專利名稱：：咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法及其磷酸化方法。
背景技術(shù)：
：5-羥基-1-(3-D-呋喃核糖基-1H-咪唑-4-羧酰胺(4-carbamoyl-1-(3-D-ribofuranosylimidazolium畫5國olate，以下有日寸記作咪唑立賓(Mizoribine))在對腎移植的排斥反應(yīng)的抑制等方面的有效性得到認(rèn)可，是己有市售的免疫抑制劑(專利文獻(xiàn)1、2)。另外，對咪唑立賓進(jìn)行了各種機(jī)理的研究(非專利文獻(xiàn)1)。此外，作為現(xiàn)有的咪唑立賓的測定方法，已知有利用HPLC、LC/MS/MS的測定方法(非專利文獻(xiàn)2)。1—(3-D-呋喃核糖基-lH-l，2,4，-三氮唑-3-羧酰胺(l-(3-D-ribofuranosy1-lH-l，2,4-tri-azole-3-carboxamide，以下有時記作利巴韋林(Ribavirin))是己有市售的抗病毒藥，其與干擾素a合用時，能提高對慢性丙型肝炎等的治療效果。作為現(xiàn)有的利巴韋林的測定方法，已知有利用HPLC、LC/MS/MS的測定方法(非專利文獻(xiàn)3、4)。另外，后文中作為本件發(fā)明的第一酶的優(yōu)選實例舉出了來自泰國伯克霍爾德氏菌(Burkholderiathailandensis)的蛋白質(zhì)，作為該蛋白質(zhì)的信息，非專利文獻(xiàn)5中公開了可能是該蛋白質(zhì)的堿基序列、核糖激酶的內(nèi)容。專利文獻(xiàn)1:USP3888843專利文獻(xiàn)2:USP5442051非專利文獻(xiàn)1:Pediatr.Int.,44,196-198，2002年非專利文獻(xiàn)2:J.Chromato"222巻，156頁，1981年非專利文獻(xiàn)3:YehL.T.等，J.Chromatogr.Sci.,41巻，255頁，2003年非專利文獻(xiàn)4:YehL.T.等，J.Pharm.Biomed.Anal.,43巻，1057頁，2007年非專利文獻(xiàn)5:BMCGenomics6,174-187,2005年
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的課題是提供測定咪唑立賓和/或利巴韋林的簡單方法。為了解決上述課題，本發(fā)明人反復(fù)進(jìn)行了深入研究，結(jié)果新發(fā)現(xiàn)了可對將咪唑立賓和/或利巴韋林有效磷酸化的第一反應(yīng)進(jìn)行催化的第--酶，從而完成了咪唑立賓和/或利巴韋林的磷酸化方法。進(jìn)而完成了使用該第一酶的咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法。即，開發(fā)出了利用該第一酶和能夠催化第二反應(yīng)的第二酶的咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法及其測定用組合物，從而完成了本發(fā)明，所述第二反應(yīng)是與所述第一反應(yīng)不同的反應(yīng)，其不受咪唑立賓和利巴韋林這兩者抑制，但受上述第一反應(yīng)生成的磷酸咪唑立賓和磷酸利巴韋林這兩者抑制。艮l]，本發(fā)明涉及下述技術(shù)方案。咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法，其包括下述(l)工序(l)包括第一反應(yīng)的工序，在所述第一反應(yīng)中，在能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的第一酶的存在下，對試樣中可能含有的咪唑立賓和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化。如所述的咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法，其包括下述(l)、(2)和(3)各工序(1)包括第一反應(yīng)的工序，在所述第一反應(yīng)中，在能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的第一酶的存在下，對試樣中可能含有的咪唑立賓和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化；(2)抑制第二反應(yīng)的工序，其中，在能夠催化第二反應(yīng)的第二酶的存在下，進(jìn)行第二反應(yīng)時，使上述第一反應(yīng)生成的磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林與第二酶接觸，使第二反應(yīng)受到與該磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的存在量對應(yīng)的程度的抑制，所述第二反應(yīng)是與上述第一反應(yīng)不同的反應(yīng)，是下述<&><(:>中任意一個反應(yīng)，〈a〉不受咪唑立賓抑制，但受上述第一反應(yīng)生成的磷酸咪唑立賓抑制的反應(yīng)，〈b〉不受利巴韋林抑制，但受上述第一反應(yīng)生成的磷酸利巴韋林抑制的反應(yīng)，〈c〉不受咪唑立賓和利巴韋林這兩者抑制，但受上述第一反應(yīng)生成的磷酸咪唑立賓和磷酸利巴韋林這兩者抑制的反應(yīng)；(3)檢測第二反應(yīng)受抑制程度的工序。[1-1]如或[1]所述的咪挫立賓和/或利巴韋林的測定方法，其包括下述(l)、(2沐(3)中的各工序(1)包括第一反應(yīng)的工序，在所述第一反應(yīng)中，在能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的第一酶的存在下，對試樣中可能含有的咪唑立賓和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化；(2)抑制第二反應(yīng)的工序，其中，進(jìn)行第二反應(yīng)時，使上述第一反應(yīng)生成的磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林與第二酶接觸，使第二反應(yīng)受到與該磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的存在量對應(yīng)的程度的抑制，所述第二反應(yīng)是與第一反應(yīng)不同的反應(yīng)，其不受咪唑立賓和利巴韋林這兩者抑制，但受上述第一反應(yīng)生成的磷酸咪唑立賓和磷酸利巴韋林這兩者抑制；(3)檢測第二反應(yīng)受抑制程度的工序。如[1-1]所述的咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法，其中，上述的(2)工序如下(2)抑制第二反應(yīng)的工序，其中，在能夠催化第二反應(yīng)的第二酶的存在下，進(jìn)行第二反應(yīng)時，使上述第一反應(yīng)生成的磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林與第二酶接觸，使第二反應(yīng)受到與該磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的存在量對應(yīng)的程度的抑制，所述第二反應(yīng)是與上述第一反應(yīng)不同的反應(yīng)，是下述〈a〉〈c〉中任意一個反應(yīng)，〈a〉不受咪唑立賓抑制，但受上述第一反應(yīng)生成的磷酸咪唑立賓抑制的反應(yīng)，〈b〉不受利巴韋林抑制，但受上述第一反應(yīng)生成的磷酸利巴韋林抑制的反應(yīng)，<0不受咪唑立賓和利巴韋林這兩者抑制，但受上述第一反應(yīng)生成的磷酸咪唑立賓和磷酸利巴韋林這兩者抑制的反應(yīng)。如[O]、[1][1-1]任一項所述的測定方法，其中，第一酶是如下任意一種酶(1〕能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號1的氨基酸序列構(gòu)成；〔2〕能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一個或幾個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且該氨基酸序列含有序列表序列編號5的氨基酸序列和序列表序列編號6的氨基酸序列；或者〔3〕具有下述的<1〉<4>的理化性質(zhì)的酶，<1〉作用至少在磷酸供體存在下催化使咪唑立賓和/或利巴韋林成為磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的反應(yīng)；或者至少在磷酸供體存在下催化使咪唑立賓成為磷酸咪唑立賓的反應(yīng)或使利巴韋林成為磷酸利巴韋林的反應(yīng)中的至少任意一種反應(yīng)；〈2〉最適pHpH5.56.5;〈3〉pH穩(wěn)定性在37°C、3小時的條件下在pH610的范圍保持70%以上的活性；<4〉熱穩(wěn)定性在100mM磷酸鉀緩沖液的pH7.0的水溶液中，于5(TC進(jìn)行20分鐘的熱處理時，保持80%以上的活性。D畫3]如[O]、[1][1-2]任一項所述的測定方法，其中，第-—酶是能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號1的氨基酸序列構(gòu)成。如[O]、[1][1-3]任一項所述的測定方法，其中，第--酶是能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一個或幾個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且該氨基酸序列含有序列表序列編號5的氨基酸序列和序列表序列編號6的氨基酸序列。如[O]、[1][1-4]任一項所述的測定方法，其中，編碼第一酶的堿基序列是序列表序列編號2表示的堿基序列。如[O]、[1][1-5]任一項所述的測定方法，其中，第一酶是具有下述的<1><4〉的理化性質(zhì)的酶.-<1>作用至少在磷酸供體存在下催化使咪唑立賓和/或利巴韋林成為磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的反應(yīng)；或者，至少在磷酸供體存在下催化使咪唑立賓成為磷酸咪唑立賓的反應(yīng)或使利巴韋林成為磷酸利巴韋林的反應(yīng)中的至少任意一種反應(yīng)；<2>最適pHpH5.56.5;〈3〉pH穩(wěn)定性在37°C、3小時的條件下在pH610的范圍保持70%以上的活性；<4>熱穩(wěn)定性在lOOmM磷酸鉀緩沖液的pH7.0的水溶液中，于5(TC進(jìn)行20分鐘的熱處理時，保持80%以上的活性。如[1-6]所述的測定方法，其中，該磷酸供體是ATP。[1-8]如[O]、[1][1-7]任一項所述的測定方法，其中，第一酶來自伯克霍爾德氏菌(Burkholderia)屬。如[O]、[1][1-8]任一項所述的測定方法，其中，第-一酶來自泰國伯克霍爾德氏菌。如[O]、[1][1-9]任一項所述的測定方法，其中，第一酶來自泰國伯克霍爾德氏菌DSM13276株。如[O]、[1][1-10]任一項所述的測定方法，其中，第一酶通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法得到的分子量約為34kDa。如[O]、[1][1-11]任一項所述的測定方法，其中，第二酶是受磷酸咪唑立賓抑制、受磷酸利巴韋林抑制或者受磷酸咪唑立賓和磷酸利巴韋林這兩者抑制的酶。如[O]、[1][1-12]任一項所述的測定方法，其中，第二酶是受磷酸咪唑立賓和磷酸利巴韋林這兩者抑制的酶。如[O]、[1][1-13]任一項所述的測定方法，其中，第二酶是肌苷5'—磷酸脫氫酶。如[O]、[1][1-14]任一項所述的測定方法，其中，第二酶是如下任意一種酶《1》能夠?qū)≤?'—磷酸進(jìn)行氧化的酶，其由序列表序列編號7或序列表序列編號9的氨基酸序列構(gòu)成；《2》能夠?qū)≤?，一磷酸進(jìn)行氧化的酶，其由序列表序列編號7或序列表序列編號9的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一個或幾個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且該氨基酸序列含有序列表序列編號11的氨基酸序列和序列表序列編號12的氨基酸序列；或者《3》具有下述的〈i〉〈v〉的理化性質(zhì)的酶，<1>作用作用于NAD(P)類和肌苷5'—磷酸，催化生成NAD(P)H類和黃苷51一磷酸的反應(yīng)；〈ii〉最適pHpH89;〈iii〉pH穩(wěn)定性在37。C、3小時的條件下在pH611的范圍保持70。/。以上的活性；〈iv〉熱穩(wěn)定性在含有l(wèi)mMDTT的50mM磷酸鉀緩沖液pH7的水溶液中，于60°C進(jìn)行30分鐘的熱處理時，保持85%以上的活性；〈v〉抑制作用至少磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林抑制其作用。[1-16]如[O]、[1][1-15]任一項所述的測定方法，其中，第二酶是還具有下述的〈vi〉的理化性質(zhì)的酶〈vi〉分子量利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法得到的分子量為5254kDa。[1-17]如[O]、[1][1-16]任一項所述的測定方法，其中，第二酶是能夠?qū)≤?'—磷酸進(jìn)行氧化的酶，其由序列表序列編號7或序列表序列編號9的氮基酸序列構(gòu)成。如[O]、[1][1-17]任一項所述的測定方法，其中，第二酶是能夠?qū)≤?'—磷酸進(jìn)行氧化的酶，其由在序列表序列編號7或序列表序列編號9的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一個或幾個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，并且該氨基酸序列含有序列表序列編號11的氨基酸序列和序列表序列編號12的氨基酸序列。