2-1取浙江舟山桃，^l池處于患病末期的三疣梭子蟹，，4000r/rain離心10min，棄上清液，將離心獲得的沉淀物用pH為7.4的0.1M的磷M^緩沖液(PBS)洗滌三次，然后在37。C下用0.5%的福爾馬林溶液固定lh，再用pH為7.4的0.1M的PBS洗滌3次，ilii顯微計數，用？83適當稀釋后獲得每新洗滌液含3.6乂108個蟲體的溶液，反復凍融4次，獲得蟲體懸液。然后用，獲得的蟲體懸液免疫新西蘭大白兔(雄性，體重1.5kg左右)。免疫分3次:第一次免疫用福氏完全佐劑與蟲體懸液等比例乳化均勻而成的乳劑，大白兔脊柱兩側皮下分6點激，劑量lmL;第一次免疫間隔21天后，同激作再艦lmL蟲體懸液加強免疫；第二次免疫間隔21天后，同、皿作再^flmL蟲體懸液再次加強免疫一次；最后一次免疫14天后，從兔耳靜脈，收^lfil清，獲得兔誠清。用間接ELISA方法對獲得的她清進行效價測定，觀幌效價為10240。ifefe清中加入其^lR2TO的甘油，-70。C凍藏備用。實施例2-2將實施例2-1獲得的兔激—步的純化處理，如下取,梭子蟹血淋巴，經0.5y。福爾馬，液固定lh后，用含有0.5W小牛血清的pH為7.4的0.1M的PBS洗滌，用ltbfl細胞懸液與實施例1-1獲得的兔m清混合，4。C黑暗條l牛下反應，反應過程中不間斷混勻，反應時間16h。獲得的溶液4000r7ndn離心10fflin除去沉淀物即血淋巴，收處清液，得到純化后的兔m清。用間接ELISA方法對吸附處理后的兔清抗體再次進行效價測定，測得效價為7680。純化后的ML清中力口入其^IR20%的甘油，-70。C凍藏備用。實施例3-l取浙江舟山桃花某^5I池處于患病末期的鋸,蟹術夜，4000r/min離心10mm，棄上清液，將離心獲得的沉淀物用pH為7.4的0.1M的磷麟緩沖液(PBS)洗滌三次，然后在37。C下用0.5%的福爾馬林溶液固定lh，再用pH為7.4的0.1M的PBS洗滌3次，iM顯微計數，適當稀釋后獲得#升洗滌液含3.6><109個蟲體的溶液，反復凍融4次，獲得蟲體懸液。然后用戰(zhàn)獲得的蟲體懸液免疾新西蘭大白兔灘性，體重2.Okg左右)。免疫分3次第一次免疫用福氏完全佐劑與蟲體懸液等比例乳化均勻而成的乳劑，大白兔脊柱兩側皮下分6點Slt,劑量2mL;第一次免疫間隔21天后，同法操作再^lt2mL蟲體懸液加強免疫；第二次免疫間隔21天后，同、總作再鄉(xiāng)2raL蟲體懸液再次加強免疫一次；最后一次免疫14天后，從兔耳靜脈，收^D&L清，得至晚ifDfiL清。用間接ELISA方法對獲得的i)lffc清進行效價測定，測得效價為5120。m清中加入其^R2TO的甘油，-7(TC凍藏備用。鄉(xiāng)例3-2將實施例3-1獲得的Mtik清^a—步的純化處理，如下-取健康鋸歸蟹血淋巴，經0.5%福爾馬林溶液固定lh后，用含有0.5%小牛血清的pH為7.4的0.1M的PBS洗滌，用ltt細胞懸液與實施例3-1獲得的兔抗血清混合，吸附處理反應過程中不間斷混勻，反應時間24h。獲得的溶液4000r/min離心10min，收^i:清液，得到純化后的兔m清。用間接ELISA方法對吸附處理后的兔m清抗體再次進行效價測定，測得效價為2560。純化后的^1清中加入其體積20%的甘油，-7(TC凍藏備用。鄉(xiāng)例4間接ELISA檢測實施例1-1實施例3-2獲得的兔m清效價，檢測結果見表1。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>從表1結果可以看出，戰(zhàn)實施例制備的兔她清完全符合間接熒光抗蹄領,抗體效價要求。