如[O]、[1][1-18]任一項所述的測定方法，其中，編碼第二酶的堿基序列是以序列表序列編號8或序列表序列編號10表示的堿基序列。如[O]、[1][1-19]任一項所述的測定方法，其中，第二酶是具有下述的〈i〉〈v〉的理化性質(zhì)的酶作用于NAD(P)類和肌苷5'—磷酸，催化生成NAD(P)H類和黃苷5'一磷酸的反應(yīng)；〈ii〉最適pHpH89;〈iii〉pH穩(wěn)定性在37。C、3小時的條件下在pH611的范圍保持70。/。以上的活性；〈iv〉熱穩(wěn)定性在含有l(wèi)mMDTT的50mM磷酸鉀緩沖液pH7的水溶液中，于60°C進(jìn)行30分鐘的熱處理時，.保持85%以上的活性；〈v〉抑制作用至少磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林抑制其作用。[1-21]如[O]、[1][1-20]任一項所述的測定方法，其中，第二酶是還具有下述的〈vi〉的理化性質(zhì)的酶〈vi〉分子量利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法得到的分子量為5254kDa。[1-22]如[O]、[1][1-21]任一項所述的測定方法，其中，第二酶來自芽孢桿菌(Bacillus)屬或海洋芽孢桿菌(Oceanobacillus)屬。如[O]、[1][1-22]任一項所述的測定方法，其中，第二酷來自枯草桿菌(Bacillussubtilis)或Oceanobacillusiheyensis。如[O]、[1][1-23]任一項所述的測定方法，其中，第二酶來自枯草桿菌ATCC23857株或OceanobadllusiheyensisDSM14731株。如[O]、[1][1-24]任一項所述的測定方法，其中，(1)工序是還含有磷酸供體的工序。如[O]、[1][1-25]任一項所述的測定方法，其中，(1)的工序是還含有金屬離子的工序。如[1-26]所述的測定方法，其中，該磷酸供體是ATP。如[1-27]所述的測定方法，其中，金屬離子是鎂離子、鈷離子、鎳離子和錳離子中的任意一種以上。如[O]、[1][1-28]任一項所述的測定方法，其中，(2)工序是還含有肌苷5'—磷酸的工序。如[O]、[1][1-29]任一項所述的測定方法，其中，(2)工序是還含有NAD(P)類的工序。如[O]、[1][1-30]任一項所述的測定方法，其中，該磷酸咪唑立賓和磷酸利巴韋林是單磷酸咪唑立賓和單磷酸利巴韋林。如[O]、[1][1-31]任一項所述的測定方法，其中，(3)工序中抑制程度的檢測是測定第二酶反應(yīng)速度的工序。如[O]、[1][1-32]任一項所述的測定方法，其中，(3)工序中抑制程度的檢測是測定NAD(P)類的變化量的工序。如[O]、[1][1-33]任一項所述的測定方法，其中，(3)工序中抑制程度的檢測是如下的工序?qū)ば?1)和(2)處理后的已知量的咪唑立賓和/或利巴韋林所引起的變化量和測定對象所引起的變化量進(jìn)行檢測并比較，從而對試樣中可能含有的咪唑立賓和/或利巴韋林進(jìn)行定量。[2]咪唑立賓的測定方法，其中，所述方法包括下述(l)、(2)和(3)各工序(1)包括第一反應(yīng)的工序，在所述第一反應(yīng)中，在能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶的存在下，對試樣中可能含有的咪唑立賓進(jìn)行磷酸化；(2)抑制第二反應(yīng)的工序，其中，在能夠催化該第二反應(yīng)的第二酶的存在下，進(jìn)行第二反應(yīng)時，使上述第一反應(yīng)生成的該磷酸咪唑立賓與第二酶接觸，使第二反應(yīng)受到與該磷酸咪唑立賓的存在量對應(yīng)的程度的抑制，所述第二反應(yīng)是與上述第一反應(yīng)不同的反應(yīng)，其不受咪唑立賓抑制，但受上述第一反應(yīng)生成的磷酸咪唑立賓抑制；和(3)檢測第二反應(yīng)受抑制程度的工序。如上述[2]所述的咪唑立賓的測定方法，其中，所述方法具有上述[O]、[1][1-34]中記載的至少任意一個特征。利巴韋林的測定方法，其中，所述方法包括下述(l)、(2)和(3)各工序(1)包括第一反應(yīng)的工序，在所述第一反應(yīng)中，在能夠?qū)晚f林進(jìn)行磷酸化的酶的存在下，對試樣中可能含有的利巴韋林進(jìn)行磷酸化；(2)抑制第二反應(yīng)的工序，其中，在能夠催化該第二反應(yīng)的第二酶的存在下，進(jìn)行第二反應(yīng)時，使上述第一反應(yīng)生成的該磷酸利巴韋林與第二酶接觸，使第二反應(yīng)受到與該磷酸利巴韋林的存在量對應(yīng)的程度的抑制，所述第二反應(yīng)是與上述第一反應(yīng)不同的反應(yīng)，其不受利巴韋林抑制，但受上述第一反應(yīng)生成的磷酸利巴韋林抑制；和(3)檢測第二反應(yīng)受抑制程度的工序。如上述[3]所述的利巴韋林的測定方法，其中，所述方法具有上述[O]、[1][1-34]中記載的至少任意一個特征。咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法，其包括下述(a)(c)中的各工序(a)包括反應(yīng)I的工序，在所述反應(yīng)I中，在下述〔1〕〔3〕中任意的酶和ATP的存在下，使試樣中可能含有的咪唑立賓和/或利巴韋林變成磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林和ADP;(1〕能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號1的氨基酸序列構(gòu)成，〔2〕能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一個或兩個以上的氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，并且該氨基酸序列含有序列表序列編號5的氨基酸序列和序列表序列編號6的氨基酸序列，〔3〕具有下述的<1〉<4〉的理化性質(zhì)的酶，<1>作用至少在ATP存在下，催化使咪唑立賓和/或利巴韋林變成磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林和ADP的反應(yīng)；或者，至少在ATP存在下，催化使咪唑立賓變成磷酸咪唑立賓的反應(yīng)或使利巴韋林變成磷酸利巴韋林的反應(yīng)中的至少任意一種反應(yīng)；<2〉最適pHpH5.56.5;〈3〉pH穩(wěn)定性在37。C、3小時的條件下在pH610的范圍保持70。/。以上的活性；<4〉熱穩(wěn)定性在100mM磷酸鉀緩沖液的pH7.0的水溶液中，于5(TC進(jìn)行20分鐘的熱處理時，保持80%以上的活性；(b)在催化與上述反應(yīng)I不同的反應(yīng)II或兩個以上的反應(yīng)II的酶B或兩個以上的酶B的存在下，使反應(yīng)II產(chǎn)生的測定對象對應(yīng)上述反應(yīng)I產(chǎn)生的ADP的量發(fā)生變化的工序；(c)檢測該測定對象的變化量，測定試樣中可能含有的咪唑立賓和/或利巴韋林的量的工序。如[4]所述的咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法，其中，該磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林是單磷酸咪唑立賓和/或單磷酸利巴韋林。如[4][4-1]任一項所述的咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法，其中，(a)工序中的所述酶是由序列表序列編號1所述的氨基酸序列構(gòu)成的酶。如[4][4-2]任一項所述的咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法，其中，(a)工序中的所述酶是由序列表序列編號1的氨基酸序列中缺失、取代或添加了--個或兩個以上氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的酶。如[4][4-3]任一項所述的咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法，其中，(a)工序中的所述酶是能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一個或兩個以上氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且該氨基酸序列含有序列表序列編號5的氨基酸序列和序列表序列編號6的氨基酸序列。如[4][4-4]任一項所述的咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法，其中，&)工序中的所述酶是具有下述的<1〉<4〉的理化性質(zhì)的酶<1〉作用至少在ATP存在下，催化使咪唑立賓和/或利巴韋林變成磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林和ADP的反應(yīng)；或者，至少在ATP存在下，催化使咪唑立賓變成磷酸咪唑立賓的反應(yīng)或使利巴韋林變成磷酸利巴韋林的反應(yīng)中的至少任意一種反應(yīng)；<2>最適pHpH5.56.5;<3>pH穩(wěn)定性在37°C、3小時的條件下在pH610的范圍保持70%以上的活性；<4〉熱穩(wěn)定性在100mM磷酸鉀緩沖液的pH7.0的水溶液中，于5(TC進(jìn)行20分鐘的熱處理時，保持80。/。以上的活性。如[4][4-5]任一項所述的咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法，其中，(a)工序中的所述酶來自泰國伯克霍爾德氏菌。如[4][4-6]任一項所述的咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法，其中，(a)工序中的所述酶來自泰國伯克霍爾德氏菌DSM13276株。如[4][4-7]任一項所述的咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法，其中，(a)工序中的所述酶至少利用鎂離子、鈷離子、鎳離子或錳離子。如[4][4-8]任一項所述的咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法，其中，(b)工序中包括(b-l)反應(yīng)和(b-"反應(yīng)，(b-l)反應(yīng)中，在ADP依賴性己糖激酶的存在下，使葡萄糖和ADP變成葡萄糖-6-磷酸和AMP;(b-2)反應(yīng)中，在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的存在下，使NAD(P)類和上述反應(yīng)生成的葡萄糖-6-磷酸變成NAD(P)H類和葡糖酸內(nèi)酯-6-磷酸；NAD(P)H類對應(yīng)上述反應(yīng)I生成的ADP的量增加，(c)工序是檢測NAD(P)H類的增加量的工序。如[4][4-9]任一項所述的咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法，其中，(b)工序中包括(b-l)反應(yīng)和(b-2)反應(yīng)，(b-l)反應(yīng)中，在丙酮酸激酶的存在下，使ADP和磷酸烯醇丙酮酸(本說明書有時記作PEP)變成ATP和丙酮酸；(b-2)反應(yīng)中，在乳酸脫氫酶的存在下，使NAD(P)H類和上述反應(yīng)生成的丙酮酸變成NAD(P)類和乳酸；NAD(P)H類對應(yīng)上述反應(yīng)I生成的ADP的量減少，(c)工序是檢測NAD(P)H類的減少量的工序。如[4][4-10]任一項所述的咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法，其中，(b)工序中包括(b-l)反應(yīng)和(b-2)反應(yīng)，(b-l)反應(yīng)中，在丙酮酸激酶的存在下，使ADP和PEP變成丙酮酸和ATP;(b-2)反應(yīng)中，在丙酮酸氧化酶的存在下，使氧、磷酸和上述反應(yīng)生成的丙酮酸變成過氧化氫和乙酰磷酸；過氧化氫對應(yīng)上述反應(yīng)I生成的ADP的量增加，(c)工序是用過氧化氫指示劑等檢測過氧化氫的量的工序。如[4][4-11]中任一項所述的咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法，其中，(c)工序中變化量的檢測是如下的工序?qū)ば?a)和(b)處理后的已知量的咪唑立賓和/或利巴韋林所引起的變化量和測定對象所引起的變化量進(jìn)行檢測并比較，從而對試樣中可能含有的咪唑立賓和/或利巴韋林進(jìn)行定量。如[4][4-12]中任意一項所述的咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法，其中，該酶利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法得到的分子量為約34kDa。咪唑立賓的測定方法，該方法包括下述(a)(c)各工序。(a)包括反應(yīng)I的工序，在所述反應(yīng)I中，在下述〔1〕〔3〕中任意的酶和ATP的存在下，使試樣中可能含有的咪唑立賓變成磷酸咪唑立賓和ADP;〔1〕能對咪唑立賓進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號1的氨基酸序列構(gòu)成，(2)能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶，其是由序列表序列編號1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一個或兩個以上氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且該氨基酸序列含有序列表序列編號5的氨基酸序列和序列表序列編號6的氨基酸序列，〔3〕具有下述的<1〉<4〉的理化性質(zhì)的酶，<1〉作用至少在ATP存在下，催化使咪唑立賓變成磷酸咪唑立賓和ADP的反應(yīng)；<2>最適pHpH5.56.5;〈3〉pH穩(wěn)定性在37°C、3小時的條件下在pH610的范圍保持70%以上的活性；<4〉熱穩(wěn)定性在100mM磷酸鉀緩沖液的pH7.0的水溶液中，于5(TC進(jìn)行20分鐘的熱處理時，保持80%以上的活性；(b)在催化與上述反應(yīng)I不同的反應(yīng)II或兩個以上的反應(yīng)II的酶B或兩個以上的酶B的存在下，使反應(yīng)II產(chǎn)生的測定對象對應(yīng)上述反應(yīng)I產(chǎn)生的ADP的量發(fā)生變化的工序；(C)檢測該測定對象的變化量，測定試樣中可能含有的咪唑立賓的量的工序。如上述[5]所述的測定方法，其中，所述方法具有上述[4][4-13]中記載的至少任意一項特征。利巴韋林的測定方法，該方法包括下述(a)(c)中的各工序。(a)包括反應(yīng)I的工序，在所述反應(yīng)I中，在下述〔1〕〔3〕中任意的酶和ATP的存在下，使試樣中可能含有的利巴韋林變成磷酸利巴韋林和ADP;〔1〕能夠?qū)晚f林進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號1的氨基酸序列構(gòu)成，〔2〕能夠?qū)晚f林進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號l的氨基酸序列中缺失、取代或者添加一個或兩個以上氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且該氨基酸序列含有序列表序列編號5的氨基酸序列和序列表序列編號6的氨基酸序列，(3〕具有下述的<1〉<4〉的理化性質(zhì)的酶，<1〉作用至少在ATP存在下，催化使利巴韋林變成磷酸利巴韋林和ADP的反應(yīng)；<2〉最適pHpH5.56.5;〈3〉pH穩(wěn)定性在37。C、3小時的條件下在pH610的范圍保持70。/。以上的活性；<4〉熱穩(wěn)定性在100mM磷酸鉀緩沖液的pH7.0的水溶液中，于5(TC進(jìn)行20分鐘的熱處理時，保持80%以上的活性；(b)在催化與上述反應(yīng)I不同的反應(yīng)II或兩個以上的反應(yīng)II的酶B或兩個以上的酶B的存在下，使反應(yīng)II產(chǎn)生的測定對象對應(yīng)上述反應(yīng)I產(chǎn)生的ADP的量發(fā)生變化的工序；(C)檢測該測定對象的變化量，測定試樣中可能含有的利巴韋林的量的工序。如上述[6]所述的測定方法，其中，所述方法具有上述[4]中記載的至少任意一項特征。咪唑立賓和/或利巴韋林的磷酸化方法，該方法使用下述〔1〕〔3〕中任意一種酶〔1〕能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號1的氨基酸序列構(gòu)成；〔2〕能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一個或幾個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且該氨基酸序列含有序列表序列編號5的氨基酸序列和序列表序列編號6的氨基酸序列；〔3〕具有下述的<1〉<4>的理化性質(zhì)的酶，<1〉作用至少在磷酸供體存在下催化使咪唑立賓和/或利巴韋林成為磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的反應(yīng)；或者，至少在磷酸供體存在下催化使咪唑立賓成為磷酸咪唑立賓的反應(yīng)或使利巴韋林成為磷酸利巴韋林的反應(yīng)中的至少任意一種反應(yīng)；<2〉最適pHpH5.56.5;〈3〉pH穩(wěn)定性在37。C、3小時的條件下在pH610的范圍保持70%以上的活性；<4〉熱穩(wěn)定性在100mM磷酸鉀緩沖液的pH7.0的水溶液中，于50。C進(jìn)行20分鐘的熱處理時，保持80%以上的活性。如[7]所述的磷酸化方法，其中，該磷酸供體是ATP。[7-2]如[7][7-1]任一項所述的磷酸化方法，其中，該磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林是單磷酸咪唑立賓和/或單磷酸利巴韋林。如[7][7-2]任一項所述的磷酸化方法，其中，能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法得到的分子量約為34kDa。如[7][7-3]任一項所述的磷酸化方法，其中，使用由序列表序列編號1中記載的氨基酸序列構(gòu)成的酶。如[7][7-4]任一項所述的磷酸化方法，其中，使用能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶，該酶由序列表序列編號1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一個或幾個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且該氨基酸序列含有序列表序列編號5的氨基酸序列和序列表序列編號6的氨基酸序列。如[7][7-5]任一項所述的磷酸化方法，其中，編碼該酶的堿基序列是以序列表序列編號2表示的堿基序列。如[7][7-6]任一項所述的磷酸化方法，其中，使用具有下述的<1〉<4〉的理化性質(zhì)的酶<1〉作用至少在磷酸供體存在下催化使咪唑立賓和/或利巴韋林成為磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的反應(yīng)；<2〉最適pHpH5.56.5;〈3〉pH穩(wěn)定性在37°C、3小時的條件下在pH610的范圍保持70%以上的活性；<4〉熱穩(wěn)走性在lOOmM磷酸鉀緩沖液的pH7.0的水溶液中，于5(TC進(jìn)行20分鐘的熱處理時，保持80%以上的活性。如[7-7]所述的磷酸化方法，其中，該磷酸供體是ATP。[7-9]如[7][7-8]任一項所述的磷酸化方法，其中，該酶利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法得到的分子量為約34kDa。如[7][7-9]任一項所述的磷酸化方法，其中，該酶來自伯克霍爾德氏菌屬。如[7][7-10]任一項所述的磷酸化方法，其中，該酶來自泰國伯克霍爾德氏菌。如[7][7-11]任一項所述的磷酸化方法，其中，該酶來自泰國伯克霍爾德氏菌DSM13276株。咪唑立賓的磷酸化方法，該方法使用下述(1〕〔3〕中任意一種酶〔1〕能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號1的氨基酸序列構(gòu)成；〔2〕能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一個或幾個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且該氨基酸序列含有序列表序列編號5的氨基酸序列和序列表序列編號6的氨基酸序列；〔3)具有下述的<1><4〉的理化性質(zhì)的酶，<1〉作用至少在磷酸供體存在下，催化使咪唑立賓變成磷酸咪唑立賓的反應(yīng)；<2>最適pHpH5.56.5;〈3〉pH穩(wěn)定性在37。C、3小時的條件下在pH610的范圍保持70。/。以上的活性；<4〉熱穩(wěn)定性在100mM磷酸鉀緩沖液的pH7.0的水溶液中，于5(TC進(jìn)行20分鐘的熱處理時，保持80%以上的活性。如上述[8]所述的咪唑立賓的磷酸化方法，其中，所述方法具有上述[7][7-12]記載的至少任意一項特征。利巴韋林的磷酸化方法，該方法使用下述(1〕〔3〕中任意一種酶〔1〕能夠?qū)晚f林進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號l的氨基酸序列構(gòu)成；〔2〕能夠?qū)晚f林進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一個或幾個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且該氨基酸序列含有序列表序列編號5的氨基酸序列和序列表序列編號6的氨基酸序列；〔3)具有下述的<1〉<4〉的理化性質(zhì)的酶，<1>作用至少在磷酸供體存在下，催化使利巴韋林變成磷酸利巴韋林的反應(yīng);<2〉最適pHpH5.56.5;〈3〉pH穩(wěn)定性在37°C、3小時的條件下在pH610的范圍保持70%以上的活性；<4〉熱穩(wěn)定性在lOOmM磷酸鉀緩沖液的pH7.0的水溶液中，于5(TC進(jìn)行20分鐘的熱處理時，保持80%以上的活性。如上述[9]所述的利巴韋林的磷酸化方法，其中，所述方法具有上述[7][7-12]中記載的至少任意一項特征。磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的制造方法，其中，使用下述〔1〕(3〕中任意一種酶，使咪唑立賓和/或利巴韋林變成磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林；〔1〕能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號1的氨基酸序列構(gòu)成；〔2〕能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一個或幾個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且該氨基酸序列含有序列表序列編號5的氨基酸序列和序列表序列編號6的氨基酸序列；〔3〕具有下述的<1〉<4〉的理化性質(zhì)的酶，<1〉作用至少在磷酸供體存在下催化使咪唑立賓和/或利巴韋林成為磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的反應(yīng)；或者，至少在磷酸供體存在下催化使咪唑立賓成為磷酸咪唑立賓的反應(yīng)或使利巴韋林成為磷酸利巴韋林的反應(yīng)中的至少任意一種反應(yīng)；<2〉最適pHpH5.56.5;<3〉pH穩(wěn)定性在37°C、3小時的條件下在pH610的范圍保持70%以上的活性；<4〉熱穩(wěn)定性在100mM磷酸鉀緩沖液的pH7.0的水溶液中，于50。C進(jìn)行20分鐘的熱處理時，保持80%以上的活性。如上述[10]所述的制造方法，其中，所述方法具有上述[7][7-12]記載的至少任意一項特征。磷酸咪唑立賓的制造方法，其中，使用下述〔1〕〔3〕中任意一種酶，使咪唑立賓變成磷酸咪唑立賓；〔1〕能對咪唑立賓進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號1的氨基酸序列構(gòu)成；(2〕能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一個或幾個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且該氨基酸序列含有序列表序列編號5的氨基酸序列和序列表序列編號6的氨基酸序列；〔3〕具有下述的<1〉<4>的理化性質(zhì)的酶，<1〉作用至少在磷酸供體存在下，催化使咪唑立賓變成磷酸咪唑立賓的反應(yīng)；〈2〉最適pHpH5.56.5;<3〉pH穩(wěn)定性在37。C、3小時的條件下在pH610的范圍保持70。/。以上的活性；<4〉熱穩(wěn)定性在100mM磷酸鉀緩沖液的pH7.0的水溶液中，于5(TC進(jìn)行20分鐘的熱處理時，保持80%以上的活性。如上述[11]所述的制造方法，其中，所述方法具有上述[7][7-12]記載的至少任意一項特征。[12]磷酸利巴韋林的制造方法，其中，使用下述〔1〕(3〕中任意一種酶，使利巴韋林變成磷酸利巴韋林；(1〕能夠?qū)晚f林進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號1的氨基酸序列構(gòu)成；〔2〕能夠?qū)晚f林進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號l的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一個或幾個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且該氨基酸序列含有序列表序列編號5的氨基酸序列和序列表序列編號6的氨基酸序列；(3〕具有下述的<1〉<4〉的理化性質(zhì)的酶，<1〉作用至少在磷酸供體存在下，催化使利巴韋林變成磷酸利巴韋林的反應(yīng)；<2〉最適pHpH5.56.5;〈3〉pH穩(wěn)定性在37°C、3小時的條件下在pH610的范圍保持70%以上的活性；<4〉熱穩(wěn)定性在100mM磷酸鉀緩沖液的pH7.0的水溶液中，于5(TC進(jìn)行20分鐘的熱處理時，保持80%以上的活性。如上述[12]所述的制造方法，其中，所述方法具有上述[7][7-12]記載的至少任意一項特征。[13]—種組合物，其含有下述成分(Al)第一酶，其能夠催化對咪唑立賓和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的第一反應(yīng)；(A2)磷酸供體；(A3)金屬離子；(A4-l)第二酶，其能夠催化第二反應(yīng)，所述第二反應(yīng)是與上述第一反應(yīng)不同的反應(yīng)，是下述〈a〉〈c〉中任意一個反應(yīng)，〈a〉不受咪唑立賓抑制，但受上述第一反應(yīng)生成的磷酸咪唑立賓抑制的反應(yīng)，<1)〉不受利巴韋林抑制，但受上述第一反應(yīng)生成的磷酸利巴韋林抑制的反應(yīng)，〈C〉不受咪唑立賓和利巴韋林這兩者抑制，但受上述第一反應(yīng)生成的磷酸咪唑立賓和磷酸利巴韋林這兩者抑制的反應(yīng)；(A4-2)肌苷5'—磷酸；以及(A4-3)NAD(P)類。[13-0-1]如[13]所述的組合物，其中，其用于咪唑立賓和/或利巴韋林的測定。