鄉(xiāng)例5兔艦清抗體最佳稀釋度鵬及特異性微1、最佳抗鵬釋度鵬將實施例2-2制備的血清抗體按比例離1:64至lj1:1280，FITC-羊抗兔IgG稀釋1:32到1:256，對已知陽性樣本進行檢測，^^^驢,最佳的一抗、二抗稀釋比例。確定,的，卵渦鞭蟲兔ML清稀釋度為64320、^t氰,光新己羊抗兔抗，液稀釋度為32160。確定血卵渦鞭蟲血清抗,釋度160，FITC-羊抗兔IgG稀釋度100為最佳反應濃度。在最佳反應濃度下幾乎沒有非特異性熒光,，蟲^±明亮熒光，背景呈黑色。血清抗懶釋度過低，熒光二抗稀釋度過低(如稀釋度幼時容易出現非特異性熒光。2、抗鵬異性檢測以最佳抗^釋度進行阻斷實驗，吸收實驗。阻斷實驗即用羊抗兔IgG代替熒光纟gi己的羊抗兔IgG進行反應。吸收實驗，用過量血卵渦鞭蟲蟲皿原對抗體(實施例1-2、實施例2-2、實施例3-2的_清)進行吸附，然后用吸附過的抗體對陽性樣本進行檢測。吸收試驗及阻,驗結果均呈現黑色背景，證明抗##異性較強。實施例6用實施例2-2制備的艦清按如下方法對從某養(yǎng)殖塘劍她卵渦鞭蟲感染的脊尾白蝦和三疣梭子蟹進行間接熒光抗,測待檢梭子蟹5只，脊尾白蝦3尾，用無菌lmL、湖器抽取0.5^畐爾馬林0.5mL，然后從梭子蟹游泳足基部抽取0.5ml梭子蟹血淋巴，37。C固定lh;將脊尾白蟲下用酒精棉^m胸甲，用已抽取0.1mL0.59^葛爾馬林的注射器從心臟處抽取0.1mL血淋巴，混勻。樣品收集于1.5ml離心管中，37t:固定lh;同時取血卵渦鞭蟲蟲體陽性樣本，健康梭子蟹血淋巴進行同樣操作；4000r/rain離心10min，用pH7.4的磷麟緩沖液(PBS)重懸3次，最后一次',至IOOML。待檢樣品5PL滴加于載玻片，均勻涂布成lcm大小的圓面，室溫晾干，55。C固定5rain。每片載玻片點樣4個樣品。以血卵渦鞭蟲蟲體為陽性對照，MJi梭子蟹血細胞為陰'M"照。以pH7.4的PBS輕輕洗滌3次，甩干多余液體，稍晾干；針點樣點滴加稀釋比例為l:160的血卵渦鞭蟲兔m清50A，37"免疫濕盒溫育lh，洗滌液洗滌3次，甩去多余液體；每個點樣點滴加30uL稀釋比例為1:100的FITC標記羊抗兔抗體，37。C免疫ISlr溫育40min，洗滌液洗滌3次后，每個點樣點滴加甘油碳,緩沖液30ML左右，蓋Ji^玻片。于熒光顯微鏡熒光顯微鏡495nm激發(fā)光下鏡檢。以會溢示清晰亮綠色熒光蟲體為陽性，無顏色黑暗背景為陰性。結果顯示5個梭子蟹樣本中3個梭子蟹樣本發(fā)現被染成明亮黃綠色的血卵渦鞭蟲蟲體(檢測結果見圖2);3脊尾白蟲下樣本中沒有發(fā)現血卵渦鞭蟲感染。在NIK0N-80i熒光顯微鏡下40倍物鏡aS下對點樣區(qū)域的熒光蟲體進行計數。*樣品計數20個冬鵬，取平均值，得到一個禾JGK下帶熒光的蟲M5[量。NIKON-80i顯微鏡40倍下視野直徑為540m，而樣品涂布圓形區(qū),徑為lOOOMni。這樣樣品涂布面積約為M^面積的3.2倍。ililjJt換算絲可以算出原始樣品中感染蟲體的量。對于濃度較高的樣本需要進行稀釋，蟲體賴鈔的樣本需要進fiiM。3個感染血卵渦鞭蟲的梭子蟹樣品1、3、4中血卵渦鞭蟲濃度分別為3.4X105cells/mL、1.8X107cells/niL、8.2X104cells/mL。其中樣本3這種感染嚴重的樣本中蟲體計數需要進行適當稀釋后翻檢測計數。鄉(xiāng)7用實施例3-2制備的清按如下方法對疑似感染血卵渦鞭蟲的鋸歸蟹進行間接熒光抗條測待檢鋸歸蟹4只，用無菌lmL艦器抽取0.5呢福爾馬林0.3niL，然后從梭子蟹游泳足基部抽取0.2ml鋸t緒蟹血淋巴，37'C固定lh;同時取血卵渦鞭蟲蟲體，健康梭子蟹血細胞進行同樣操作；3000r/min離心10min，用pH7.4的磷l^:緩沖液(PBS)重懸3次，最后一次糨至200ML。