咪唑立賓和/或利巴韋林測定用組合物，其含有下述的(A)和(B):(A)第1試劑，其至少含有下述(A1)(A4):(Al)有效量的第一酶，其能夠催化對咪唑立賓和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的第一反應(yīng)；(A2)磷酸供體；(A3)金屬離子；(A4)有效量的第二酶、肌苷5，一磷酸和NAD(P)類中任意一個或兩個成分，所述第二酶催化與第一反應(yīng)不同的反應(yīng)，其受磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林抑制；(B)第2試劑，其至少含有有效量的受磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林抑制的第二酶、肌苷5'—磷酸以及NAD(P)類之中第1試劑中不含的成分。如[13]所述的組合物，其是含有下述成分的咪唑立賓測定用組合物(Al)第一酶，其能夠催化對咪唑立賓進(jìn)行磷酸化的第一反應(yīng)；(A2)磷酸供體；(A3)金屬離子；(A4-l)第二酶，其催化與上述第一反應(yīng)不同的第二反應(yīng)，其不受咪唑立賓抑制，但受磷酸咪唑立賓抑制；(A4-2)肌苷5'—磷酸；以及(A4-3)NAD(P)類。[13-0-4]如[13]所述的組合物，其是含有下述成分的利巴韋林測定用組合物(Al)第一酶，其能夠催化對利巴韋林進(jìn)行磷酸化的第一反應(yīng)；(A2)磷酸供體；(A3)金屬離子；(A4-l)第二酶，其催化與上述第一反應(yīng)不同的第二反應(yīng)，其不受利巴韋林抑制，但受磷酸利巴韋林抑制；(A4-2)肌苷5'—磷酸；以及(A4-3)NAD(P)類。[13-0-5]如[13]所述的組合物，其是含有下述成分的磷酸咪唑立賓測定用組合物(A4-l)第二酶，其催化與上述第一反應(yīng)不同的第二反應(yīng)，受磷酸咪唑立賓抑制；(A4-2)肌苷5'—磷酸；以及(A4-3)NAD(P)類。[13-0-6]如[13]所述的組合物，其是含有下述成分的磷酸利巴韋林測定用組合物(A4-l)第二酶，其催化與上述第一反應(yīng)不同的第二反應(yīng)，受磷酸利巴韋林抑制；(A肛2)肌苷5'—磷酸；以及(A4-3)NAD(P)類。[13-0-7]如[13][13-0-6]任一項所述的組合物，其中，在該測定用組合物中，下述3種成分之中任意一種以上是在即將測定前加入的(A4-l)第二酶；(A4-2)肌苷5'—磷酸；以及(A4-3)NAD(P)類。[13-1]如[13]所述的組合物，其中，該磷酸供體是ATP。[13-2]如[13][13-1]所述的組合物，其中，金屬離子是鎂離子、鈷離子、鎳離子和錳離子之中的任意一個以上。咪唑立賓和/或利巴韋林測定用組合物，其含有下述的(A)和(B):(A)第1試劑，其至少含有下述(A1)(A4):(Al)有效量的第一酶，其可對咪唑立賓和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化；(A2)磷酸供體；(A3)金屬離子；(A4)有效量的第二酶、以及NAD(P)類，所述第二酶受磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林抑制；(B)第2試劑，其至少含有有效量的肌苷5'—磷酸。如[13-3]所述的組合物，其中，該磷酸供體是ATP。[13-5]如[13-3][13-4]中任一項所述的組合物，其中，金屬離子是鎂離子、鈷離子、鎳離子和錳離子之中的任意一個以上。如[13][13-5]任一項所述的組合物，其進(jìn)一步含有下述(C):(C)標(biāo)準(zhǔn)試劑，其至少含有已知量的咪唑立賓和/或利巴韋林。[13-7]如[13][13-6]任一項所述的組合物，其中，第一酶是下述酶中的任意一種酶〔1〕由序列表序列編號1的氨基酸序列構(gòu)成的酶；〔2〕由序列表序列編號1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一個或幾個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的酶，該氨基酸序列含有序列表序列編號5的氨基酸序列和序列表序列編號6的氨基酸序列；或者(3〕具有下述的<1〉<4〉的理化性質(zhì)的酶，<1〉作用至少在磷酸供體存在下催化使咪唑立賓和/或利巴韋林成為磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的反應(yīng)；或者，至少在磷酸供體存在下催化使咪唑立賓成為磷酸咪唑立賓的反應(yīng)或使利巴韋林成為磷酸利巴韋林的反應(yīng)中的至少任意一種反應(yīng)；<2>最適pHpH5.56.5;〈3〉pH穩(wěn)定性在37°C、3小時的條件下在pH610的范圍保持70%以上的活性；<4>熱穩(wěn)定性在lOOmM磷酸鉀緩沖液的pH7.0的水溶液中，于50。C進(jìn)行20分鐘的熱處理時，保持80%以上的活性。如[13][13-7]任一項所述的組合物，其中，第一酶是由序列表序列編號1的氨基酸序列構(gòu)成的酶。如[13][13-8]任一項所述的組合物，其中，第一酶是由序列表序列編號1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一個或幾個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的酶，該氨基酸序列含有序列表序列編號5的氨基酸序列和序列表序列編號6的氨基酸序列。如[13][13-9]任一項所述的組合物，其中，編碼第一酶的堿基序列是序列表序列編號2表示的堿基序列。如[13][13-10]任一項所述的組合物，其中，第--酶是具有下述的<1〉<4〉的理化性質(zhì)的酶<1>作用至少在磷酸供體存在下催化使咪唑立賓和/或利巴韋林成為磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的反應(yīng)；或者，至少在磷酸供體存在下催化使咪唑立賓成為磷酸咪唑立賓的反應(yīng)或使利巴韋林成為磷酸利巴韋林的反應(yīng)中的至少任意一種反應(yīng)；<2>最適pHpH5.56,5;〈3〉pH穩(wěn)定性在37°C、3小時的條件下在pH610的范圍保持70%以上的活性；<4>熱穩(wěn)定性在100mM磷酸鉀緩沖液的pH7.0的水溶液中，于5CTC進(jìn)行20分鐘的熱處理時，保持80%以上的活性。[13-12]如[13-11]所述的組合物，其中，該磷酸供體是ATP。如[13-11][13-12]任一項所述的組合物，其中，該磷酸咪唑立賓和磷酸利巴韋林是單磷酸咪唑立賓和單磷酸利巴韋林。如[13][13-13]任一項所述的組合物，其中，第一酶來自伯克霍爾德氏菌屬。如[13][13-14]任一項所述的組合物，其中，第一酶來自泰國伯克霍爾德氏菌。如[13][13-15]任一項所述的組合物，其中，第一酶來自泰國伯克霍爾德氏菌DSM13276株。如[13][13-16]任一項所述的組合物，其中，第二酶是受磷酸咪唑立賓抑制、受磷酸利巴韋林抑制或者受磷酸咪唑立賓和磷酸利巴韋林這兩者抑制的酶。如[13][13-17]任一項所述的組合物，其中，第二酶是受磷酸咪唑立賓和磷酸利巴韋林這兩者抑制的酶。如[13][13-18]任一項所述的組合物，其中，第二酶是肌苷5'—磷酸脫氫酶。如[13][13-19]任一項所述的組合物，其中，第二酶是如下任意一種酶《1》能夠?qū)≤?'—磷酸進(jìn)行氧化的酶，其由序列表序列編號7或序列表序列編號9的氨基酸序列構(gòu)成；《2》能夠?qū)≤?'—磷酸進(jìn)行氧化的酶，其由序列表序列編號7或序列表序列編號9的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一個或幾個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且該氨基酸序列含有序列表序列編號11的氨基酸序列和序列表序列編號12的氨基酸序列或者《3》具有下述的<1><^〉的理化性質(zhì)的酶，〈i〉作用作用于NAD(P)類和肌苷5，一磷酸，催化生成NAD(P)H類和黃苷5'一磷酸的反應(yīng)；〈ii〉最適pH32pH89;〈iii〉pH穩(wěn)定性在37。C、3小時的條件下在pH611的范圍保持70%以上的活性；〈iv〉熱穩(wěn)定性在含有l(wèi)mMDTT的50mM磷酸鉀緩沖液pH7的水溶液中，于60°C進(jìn)行30分鐘的熱處理時，保持85%以上的活性；〈v〉抑制作用至少磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林抑制其作用。[13-21]如[13][13-20]任一項所述的組合物，其中，第二酶是還具有下述的〈vi〉的理化性質(zhì)的酶〈vi〉分子量利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法得到的分子量為5254kDa。[13-22]如[13][13-21]任一項所述的組合物，其中，第二酶是能夠?qū)≤?，一磷酸進(jìn)行氧化的酶，其由序列表序列編號7或序列表序列編號9的氨基酸序列構(gòu)成。如[13][13-22]任一項所述的組合物，其中，第二酶是能夠?qū)≤?，一磷酸進(jìn)行氧化的酶，其由在序列表序列編號7或序列表序列編號9的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一個或幾個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，并且該氨基酸序列含有序列表序列編號11的氨基酸序列和序列表序列編號12的氨基酸序列。如[13][13-23]任一項所述的組合物，其中，編碼第二酶的堿基序列是以序列表序列編號8或序列表序列編號10表示的堿基序列。如[13][13-24]任一項所述的組合物，其中，第二酶是具有下述的〈i〉〈v〉的理化性質(zhì)的酶〈i〉作用作用于NAD(P)類和肌苷5'—磷酸，催化生成NAD(P)H類和黃苷5'一磷酸的反應(yīng)；O最適pHpH89;〈iii〉pH穩(wěn)定性在37t:、3小時的條件下在pH611的范圍保持70%以上的活性；〈iv〉熱穩(wěn)定性在含有l(wèi)mMDTT的50mM磷酸鉀緩沖液pH7的水溶液中，于60°C進(jìn)行30分鐘的熱處理時，保持85%以上的活性；〈v〉抑制作用至少磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林抑制其作用。[13-26]如[13][13-25]任一項所述的組合物，其中，第二酶是還具有下述的<vi〉的理化性質(zhì)的酶〈vi〉分子量禾U用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法得到的分子量為5254kDa。如[13][13-26]任一項所述的組合物，其中，第二酶來自芽孢桿菌屬或海洋芽孢桿菌屬。如[13][13-27]任一項所述的組合物，其中，第二酶來自枯草桿菌或Oceanobacillusiheyensis。如[13][13-28]任一項所述的組合物，其中，第二酶來自枯草桿菌ATCC23857株或OceanobacillusiheyensisDSM14731株。酶的制造方法，其是以下〔1〕〔3〕中任意一種酶的制造方法，所述方法包括根據(jù)編碼該酶的堿基序列形成該酶的工序和獲得該酶的工序；〔1〕能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號1的氨基酸序列構(gòu)成〔2〕能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一個或兩個以上氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，并且該氨基酸序列含有序列表序列編號5的氨基酸序列和序列表序列編號6的氨基酸序列；〔3〕具有下述的<1〉<4〉的理化性質(zhì)的酶，<1>作用至少在磷酸供體存在下催化使咪唑立賓和/或利巴韋林成為磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的反應(yīng)；或者，至少在磷酸供體存在下催化使咪唑立賓成為磷酸咪唑立賓的反應(yīng)或使利巴韋林成為磷酸利巴韋林的反應(yīng)中的至少任意一種反應(yīng)；<2>最適pHpH5.56.5;〈3〉pH穩(wěn)定性在37°C、3小時的條件下在pH610的范圍保持70%以上的活性；<4>熱穩(wěn)定性在100mM磷酸鉀緩沖液的pH7.0的水溶液中，于5(TC進(jìn)行20分鐘的熱處理時，保持80%以上的活性。如[14]所述的制造方法，其中，形成該酶的工序包括使用含有編碼該酶的堿基序列的細(xì)胞的步驟。如[14][14-1]任一項所述的制造方法，其中，形成該酶的工序包括使用導(dǎo)入有編碼該酶的堿基序列的轉(zhuǎn)化體的步驟。如[14][14-2]任一項所述的制造方法，其中，形成該酶的工序包括使用具有編碼該酶的堿基序列的微生物的步驟。如[14][14-3]任一項所述的制造方法，其中，形成該酶的工序包括使用屬于伯克霍爾德氏菌屬的微生物的步驟，所述微生物產(chǎn)生能夠催化使咪唑立賓和/或利巴韋林變成磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的反應(yīng)的酶。如[14][15]任一項所述的制造方法，其中，形成該酶的工序包括使用泰國伯克霍爾德氏菌的步驟。如[14][15-1]任一項所述的制造方法，其中，形成該酶的工序包括使用泰國伯克霍爾德氏菌DSM13276株的步驟。如[14][15-2]任一項所述的制造方法，其中，該酶是能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號1的氨基酸序列構(gòu)成。如[14][16]任一項所述的制造方法，其中，該酶是能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一個或兩個以上氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成。