待檢樣品5^滴加于載玻片，均勻涂布成圓面，室溫晾干，55'C固定5min。每片載玻片點樣4個樣品。以血卵渦鞭蟲蟲體為陽'IW照，健康梭子蟹血細胞為陰',照。以pH7.4的PBS輕輕洗滌3次，甩干多余液體，稍晾干；旨點樣點滴加稀釋比例為1:160的海產甲殼類寄生蟲血卵渦鞭蟲MCJfil清40ML，37。C免疫濕盒溫育lh，洗滌液洗滌3次，甩去多余液體；每個點樣點滴加稀釋比例為1:100的FITC標記羊抗兔抗體20ML，37。C免疫S^:溫育40min，洗滌液洗滌3次后，每個點樣點滴加甘油碳^緩沖液30ML左右，蓋上蓋玻片。于熒光顯微鏡熒艦微鏡495nm縱光下鏡檢。以能顯示清晰亮綠色熒光蟲體為陽性，無顏色黑暗背景為陰性。結果顯示4個鋸旨蟹樣本均感染血卵渦鞭蟲。鄉(xiāng)例8顯微鏡檢、PCR與IFAT檢測血卵渦鞭蟲結果比較用實施例2-2制備的:^lfiL清做IFAT，操作方法同實施例6。PCR按錄文獻w記載的方賺作。檢領鵬品18份，三種檢測方法檢測結果見表2，其中用顯微鏡直接檢觀,性率僅33.3%，而PCR及IFAT檢測結果則達到77.鄉(xiāng)。PCR檢領,品部分結果見圖1，陽性結果均出現不同亮度的586bp特異性條帶，陰性結果則不見特異性條帶。IFAT檢測結果見圖3:陽性血淋巴樣品均可觀察到黃綠色熒光蟲體，而蟹血細lfi^被^，在^495nm激發(fā)光和普通光照下，可以同時觀察到染上熒光的蟲體和蟹M米魏胞與透明細胞(圖3A、B、C);間接熒光抗體還檢測到了不同生活階段的血卵渦鞭蟲蟲體營養(yǎng)體、，鞭孢子、合孢體(圖3D、E、F)。敦顯微鏡檢、PCR和IFAT檢測血卵渦鞭蟲結果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注M代表普通光學顯微鏡鏡檢；"+"代表陽性，"—"代表陰性。參考文獻許文軍，徐漢祥，JeffShield等，海產甲殼麵卵渦鞭蟲病研鄉(xiāng)展[J]，中國水產禾斗學，2007,14(4:):695-702。許文軍，施慧，徐漢祥等，魏梭子蟹血卵渦鞭蟲感染的初步研究[J]，水生生物對艮，2007，31(5):27-32。許文軍，繩秀珍，徐漢祥等，血卵渦鞭蟲在^M鋸,蟹中的寄生[J]，中國海洋大學學報，2007，37(6):916-920。施慧，許文軍，李鵬飛等，應用PCR方法檢測患"黃水病"鋸歸蟹中的血卵渦鞭蟲[J]，海洋，2008,30(1):74-79。權利要求1、一種血卵渦鞭蟲兔抗血清，其特征在于，所述血卵渦鞭蟲兔抗血清采用下述方法制備(1)免疫原制備取患病后期含血卵渦鞭蟲的病蟹體液，離心處理，離心獲得的沉淀物經洗滌、固定處理后，再經洗滌、稀釋處理，得到每毫升洗滌液含3.6×107～3.6×109個蟲體的溶液，反復凍融得到蟲體懸液，備用；(2)抗血清制備取步驟(1)獲得的蟲體懸液免疫大白兔，免疫操作如下首次免疫采用蟲體懸液與福氏完全佐劑等比例乳化均勻而成的乳劑，大白兔脊柱兩側皮下注射，然后按照一定免疫間隔時間，采用蟲體懸液加強免疫數次，最后一次免疫后，采血，收集血清，得到抗血清。2、如權利要求1所述的血卵渦鞭蟲兔ML清，其特征在于，所述步驟(1)中離心處理為3000-4000r/min離心8-10min，洗滌處用pH為7.4的0.01M的磷,緩沖液作為洗滌液，固定處理為37T:下用1%福爾馬沐溶液固定lh;步驟(2)中免疫齊糧為1-2ml/只/次，免疫間隔時間為18-24天。