如[14][16-1]任一項所述的制造方法，其中，該酶是能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶，其由序列表序列編號1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一個或兩個以上氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，并且該氨基酸序列含有序列表序列編號5的氨基酸序列和序列表序列編號6的氨基酸序列。如[14][16-2]任一項所述的制造方法，其中，獲得在根據(jù)編碼該酶的堿基序列形成該酶的工序中所形成的該酶時，進(jìn)一步包括精制后獲得酶的工序。如[14][n]任一項所述的制造方法，其中，形成該酶的工序包括使用含有編碼該酶的堿基序列的細(xì)胞的步驟。如[14][17-1]任一項所述的制造方法，其中，形成該酶的工序包括使用導(dǎo)入有編碼該酶的堿基序列的轉(zhuǎn)化體的步驟。如[14][17-2]任一項所述的制造方法，其中，編碼該酶的堿基序列是序列表序列編號2表示的堿基序列。如[14][18]任一項所述的制造方法，其中，該酶是具有下述的<1><4>的理化性質(zhì)的酶<1〉作用至少在磷酸供體存在下催化使咪唑立賓和/或利巴韋林成為磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的反應(yīng)；或者，至少在磷酸供體存在下催化使咪唑立賓成為磷酸咪唑立賓的反應(yīng)或使利巴韋林成為磷酸利巴韋林的反應(yīng)中的至少任意一種反應(yīng)；<2〉最適pHpH5.56.5;〈3〉pH穩(wěn)定性在37°C、3小時的條件下在pH610的范圍保持70%以上的活性；<4>熱穩(wěn)定性在lOOmM磷酸鉀緩沖液的pH7.0的水溶液中，于5(TC進(jìn)行20分鐘的熱處理時，保持80%以上的活性。如[19]所述的制造方法，其中，該磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林是單磷酸咪唑立賓和/或單磷酸利巴韋林。如[19][19-1]任一項所述的制造方法，其中，該磷酸供體是ATP。如[14][19-2]任一項所述的制造方法，其中，該酶利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法得到的分子量為約34kDa。—種酶制造方法，其是以下的《1》《3》中任意一種酶的制造方法，所述方法包括根據(jù)編碼該酶的堿基序列形成該酶的工序和獲得該酶的工序；《1》能夠?qū)≤?'—磷酸進(jìn)行氧化的酶，其由序列表序列編號9的氨基酸序列構(gòu)成；《2》能夠?qū)≤?'—磷酸進(jìn)行氧化的酶，其由序列表序列編號9的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一個或兩個以上氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且該氨基酸序列含有序列表序列編號11的氨基酸序列和序列表序列編號12的氨基酸序列；《3》具有下述的〈i〉〈v〉的理化性質(zhì)的酶，<1>作用作用于NAD(P)類和肌苷5'—磷酸，催化生成NAD(P)H類和黃苷5'一磷酸的反應(yīng)；<廿>最適pHpH89;〈iii〉pH穩(wěn)定性在37°C、3小時的條件下在pH611的范圍保持70%以上的活性；〈iv〉熱穩(wěn)定性在含有l(wèi)mMDTT的50mM磷酸鉀緩沖液pH7的水溶液中，于60°C進(jìn)行30分鐘的熱處理時，保持85%以上的活性；〈v〉抑制作用至少磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林抑制其作用。如[20]所述的制造方法，其中，《3》中限定的酶是還具有下述的〈vi〉的理化性質(zhì)的酶〈vi〉分子量利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法得到的分子量為5254kDa。如[20][20-1]任一項所述的制造方法，其中，形成該酶的工序包括使用含有編碼該酶的堿基序列的細(xì)胞的步驟。如[20][20-2]任一項所述的制造方法，其中，形成該酶的工序包括使用導(dǎo)入有編碼該酶的堿基序列的轉(zhuǎn)化體的步驟。如[20][20-3]任一項所述的制造方法，其中，形成該酶的工序包括使用具有編碼該酶的堿基序列的微生物的步驟。如[20][20-4]任一項所述的制造方法，其中，形成該酶的工序包括使用屬于海洋芽孢桿菌屬的微生物的步驟。如[20][20-5]任一項所述的制造方法，其中，形成該酶的工序包括使用Oceanobacillusiheyensis株的步驟。如[20][20-6]任一項所述的制造方法，其中，形成該酶的工序包括使用OceanobacillusiheyensisDSM14731株的步驟。如[20][20-7]任一項所述的制造方法，其中，獲得根據(jù)編碼該酶的堿基序列形成該酶的工序中所形成的該酶時，精制后獲得該酶。如[20][20-S]任一項所述的制造方法，其中，形成該酶的工序包括使用含有編碼該酶的堿基序列的細(xì)胞的步驟。如[20][20-9]任一項所述的制造方法，其中，形成該酶的工序包括使用導(dǎo)入有編碼該酶的堿基序列的轉(zhuǎn)化體的步驟。如[20][20-10]任一項所述的制造方法，其中，編碼該酶的堿基序列是序列表序列編號10表示的堿基序列。磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的測定方法，該方法包括下述『1』和『2』各工序『1』抑制第二反應(yīng)的工序，其中，在能夠催化下述〈A〉〈C〉中任一個第二反應(yīng)的第二酶的存在下，使試樣中可能含有的磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林與第二酶接觸，使第二反應(yīng)受到與該磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的存在量對應(yīng)的程度的抑制，<八>受試樣中可能含有的磷酸咪唑立賓抑制的反應(yīng)、〈B〉受試樣中可能含有的磷酸利巴韋林抑制的反應(yīng)、<0受試樣中可能含有的磷酸咪唑立賓和磷酸利巴韋林這兩者抑制的反應(yīng)；『2』檢測第二反應(yīng)受抑制程度的工序。如上述[22]所述的測定方法，其中，第二酶具有上述[1-12][1-22]中記載的至少任意一項特征。如上述[22][22-1]所述的測定方法，其中，『1』工序具有上述[1-29][1-30]任一項中記載的至少任意一個特征。如上述[22][22-2]所述的測定方法，其中，該磷酸咪唑立賓和磷酸利巴韋林是單磷酸咪唑立賓和單磷酸利巴韋林。如上述[22][22-3]所述的測定方法，其中，『2』工序中抑制程度的檢測具有上述[1-32][1-33]任一項中記載的至少任意一項特征。如[22][22-4]任一項所述的測定方法，其中，『2』工序中的抑制程度的檢測是如下的工序?qū)褐康牧姿徇溥蛄①e和/或磷酸利巴韋林所引起的變化量和測定對象所引起的變化量進(jìn)行檢測并比較，從而對試樣中可能含有的磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林進(jìn)行定量。根據(jù)本發(fā)明，至少能夠提供測定咪唑立賓和/或利巴韋林的簡單方法。圖l(A)是顯示培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有pTipQCl/BthNK的紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis)所得到的粗酶液的SDS-PAGE的圖。圖l(B)是顯示培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有pTipQC2/BthNK的紅串紅球菌所得到的粗酶液的SDS-PAGE的圖。圖2是顯示培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有pET21a(+)/BthNK的大腸桿菌BL21(DE3)得到的粗酶液的SDS-PAGE的圖。圖3(A)是用HPLC分離標(biāo)準(zhǔn)品磷酸咪唑立賓得到的色譜圖。圖3(B)是用HPLC分離實施例14的反應(yīng)前的反應(yīng)液得到的色譜圖。圖3(C)是用HPLC分離實施例14的反應(yīng)后的反應(yīng)液得到的色譜圖。圖4是說明BthNK的最適pH的圖。圖5是說明BthNK的pH穩(wěn)定性的圖。圖6是說明BthNK的熱穩(wěn)定性的圖。圖7是顯示BthNK的SDS-PAGE的圖。圖8是顯示BthNK的作用溫度范圍的圖。圖9是顯示BthNK的作用溫度范圍的阿累尼烏斯圖。圖IO(A)是用HPLC分離標(biāo)準(zhǔn)品ATP、ADP、AMP以及腺苷混合物得到的色譜圖。圖IO(B)是實施實施例23所述的腺苷的磷酸化方法前的色譜圖。圖10(C)是實施實施例23所述的腺苷的磷酸化方法后的色譜圖。圖11是顯示利用使用了BthNK的組合物測定腺苷、肌苷以及鳥苷混合物的校準(zhǔn)曲線的圖。圖12是顯示利用使用了BthNK的組合物測定腺苷的校準(zhǔn)曲線的圖。圖13是顯示利用使用了BthNK的組合物測定肌苷的校準(zhǔn)曲線的圖。圖14是顯示利用使用了BthNK的組合物測定鳥苷的校準(zhǔn)曲線的圖。圖15是顯示利用使用了BthNK的組合物測定腺苷的校準(zhǔn)曲線的圖。圖16是顯示利用使用了BthNK的組合物測定肌苷的校準(zhǔn)曲線的圖。圖17是顯示利用使用了BthNK的組合物測定鳥苷的校準(zhǔn)曲線的圖。圖18是說明BsuIMPDH(A)和ObIMPDH(B)的最適pH的圖。圖19是說明BsuIMPDH(A)和ObIMPDH(B)的pH穩(wěn)定性的圖。圖20是說明BsuIMPDH(A)和ObIMPDH(B)的熱穩(wěn)定性的圖。圖21是顯示BsuIMPDH(B)和ObIMPDH(A)的SDS-PAGE的圖。圖22是說明KCl(O)和氯化銨(參)對BsuIMPDH(B)和ObIMPDH(A)的活性的影響的圖。圖23是顯示利用使用了實施例2制備的第一酶和實施例33制備的BsuIMPDH的組合物測定咪唑立賓的校準(zhǔn)曲線的圖。圖24是顯示利用使用了實施例12制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH的組合物測定利巴韋林的校準(zhǔn)曲線的圖。圖25是顯示利用使用了實施例11制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH的組合物測定咪唑立賓的校準(zhǔn)曲線的圖。圖26是顯示利用使用了實施例11制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH的組合物測定以蒸餾水稀釋的咪唑立賓的校準(zhǔn)曲線(O)和測定以血清稀釋的咪唑立賓的校準(zhǔn)曲線(參)的圖。圖27是顯示利用使用了實施例12制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH(O)或?qū)嵤├?4制備的ObIMPDH(參)的組合物測定咪唑立賓的校準(zhǔn)曲線的圖。圖28是利用使用了實施例12制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH的組合物測定2pg/ml的咪唑立賓時干涉物質(zhì)的影響的圖。關(guān)于干涉物質(zhì)，(A)中是膽紅素F、(B)中是膽紅素C、(C)中是乳糜、(D)中是血紅蛋白。圖29是顯示利用使用了實施例12制備的BthNK(參)或?qū)嵤├?3制備的BthNK(O)禾卩實施例33制備的BsuIMPDH的組合物測定咪唑立賓的校準(zhǔn)曲線的圖。圖30是顯示利用使用了實施例13制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH的組合物測定咪唑立賓的校準(zhǔn)曲線的圖。關(guān)于測定范圍，(A)中是07.5嗎/ml、(B)中是00.5(ig/ml。圖31是顯示利用使用了實施例11制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH的組合物測定以血清稀釋的咪唑立賓的校準(zhǔn)曲線(參)和測定以血細(xì)胞破壞液稀釋的咪唑立賓的校準(zhǔn)曲線(O)的圖。圖32是利用使用了實施例12制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH的組合物的本發(fā)明的咪唑立賓測定方法(X軸)與實施例1所述的利用HPLC的咪唑立賓測定(Y軸)的關(guān)系圖。圖33是顯示利用使用了實施例33制備的BsuIMPDH的組合物測定磷酸咪唑立賓的校準(zhǔn)曲線的圖。圖34是利用使用了實施例12制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH的組合物的本發(fā)明的咪唑立賓測定方法(Y軸)與利用Journalofchromatography,432巻、1988年、340-345頁記載的使用HPLC的方法的咪唑立賓測定(X軸)的關(guān)系圖。具體實施例方式本發(fā)明涉及包括下述(l)工序的咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法。(l)包括第一反應(yīng)的工序，在所述第一反應(yīng)中，在能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的第一酶的存在下，對試樣中可能含有的咪唑立賓和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化。本發(fā)明的咪唑立賓或利巴韋林包括公知的咪唑立賓或利巴韋林(CAS編號50924-49-7或36791-04-5)，并不受來源、劑型、結(jié)晶型、添加物、商品名等的限定。本發(fā)明的磷酸咪唑立賓或磷酸利巴韋林是結(jié)合有磷酸基的咪唑立賓或利巴韋林。磷酸基的數(shù)量可以是l、2或3，優(yōu)選磷酸基的數(shù)量為1，即優(yōu)選單磷酸咪唑立賓或單磷酸利巴韋林。對于可被磷酸化的部位沒有特別限制，可以是其糖部分即核糖部分的任意羥基，可以舉出l'位、2'位或5，位，有時還可以形成環(huán)，以單磷酸咪唑立賓或單磷酸利巴韋林的情況為例，優(yōu)選結(jié)合在5，位。即，該單磷酸咪唑立賓或單磷酸利巴韋林優(yōu)選咪唑立賓5，一磷酸或利巴韋林5'—磷酸。本發(fā)明的能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶包括具有上述理化性質(zhì)之中<1〉作用的性質(zhì)的酶。本說明書中，有時將能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化(包括催化第一反應(yīng))的酶記作第一酶。本發(fā)明的測定方法的工序(l)中可以存在該第一酶，作為該第一酶，從其理化性質(zhì)方面出發(fā)，只要是能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶即可，并不受酶名稱、EC編號或制造方法等的限制。作為該第一酶，優(yōu)選具有上述<1〉<4>的理化性質(zhì)或本申請說明書所記載的該第一酶的性質(zhì)中的任意性質(zhì)的酶。即，優(yōu)選具有上述<1〉<4〉的理化性質(zhì)之中的<1〉作用，對于有無其他性質(zhì)沒有特別的限制，還優(yōu)選具有上述<1〉<4>的理化性質(zhì)或本申請說明書所記載的該第一酶的性質(zhì)之中任意的1個或2個以上性質(zhì)。對于本發(fā)明的第一酶，還可以采用本申請說明書所記載的該第一酶的性質(zhì)的其他理化性質(zhì)、物理性能等。本發(fā)明的第一酶只要是能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶，則沒有特別限制，選擇至少對要測定的對象物進(jìn)行磷酸化的酶即可。例如，可以舉出能夠?qū)溥蛄①e和利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶或能對咪唑立賓或利巴韋林中的任一方進(jìn)行磷酸化的酶。即本發(fā)明的第一酶包括能夠?qū)溥蛄①e和利巴韋林進(jìn)行同等程度的磷酸化的酶；能夠?qū)溥蛄①e和利巴韋林進(jìn)行磷酸化，但能夠?qū)溥蛄①e或利巴韋林中某一方更有效地進(jìn)行磷酸化的酶；能夠僅選擇性地對咪唑立賓或利巴韋林中的某一方進(jìn)行磷酸化的酶。本發(fā)明的第一酶只要是能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶，則對其來源沒有限制，例如可以來自天然生物，但從容易培養(yǎng)、容易獲得酶的方面考慮，優(yōu)選來源于微生物的酶。作為優(yōu)選的來源于微生物的本發(fā)明的第一酶，可以舉出例如來源于伯克霍爾德氏菌屬或其近緣的黃單胞菌(Xanthomonas)屬等的酶，優(yōu)選來源于泰國伯克霍爾德氏菌的酶，最優(yōu)選來源于泰國伯克霍爾德氏菌DSM13276株的酶。該菌株可以由后述的菌種庫購買，也可以使用由其他菌種庫購買的該菌株的同等菌株、用Epidemiol.Infect.，118巻137-148頁、1995年所記載的方法分離出的同等菌株，確認(rèn)其能夠生成具有本發(fā)明的酶的各性質(zhì)的酶后，將其用于本發(fā)明的測定方法。另外，作為本發(fā)明的第一酶，還可以使用包括腺苷激酶、磷酸果糖激酶-B的核苷激酶或磷酸酶等。作為來源于微生物的本發(fā)明的第一酶，可以舉出被認(rèn)為是來源于大腸桿菌的鳥苷肌苷激酶、來源于詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcusjannaschii)的磷酸果糖激酶-B、來源于閃爍古生球菌(Archaeoglobusflilgidus)的磷酸果糖激酶-B的蛋白質(zhì)。作為來源于其他微生物的本發(fā)明的第一酶，可以舉出來源于面包酵母、分枝桿菌的能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的腺苷激酶。另外，雖然來源于哺乳動物的酶難以獲得，且效率也不一定高，但這樣的酶也可以使用，例如可以舉出來源于人的腺苷激酶或來源于小鼠、大鼠、兔子等的公知的腺苷激酶。本發(fā)明的第一酶只要是能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶，.對其氨基酸序列沒有限定，例如可以是序列表序列編號1的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一個或兩個以上氨基酸的氨基酸序列。該氨基酸序列優(yōu)選為含有序列表序列編號5的氨基酸序列和序列表序列編號6的氨基酸序列的序列(其中，序列表序列編號5和6中的Xaa表示任意的氨基酸)，最優(yōu)選是序列表序列編號1的氨基酸序列。作為序列表序列編號1的氨基酸序列中的氨基酸的缺失、取代或添加的例子，可以舉出在第一酶的N末端側(cè)和/或C末端側(cè)添加了硫氧還蛋白酶等功能性酶或由其他的氨基酸序列構(gòu)成的部分的例子，也優(yōu)選制成融合蛋白質(zhì)，可以舉出與能夠利用該添加的部分進(jìn)行精制或確認(rèn)等的被稱作標(biāo)記(tag)的部分融合的情況，有時，可以將該標(biāo)記部分去除，有時也可以殘留該部分的全部或一部分。例如，可以添加用于將第一酶向菌體外、細(xì)胞周質(zhì)傳輸?shù)募s20個信號肽、或用于進(jìn)行有效精制的510個His，添加這些時，可以連成一列。另外，還可以將幾個蛋白酶識別氨基酸序列配置在這些氨基酸序列之間等處?？梢耘c上述的添加的例子同樣地進(jìn)行缺失或取代，例如，存在由與本發(fā)明的第一酶的本質(zhì)功能無關(guān)的幾個氨基酸構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域的情況下、存在由序列表序列編號1的氨基酸序列中的兩個以上氨基酸構(gòu)成的缺口的情況下，也可以組合這些氨基酸的缺失。另外，還可適當(dāng)組合缺失、取代或添加。作為這樣的氨基酸序列，更優(yōu)選含有序列RREFGGCA(G、A或T)NI(A或G)(Y或F)(A、S、T或N)L以及DPTG(C、A、V或I)GDA(F、Y、W或H)R(G、A或S)G的能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶。另外，序列表序列編號1的氨基酸序列中，該序列表序列編號1的氨基酸序列的N末端側(cè)以及C末端側(cè)可以含有即添加有氨基酸殘基或多肽殘基，作為該添加氨基酸殘基，可以舉出信號肽、TEE序列、S標(biāo)記或者His標(biāo)記等。序列表序列編號1的氨基酸缺失的情況下，例如，可以舉出從N末端側(cè)或C末端側(cè)依次切除氨基酸的例子。序列表序列編號1的氨基酸序列中缺失了N末端的Met的酶或N末端受?；?、烷基等修飾等的經(jīng)翻譯后修飾的酶也是本發(fā)明的第一酶。另外，還可以利用公知的方法，利用琥珀酸酐、PEG等對第一酶進(jìn)行化學(xué)修飾，以使第一酶的最適pH、穩(wěn)定性等性質(zhì)變化為易于被利用的狀態(tài)。上述情況下，有時第一酶的分子量會發(fā)生變化，例如，利用后述的pTipQC1、pTipQC2在N末端添加His標(biāo)記時，分子量大了約1000。對本發(fā)明的第一酶的氨基酸序列的二次結(jié)構(gòu)、三次結(jié)構(gòu)以及四次結(jié)構(gòu)沒有特別限制。本發(fā)明的第一酶的堿基序列只要是編碼本發(fā)明的第一酶的堿基序列，則沒有特別的限制，例如在編碼序列表序列編號1的氨基酸序列的堿基序列的情況中，可以是編碼與序列表序列編號1實質(zhì)上均等的氨基酸序列的堿基序列，例如可以是序列表序列編號1的氨基酸序列之中與上述第一反應(yīng)的催化作用無關(guān)的一部分氨基酸發(fā)生了變異的氨基酸序列(如缺失、取代或添加了一個或兩個以上氨基酸的原氨基酸序列的均等物)進(jìn)行編碼的堿基序列。特別優(yōu)選含有編碼序列表序列編號5和序列表序列編號6的各自的氨基酸序列的堿基序列。作為編碼序列表序列編號1的氨基酸序列的堿基序列，可以舉出序列表序列編號2的堿基序列、或結(jié)合大腸桿菌、放線菌等宿主的密碼子使用頻率而對序列表序列編號2的堿基序列進(jìn)行了改變的堿基序列。制備編碼第一酶的堿基序列時，可以利用通常使用的公知的基因操作手段，例如可以舉出部位特異性的變異法、用人工變異堿基取代目的基因的特定堿基片段的方法等各種方法。本說明書中，有時將由序列表序列編號1的氨基酸序列構(gòu)成的第一酶記作BthNK。只要能夠測定咪唑立賓和/或利巴韋林，對本發(fā)明的測定方法的工序()中使用的第一酶的量沒有特別限制，可以根據(jù)試樣所含有的咪唑立賓和/或利巴韋林的存在量、對咪唑立賓和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的目的程度、使用的裝置、第一酶的純度和/或經(jīng)濟(jì)狀況等，確定一個能夠得到理想結(jié)果的量。本發(fā)明的測定方法的工序(l)中還使用了磷酸供體、金屬離子的情況下，對于其種類和量也是相同的。例如，在條件是原料、試樣所含有的咪唑立賓和/或利巴韋林的存在量為lmM以下且要將其全部磷酸化的情況下，本發(fā)明的測定方法的工序(l)中使用的第一酶的量的下限為0.01U/ml以上，優(yōu)選為0.05U/ml以上，進(jìn)一步優(yōu)選為0.1U/ml以上，對上限沒有特別限制，但通常為5U/ml以下，優(yōu)選為2U/ml以下，進(jìn)一步優(yōu)選為1U/ml以下。本發(fā)明的測定方法的工序(l)優(yōu)選至少在磷酸供體的存在下進(jìn)行，該磷酸供體也可以是CTP、GTP、TTP或者多磷酸等，但特別優(yōu)選ATP。以ATP為例，上述條件下使用的磷酸供體的量的下限為O.lmM以上，優(yōu)選為lmM以上，進(jìn)一步優(yōu)選為5mM以上，對上限沒有特別限制，但優(yōu)選為500mM以下，進(jìn)一步優(yōu)選為200mM以下，特別優(yōu)選為50mM以下。本發(fā)明的測定方法的工序(l)優(yōu)選至少在金屬離子的存在下進(jìn)行，所述金屬離子可以是鎂離子、鈷離子、鎳離子或錳離子之中任意一種以上的金屬離子，但特別優(yōu)選鎂離子。以鎂離子為例，上述條件下使用的金屬離子的量的下限為磷酸供體的濃度的0.1當(dāng)量以上，優(yōu)選為0.5當(dāng)量以上，進(jìn)一步優(yōu)選為1當(dāng)量以上，上限為10當(dāng)量以下，優(yōu)選為5當(dāng)量以下，進(jìn)一步優(yōu)選為3當(dāng)量以下。最優(yōu)選的濃度是磷酸供體的2當(dāng)量。本發(fā)明的測定方法能夠在各種條件下精密準(zhǔn)確地實施測定，這一點可以得到本發(fā)明說明書實施例的支持。對本發(fā)明的試樣沒有特別的限制，可以舉出含有全血、血漿、血清、血球、髓液、淋巴液、尿等的生物試樣、研究用試樣和這些的提取物等，這些試樣優(yōu)選是推測含有咪唑立賓和/或利巴韋林的試樣，更優(yōu)選是推測含有咪唑立賓或利巴韋林中某一方的試樣。試樣是生物試樣的情況下，還優(yōu)選選取咪唑立賓和/或利巴韋林的靶向臟器(例如白血球、肝細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞等)制成試樣，試樣是白血球的情況下，還優(yōu)選選取T細(xì)胞、B細(xì)胞、淋巴球等制成試樣。采集推測含有咪唑立賓和/或利巴韋林的生物試樣情況下，采集方法可以是公知的方法，采集全血的情況下，對是否使用分離劑、抗纖溶酶劑等沒有限制，對是否使用EDTA、氟化鈉、檸檬酸鈉、肝素鈉等抗凝固劑、糖酵解抑制劑也沒有限制。作為其他試樣，可以舉出例如海水、天然水、果汁、飲料、廢液等。判斷試樣中是否可能含有咪唑立賓和/或利巴韋林時，包括在實施本發(fā)明的測定方法之前能夠判斷試樣中是否可能含有咪唑立賓和/或利巴韋林的情況，例如可以通過用藥經(jīng)歷、飲食經(jīng)歷等來判斷是否可能含有，還可以通過HPLC、LC/MS/MS等上述現(xiàn)有技術(shù)來判斷是否有可能。另外，還可以通過實施本發(fā)明的測定方法來判斷試樣中是否可能含有。同樣，判斷試樣中是否可能含有磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林時也可以利用現(xiàn)有技術(shù)和后述的方法。通?？梢酝ㄟ^用藥經(jīng)歷來判斷試樣中是否可能含有咪唑立賓和/或利巴韋林。本發(fā)明中，試樣中可以同時存在咪唑立賓、利巴韋林、磷酸咪唑立賓和磷酸利巴韋林，對同時存在咪唑立賓、利巴韋林、磷酸咪唑立賓和磷酸利巴韋林的試樣中的咪唑立賓或利巴韋林的存在量進(jìn)行測定的情況下，可以適當(dāng)將本發(fā)明的測定方法與現(xiàn)有技術(shù)或后述的測定磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的存在量的方法和/或上述的利用HPLC、LC/MS/MS測定咪唑立賓或利巴韋林的存在量的方法組合來實施，通過減去這些數(shù)值來計算出咪唑立賓、利巴韋林的存在量。通常優(yōu)選對單獨存在咪唑立賓或利巴韋林的試樣進(jìn)行測定。本發(fā)明是還含有下述(2)工序的咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法。(2)抑制第二反應(yīng)的工序，其中，在能夠催化第二反應(yīng)的第二酶的存在下，進(jìn)行第二反應(yīng)時，使上述第一反應(yīng)生成的該磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林與第二酶接觸，使第二反應(yīng)受到與該磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的存在量對應(yīng)的程度的抑制，所述第二反應(yīng)是與上述第一反應(yīng)不同的反應(yīng)，是下述<3〉<0>中任意一個反應(yīng)〈a〉不受咪唑立賓抑制，但受上述第一反應(yīng)生成的磷酸咪唑立賓抑制的反應(yīng)；〈b〉不受利巴韋林抑制，但受上述第一反應(yīng)生成的磷酸利巴韋林抑制的反應(yīng)；〈c〉不受咪唑立賓和利巴韋林這兩者抑制，但受上述第一反應(yīng)生成的磷酸咪唑立賓和磷酸利巴韋林這兩者抑制的反應(yīng)。