3、如權利要求1戶艦的血卵渦鞭蟲兔iitlfiL清，其特征在于，戶步驟(2)MimiJ備為取步驟(1)獲得的蟲體懸液免疫大白兔，免鄉(xiāng)行3次，操作如下:首次免錢用蟲體懸液與福氏完全佐齊轉比例乳化均勻而成的乳劑，大白兔脊柱兩側皮下分6點激，劑量lml/只；然后每隔21天后，細蟲體懸液加強免疫2次，每次劑量lml/只；最后一次免疫14天后，，收觸清，得到艦清。4、如權利要求1或3戶皿的血卵渦鞭蟲兔ML清，，征在于，戶，步驟(2)中的蟲體懸液濃度為3.6Xlot/ml。5、如權利要求1所述的血卵渦鞭蟲兔ML清，其特征在于，所述方法還包括(3)抗血清純化，即將步驟(2)獲得的WL清采用下述方法純化(a)取健康蟹血淋巴，用1%福爾馬林溶液固定后，于30004000r/min離心，棄去上清液，血細胞沉淀用含有1%小牛血清的0.1M的磷,緩沖M懸，稀釋成一定濃度的懸液；(b)于4。C將步驟(a)獲得的懸液與步驟(2)制備的兔ML清混合，反M:程中不間斷混勻，反應時間1224h;(c)將步驟(b)獲得的懸液于30004000r/min離心810min，收*±清液，得到純化后的兔ML清。6、如權利要求5卵悉的血卵渦鞭蟲兔Ml清，其特征在于，戶，步驟(b)中反應時間為12h。7、權利要求1或3或5所述血卵渦鞭蟲兔^L清在間接熒光抗,測方法上的應用，其特征在于，戶;M間接熒光抗w^測方法按如下操作將適度稀釋的血卵渦鞭蟲兔ML清滴加到固定待檢樣品的載玻片上，進行一抗孵育，洗滌，然后再滴加，稀釋的異硫氰酸熒光標己羊抗兔抗,液，進行二抗孵育，洗滌，再纟5^寸片處理后鏡檢即可。8、如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的稀釋采用含0.5%牛血清白蛋白pH為7.4的0.01M的磷,緩沖液作為稀釋劑;洗滌采用含0.05%Tween-20的pH為7.4的0.01M的磷緩沖液作為洗滌液；血卵渦鞭蟲兔ifClfe清稀釋度為64320、異硫氰酸熒光標記羊抗兔抗,液稀釋度為32160。9、如權利要求7戶脫的應用，其特征在于，戶脫的待檢樣品來自海水甲殼類動物，包括三疣梭子蟹、鋸歸蟹、脊尾白蟲下、海水;i^下或日本轉的血淋巴并將其預處理，戶腿的預處理為將血淋巴用1%^爾馬林溶液固定lh，然后30004000r/min離心810min，用磷麟緩沖體懸3次后待檢。10、如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的間接熒光抗#^測方法中封片處麟用甘油與0.5M碳麟緩沖液等比混^f恪的pH為9.6的緩沖液作為封片液;一抗孵育為37。C免疫濕:i:ia育lh;二抗孵育為37。C免疫濕^^育40min。全文摘要本發(fā)明公開一種血卵渦鞭蟲兔抗血清，所述的血卵渦鞭蟲兔抗血清是以取自病蟹含血卵渦鞭蟲蟲體的體液為抗原，經處理后獲得免疫抗原即血卵渦鞭蟲蟲體懸液，然后對大白兔進行免疫獲得兔抗血清；本發(fā)明還公開了所述兔抗血清在間接熒光抗體檢測方法上的應用，所述的應用即將兔抗蟲血清滴加到待測樣品進行一抗孵育，然后再滴加異硫氰酸熒光標記羊抗兔抗體進行二抗孵育，經封片處理后做鏡檢；本發(fā)明檢測血卵渦鞭蟲的兔抗血清特異性強，靈敏度高，檢測時間短，可用于血卵渦鞭蟲潛在感染以及早期感染的診斷，本發(fā)明檢測方法操作簡單，可以對海產甲殼類動物是否感染血卵渦鞭蟲進行定性定量檢測。文檔編號G01N33/533GK101576559SQ20081016390公開日2009年11月11日申請日期2008年12月25日優(yōu)先權日2008年12月25日發(fā)明者靜張,慧施,許文軍,謝建軍申請人:浙江省海洋水產研究所