本說明書中，有時將能夠催化該第二反應(yīng)的酶記作第二酶。本發(fā)明的測定方法的工序(2)中可以存在該第二酶，從其理化性質(zhì)方面出發(fā)，只要是能夠催化上述第二反應(yīng)的酶即可，并不受酶名稱、EC編號和/或制造方法等的限制。該第二酶可以是能夠催化不受咪唑立賓和利巴韋林這兩者抑制，但受上述第一反應(yīng)生成的磷酸咪唑立賓和磷酸利巴韋林這兩者抑制的反應(yīng)的酶。另外，該第二酶還可以是能夠催化不受咪唑立賓抑制，但受上述第一反應(yīng)生成的磷酸咪唑立賓抑制的反應(yīng)的酶。再者，該第二酶還可以是能夠催化不受利巴韋林抑制，但受上述第一反應(yīng)生成的磷酸利巴韋林抑制的反應(yīng)的酶。作為該第二酶，優(yōu)選具有上述〈i〉〈vi〉的理化性質(zhì)或本申請說明書所記載的該第二酶的性質(zhì)中的任意性質(zhì)的酶，上述〈i〉〈vi〉的理化性質(zhì)之中優(yōu)選具有〈v〉抑制作用，對于有無其他的性質(zhì)沒有特別的限制，還優(yōu)選具有上述<1><^〉的理化性質(zhì)、本申請說明書所記載的該第二酶的性質(zhì)之中任意1個或2個以上的性質(zhì)。更優(yōu)選的是能夠催化受到與第一反應(yīng)生成的磷酸咪唑立賓和磷酸利巴韋林的存在量對應(yīng)程度的抑制的反應(yīng)的酶，最優(yōu)選肌苷5'—磷酸脫氫酶。肌苷5'—磷酸脫氫酶有時表示為EC1丄1.205。采用肌苷5'—磷酸脫氫酶作為本發(fā)明的第二酶的情況下，對來源沒有限制，例如可以來源于天然生物，另外，來源于微生物的情況下，例如可以是來源于人、大腸桿菌、白色念珠菌(Candidaalbicans)、胎兒三毛滴蟲(Tritrichomonasfoetus)、伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)、大鼠、兔子、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)等的公知的肌苷5'—磷酸脫氫酶，也可以是這些的同功酶(S.F.Carr等、J.Biol.Chem.、268巻、27286頁、1993年；H.J.Gilbert等、Biochem.J.、183巻、481頁、1979年;G.A.Koehler等、J.Bacteriol.、179巻、2331頁、1997年;F.G.Whitby等、36巻、10666頁、1997年;X.Zhou等、J.Biol.Chem.、272巻、21977頁、1997年等)。作為形成能夠用作第二酶的肌苷5，一磷酸脫氫酶的天然微生物的典型例，可以舉出屬于芽孢桿菌屬、海洋芽孢桿菌屬的微生物，更優(yōu)選枯草桿菌或Oceanobacillusiheyensis，最優(yōu)選枯草桿菌ATCC23857株或OceanobacillusiheyensisDSM14731株。另外，也可以使用由其他菌種庫購買的該菌株的同等菌株或使用用上述方法從自然界分離的同等菌株，確認(rèn)能夠生成具有本發(fā)明的酶的各性質(zhì)的酶后，將其用于本發(fā)明的測定方法。本發(fā)明的第二酶只要是能夠催化上述第二反應(yīng)的酶，對其氨基酸序列沒有限制，例如為序列表序列編號7或序列表序列編號9的氨基酸序列的情況下，可以是缺失、取代或添加了--個或兩個以上氨基酸的氨基酸序列，但該氨基酸序列優(yōu)選含有序列表序列編號11的氨基酸序列和序列表序列編號12的氨基酸序列，更優(yōu)選含有序列表序列編號23的序列，進(jìn)一歩優(yōu)選含有序列表序列編號24的序列，特別優(yōu)選為序列表序列編號7或序列表序列編號9的氨基酸序列。在本發(fā)明的序列表序列編號7或序列表序列編號9中的兩個以上的氨基酸缺失、取代或添加、翻譯后修飾、化學(xué)修飾方面、其最終分子量的變化方面、氨基酸序列的結(jié)構(gòu)方面，均與上述第一酶的情況相同。本發(fā)明的第二酶為例如序列表序列編號7的氨基酸序列的情況下，作為取代了一個或兩個以上氨基酸的氨基酸序列的例子，可以舉出V432I(表示序列表序列編號7的432位的V被取代成I，下同)、K449I、K345N、D29N、S33Y、T158S、T270A、V387E以及L367I和這些取代的任意組合。該任意的組合可以舉出例如[V4321、K449I](表示序列表序列編號7的432位的V被取代成I且同時4的位的K被取代成I，下同)、[D29N、S33Y、T158S、T270A、V387E]。本發(fā)明的第二酶的堿基序列只要是編碼本發(fā)明的第二酶的堿基序列，則沒有特別的限制，可以舉出編碼序列表序列編號7或序列表序列編號9的氨基酸序列的堿基序列、含有與上述第一酶的情況相同的變異、變更的堿基序列。制備編碼本發(fā)明的第二酶的堿基序列時，可以利用與上述第一酶的情況相同的基因操作手段。本說明書中，有時將由序列表序列編號7的氨基酸序列構(gòu)成的第二酶記作BsuIMPDH，將由序列表序列編號9的氨基酸序列構(gòu)成的第二酶記作ObIMPDH。只要能夠測定咪唑立賓和/或利巴韋林，對本發(fā)明的測定方法的工序(2)中使用的第二酶的量沒有特別限制，可以根據(jù)試樣所含有的咪唑立賓和/或利巴韋林的存在量、對咪唑立賓和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的目的程度、使用的裝置、第二酶的純度和/或經(jīng)濟(jì)狀況等，確定一個能夠得到理想結(jié)果的量。本發(fā)明的測定方法的工序(2)中使用對應(yīng)于所使用的第二酶的底物、輔酶的情況下，或者使用肌苷5'—磷酸、NAD(P)類的情況下，對于其種類和量也是相同的。例如，在原料、試樣所含有的咪唑立賓和/或利巴韋林的存在量為lmM以下且要將其全部磷酸化、使用肌苷5'—磷酸脫氫酶作為第二酶的情況下，本發(fā)明的測定方法的工序(2)中使用的第二酶的量的下限為0.01U/ml以上，優(yōu)選為0.05U/ml以上，進(jìn)一步優(yōu)選為0.1U/ml以上，對上限沒有特別限定，但通常為1U/ml以下，優(yōu)選為0.5U/ml以下，進(jìn)一步優(yōu)選為0.3U/ml以下。本發(fā)明的測定方法的工序(2)優(yōu)選至少在肌苷5'—磷酸的存在下進(jìn)行，該肌苷5'—磷酸并未限定鹽的種類和有無結(jié)晶水。上述條件下使用的肌苷5'—磷酸的量的下限為lmM以上，優(yōu)選為3mM以上，進(jìn)一步優(yōu)選為5mM以上，對上限沒有特別限定，但優(yōu)選為100mM以下，進(jìn)一步優(yōu)選為50mM以下，特別優(yōu)選為30mM以下。本發(fā)明的測定方法的工序(2)優(yōu)選至少在NAD(P)類的存在下進(jìn)行，NAD(P)類中可以舉出NAD(P)、脫酰胺NAD(P)(NAAD(P))、硫代NAD(P)、煙酰胺鳥嘌吟二核苷酸(磷酸)、煙酰胺次黃嘌呤二核苷酸(磷酸)等，可以是其中任意一個以上，特別優(yōu)選NAD。例如在NAD的情況下，上述條件下使用的NAD(P)類的量的下限為O.lmM以上，優(yōu)選為0.5mM以上，進(jìn)一步優(yōu)選為lmM以上，對上限沒有特別限定，但優(yōu)選為50mM以下，進(jìn)一步優(yōu)選為10mM以下，特別優(yōu)選為7mM以下。本發(fā)明的測定方法是包括下述(3)工序的咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法。(3)檢測第二反應(yīng)受抑制程度的工序。本發(fā)明的檢測方法的工序(3)可以是通過定性反應(yīng)檢測抑制程度的工序，優(yōu)選抑制程度的檢測是檢測能夠催化第二反應(yīng)的第二酶的反應(yīng)速度的工序，更優(yōu)選抑制程度的檢測是檢測NAD(P)類的變化量的工序，最優(yōu)選抑制程度的檢測是檢測NAD(P)類的變化量并定量的工序。進(jìn)行定量的測定方法如下。對可能含有咪唑立賓和/或利巴韋林的試樣與含有已知濃度的咪唑立賓和/或利巴韋林的試樣分別單獨用工序(1)(3)進(jìn)行處理，在工序(3)檢測各自的變化量。將通過工序(3)對可能含有咪唑立賓和/或利巴韋林的試樣檢測到的變化量和通過工序(3)對含有已知濃度的咪唑立賓和/或利巴韋林的試樣檢測到的變化量作以比較，由此對可能含有咪唑立賓和/或利巴韋林的試樣中的咪唑立賓和/或利巴韋林的濃度進(jìn)行定量。檢測NAD(P)類的變化量的方法中，用公知的方法檢測該測定對象的變化量。一般可以舉出使用裝置通過光學(xué)方法檢測伴隨該測定對象的變化發(fā)生的該測定對象的吸收光譜、吸光強度的變化的方法，也可以是檢測伴隨NAD(P)類的氧化還原產(chǎn)生的吸收光譜、特定波長下的吸光強度的變化的方法。另外，還可檢測NAD(P)H類的熒光變化?；谔岣哽`敏度或通過目視檢測等目的，還可以使其中存在DI(P)(心肌黃酶，Diaphorase)或甲臜(formazan)色素。另外，為了進(jìn)一步提高靈敏度等，還可以采用NAD(P)類循環(huán)反應(yīng)。測定NAD(P)類的氧化還原所致的電位差時，使用電極?？梢詫⑹褂玫拿腹潭ㄓ谔己戎瞥呻姌O，用于咪唑立賓和/或利巴韋林的測定。實施本發(fā)明的測定方法時，可以在液相、氣相或固相等實施，或者在各自的臨界面實施，優(yōu)選在液相實施。液相包括水相、有機(jī)溶劑相等，以水相實施本發(fā)明的測定方法的情況下，水相可以舉出例如水、水溶液、含有適當(dāng)有機(jī)溶劑的水性介質(zhì)，并優(yōu)選使用適當(dāng)?shù)膒H緩沖劑。使用pH緩沖劑的情況下，只要能保持目的pH且能測定試樣中的咪唑立賓和利巴韋林，則對其種類沒有特別的限制，可以舉出Good'spH緩沖液、Tris/HCl緩沖液、磷酸鉀緩沖液、乙酸/Na()H緩沖液、檸檬酸/NaOH緩沖液。只要能夠測定試樣中的咪唑立賓和/或利巴韋林，對實施本發(fā)明的測定方法時的pH沒有特別的限制，工序(1)中，pH的下限可以舉出為pH4以上，優(yōu)選為pH4.8以上，更優(yōu)選為pH5.2以上，上限可以舉出為pH8.5以下，優(yōu)選為pH8以下，更優(yōu)選為pH7.5以下。工序(2)和(3)中，下限可以舉出為pH5.5以上，優(yōu)選為pH6以上，更優(yōu)選為pH7以上，上限可以舉出為pH10.5以下，優(yōu)選為pH9.5以下，更優(yōu)選為pH8.5以下。只要能夠保持目的PH且能夠測定咪唑立賓和利巴韋林，對pH緩沖劑的濃度沒有特別的限制，下限可以舉出為3mM以上，優(yōu)選為5mM以上，進(jìn)一步優(yōu)選為10mM以上，上限可以舉出為500mM以下，優(yōu)選為200mM以下，進(jìn)一步優(yōu)選為100mM以下。作為本發(fā)明的測定方法的其他的優(yōu)選液相，可以舉出例如溶膠-凝膠。為了制成溶膠-凝膠，可以利用例如瓊脂等多糖類。區(qū)分溶膠-凝膠和乳濁液的情況下，還可制成乳濁液實施測定。為了制成乳濁液，可以利用例如有機(jī)溶劑等，利用雙親媒性物質(zhì)時，還可制成膠束來實施測定。任一種情況下，如果使用pH緩沖劑，其情況與上述相同。本發(fā)明的測定方法中的(1)(3)各工序可分別在不同的反應(yīng)槽(相)中實施，但優(yōu)選在同一反應(yīng)槽(相)中實施。另外，(1)(3)各工序可以間斷實施，但優(yōu)選連續(xù)實施。另夕卜，(1)(3)各工序可以按(1)、(2)、(3)的順序進(jìn)行；也可同時進(jìn)行(1)和(2)，然后進(jìn)行(3);還可以先進(jìn)行(l)，然后同時進(jìn)行(2)和(3);還可以同時進(jìn)行(l)、(2)、(3);等，根據(jù)目的、試樣、使用的裝置等確定一個能夠得到理想結(jié)果的順序。另外，不實施本發(fā)明的測定方法的工序(1)就實施工序(2)和工序(3)的方法時，能夠測定磷酸咪唑立賓和磷酸利巴韋林的存在量。只要能夠測定試樣中的咪唑立賓和/或利巴韋林，對本發(fā)明的工序(1)(3)的反應(yīng)時間沒有特別的限帝lj，各自的下限為15秒以上，優(yōu)選為l分鐘以上，進(jìn)一步優(yōu)選為3分鐘以上。沒有對上限進(jìn)行特別設(shè)置，但優(yōu)選為30分鐘以下，進(jìn)一步優(yōu)選為15分鐘以下，特別優(yōu)選為IO分鐘以下。(1)(3)各工序的反應(yīng)時間可以是不均等的。對實施本發(fā)明的測定方法的溫度沒有特別的限制，只要是能夠測定試樣中的咪唑立賓和/或利巴韋林的溫度即可，優(yōu)選在所使用的酶的作用溫度的范圍內(nèi)，并且，下限為15。C以上，優(yōu)選為2(TC以上，進(jìn)一步優(yōu)選為25'C以上，上限為7(TC以下，優(yōu)選為5(TC以下，進(jìn)一步優(yōu)選為40°C以下。(1)(3)各工序的溫度可以是不均等的。作為本發(fā)明的與包括上述(l)(3)的工序的咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法不同的其他測定方法，可以是包括下述(a)(c)各工序的測定方法。(a)包括反應(yīng)I的工序，在所述反應(yīng)I中，在上述第一酶和ATP的存在下使試樣中可能含有的咪唑立賓和/或利巴韋林變成磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林和ADP;(b)在催化與上述反應(yīng)I不同的反應(yīng)II或兩個以上的反應(yīng)II的酶B或兩個以上的酶B的存在下，使反應(yīng)II產(chǎn)生的測定對象對應(yīng)上述反應(yīng)I產(chǎn)生的ADP的量發(fā)生變化的工序；(c)檢測該測定對象的變化量，測定試樣中可能含有的咪唑立賓和/或利巴韋林的量的工序。對本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的其他測定方法中的咪唑立賓和/或利巴韋林的來源沒有限制，但優(yōu)選上述的試樣。實施本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的其他測定方法的相、以液相實施時的pH緩沖劑的條件、時間和溫度的條件、反應(yīng)槽(相)的條件、實施工序的順序等與上述相同。在本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的其他測定方法的工序(a)中使用的第一酶的量、使用磷酸供體和金屬離子的情況下的所用種類和量等條件等與上述工序(l)中相同。即，本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的其他測定方法的工序(a)可以以與本發(fā)明的測定方法中的工序(l)相同的條件實施。本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的其他測定方法的工序(b)是在催化與上述反應(yīng)I不同的反應(yīng)II或兩個以上的反應(yīng)II的酶B或兩個以上的酶B的存在下，使反應(yīng)II產(chǎn)生的測定對象對應(yīng)上述反應(yīng)I產(chǎn)生的ADP的量發(fā)生變化的工序。作為本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的其他測定方法的工序(b)的例子，可以舉出如下工序(b)工序包括(b-l)反應(yīng)和(b-2)反應(yīng)，(b-l)反應(yīng)中，在ADP依賴性己糖激酶的存在下，使葡萄糖和ADP變成葡萄糖-6-磷酸和AMP;(b-2)反應(yīng)中，在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的存在下，使NAD(P)類和上述反應(yīng)生成的葡萄糖-6-磷酸變成NAD(P)H類和葡糖酸內(nèi)酯-6-磷酸；NAD(P)H類對應(yīng)上述反應(yīng)I生成的ADP的量增加(本說明書有時記作工序(b(a)))，(c)工序中檢測NAD(P)H類的增加量。只要能夠?qū)嵤┍景l(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的其他測定方法，則對本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的其他測定方法的工序(b((X))中的ADP依賴性己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的來源或起源沒有特別限制。只要能夠?qū)嵤┍景l(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的其他測定方法，則對工序(b(oi))中的ADP依賴性己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的濃度沒有特別的限制，例如，下限為0.1U/ml以上，優(yōu)選為1U/ml以上，進(jìn)一步優(yōu)選為2U/ml以上，沒有特別設(shè)定上限，優(yōu)選為20U/ml以下，進(jìn)一步優(yōu)選為10U/ml以下。工序(b(a))中可以存在ADP依賴性己糖激酶對于反應(yīng)所要求的底物、金屬離子。只要能夠?qū)嵤┍景l(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的其他測定方法，則對底物、金屬離子的種類和濃度沒有特別的限制，但該種類和濃度會因所使用的ADP依賴性己糖激酶的來源或起源的不同而有所不同。作為葡萄糖作底物的例子，例如濃度為O.OlmM以上，優(yōu)選為O.lmM以上，進(jìn)一步優(yōu)選為lmM以上，沒有特別設(shè)定上限，優(yōu)選為500mM以下，進(jìn)一步優(yōu)選為100mM以下。作為氯化鎂作金屬離子的例子，例如濃度為O.lmM以上，優(yōu)選為lmM以上，進(jìn)一步優(yōu)選為5mM以上，沒有特別設(shè)定上限，優(yōu)選為100mM以下，進(jìn)一步優(yōu)選為10mM以下。工序(b(a))中可以存在NAD(P)類，其是葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的輔酶。只要能夠?qū)嵤┍景l(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的其他測定方法，則對NAD(P)類的種類、濃度沒有特別的限制，但該種類和濃度會因所使用的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的來源或起源的不同而有所不同。作為NAD(P)作輔酶的例子，例如濃度為O.lmM以上，優(yōu)選為lmM以上，進(jìn)一歩優(yōu)選為3mM以上，沒有特別設(shè)定上限，優(yōu)選為50mM以下，進(jìn)一步優(yōu)選為10mM以下。NAD(P)類的種類與上述相同。作為本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的其他測定方法的工序(b)的其他例子，可以舉出如下工序(b)工序中包括(b-l)反應(yīng)和(b-2)反應(yīng)，(b-l)反應(yīng)中，在丙酮酸激酶的存在下，使ADP和PEP變成丙酮酸和ATP;(b-2)反應(yīng)中，在乳酸脫氫酶的存在下，使NAD(P)H類和上述反應(yīng)生成的丙酮酸變成NAD(P)類和乳酸；NAD(P)H類對應(yīng)上述第一反應(yīng)生成的ADP的量減少(本說明書有時記作工序(b((3)))，(c)工序中檢測NAD(P)H類的減少只要能夠?qū)嵤┍景l(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的其他測定方法，則對本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的其他測定方法的工序(b(P))中的丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶的來源或起源沒有特別限制。只要能夠?qū)嵤┍景l(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的其他測定方法，則對工序(b((3))中的丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶的濃度沒有特別的限制，例如，下限為1U/ml以上，優(yōu)選為5U/ml以上，進(jìn)一步優(yōu)選為10U/ml以上，沒有特別設(shè)定上限，優(yōu)選為100U/ml以下，進(jìn)一步優(yōu)選為50U/ml以下。工序(b(p))中可以存在丙酮酸激酶對于反應(yīng)所要求的底物、金屬離子。只要能夠?qū)嵤┍景l(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的其他測定方法，則對底物、金屬離子的種類和濃度沒有特別的限制，但該種類和濃度會因所使用的丙酮酸激酶的來源或起源的不同而有所不同。作為PEP作底物的例子，例如濃度為O.lmM以上，優(yōu)選為0.5mM以上，進(jìn)一步優(yōu)選為lmM以上，沒有特別設(shè)定上限，優(yōu)選為50mM以下，進(jìn)一步優(yōu)選為10mM以下。作為氯化鎂作金屬離子的例子，例如濃度為O.lmM以上，優(yōu)選為0.5mM以上，進(jìn)一步優(yōu)選為lmM以上，沒有特別設(shè)定上限，優(yōu)選為50mM以下，進(jìn)一步優(yōu)選為10mM以下。工序(b((3))中可以存在NAD(P)H類，其是乳酸脫氫酶的輔酶。只要能夠?qū)嵤┍景l(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的其他測定方法，則對NAD(P)H類的種類、濃度沒有特別的限制，但該種類和濃度會因所使用的乳酸脫氫酶的來源或起源的不同而有所不同，也因所使用的比色杯的光程長、比色計的性能而不同。以光程長lcm的比色杯為例，濃度為O.OlmM以上，優(yōu)選為0.03mM以上，進(jìn)一步優(yōu)選為0.07mM以上，上限為0.2mM以下，優(yōu)選為0.17mM以下，進(jìn)一步優(yōu)選為0.15mM以下。作為本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的其他測定方法的工序(b)的另一個其他例子，可以舉出如下工序(b)工序中包括(b-l)反應(yīng)和(b-2)反應(yīng)，(b-l)反應(yīng)中，在丙酮酸激酶的存在下，使ADP和PEP變成丙酮酸和ATP;(b-2)反應(yīng)中，在丙酮酸氧化酶的存在下，使氧、磷酸和上述反應(yīng)生成的丙酮酸變成過氧化氫和乙酰磷酸；過氧化氫對應(yīng)上述第-一反應(yīng)生成的ADP的量增加(本說明書有時稱作工序(b(力))，(c)工序中用過氧化氫指示劑等檢測過氧化氫的量。只要能夠?qū)嵤┍景l(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的其他測定方法，則對本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的其他測定方法的工序(b(力)中的丙酮酸激酶和丙酮酸氧化酶的來源或起源沒有特別限制。工序(b(Y))中的丙酮酸激酶和丙酮酸氧化酶的濃度與上述的丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶的情況相同。工序(b(力)中丙酮酸激酶對于反應(yīng)所要求的底物、金屬離子的種類和濃度與上述相同。工序(b(力)中的過氧化氫指示劑使用過氧化酶的同時還可以使用4-氨基安替比林、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙等色偶、氯苯酚等苯酚類或TOOS、N,N-二甲基苯胺等苯胺類及它們的衍生物等色原體、或是隱色型的色原體等。本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的其他測定方法的工序(c)中的對該測定對象的變化量進(jìn)行檢測的方法中，檢測NAD(P)類的變化量的方法與上述相同。使用過氧化氫指示劑的情況下，可以檢測伴隨該過氧化氫指示劑的變化而發(fā)生的吸收光譜、特定波長的吸光強度的變化。另外，檢測消耗的氧的情況下，利用氧電極。本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的其他測定方法的工序(c)中的檢測方法可以與上述本發(fā)明的測定方法的工序(3)相同。本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的磷酸化方法是使用本發(fā)明的第一酶使咪唑立賓和/或利巴韋林變成磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的方法。另外，本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的磷酸化方法例如優(yōu)選是如下的方法使用本發(fā)明的第一酶，至少在磷酸供體存在下使咪唑立賓和/或利巴韋林變成磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林；優(yōu)選使至少鎂離子、鈷離子、鎳離子或錳離子之中任意一種以上的金屬離子、咪唑立賓和/或利巴韋林、磷酸供體以及本發(fā)明的第一酶相接觸。對于接觸的順序沒有特別限制。本發(fā)明的磷酸化方法中的咪唑立賓和/或利巴韋林的來源與上述相同。實施本發(fā)明的磷酸化方法的相、以液相實施的情況下的pH緩沖劑的條件等、時間、溫度的條件等與上述相同。另外，該方法中使用的第酶的量、使用磷酸供體、金屬離子的情況下這些物質(zhì)的種類和量等條件等與上述相同。即，本發(fā)明的磷酸化方法可以以與本發(fā)明的測定方法中的工序(l)相同的條件來實施。本發(fā)明的使咪唑立賓和/或利巴韋林變成磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的制造方法中，通過上述本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的磷酸化方法，由咪唑立賓和/或利巴韋林制造磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林。所制造的磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林可以保持與原料、其他制造物等混合存在的狀態(tài)，但優(yōu)選根據(jù)目的、用途等情況使其實質(zhì)性地不包含雜質(zhì)，通常制成例如50%以上、70%以上、95。/。以上的各種純度?？梢杂霉木品椒▽α姿徇溥蛄①e和/或磷酸利巴韋林進(jìn)行精制，例如可以舉出使用溶劑等的提取、使用硅膠、氧化鋁和/或硅藻土等的層析法和/或利用重結(jié)晶等的精制方法。本發(fā)明的第一酶和/或第二酶可以制成咪唑立賓和/或利巴韋林測定用組合物。本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林測定用組合物可以用于上述的本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法和本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的其他測定方法。另外，還可用于將咪唑立賓和/或利巴韋林制成磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的方法、將咪唑立賓和/或利巴韋林制成磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的制造方法。本發(fā)明的組合物可以舉出含有下述的(Al)(A4-3)成分的組合物。該組合物可以是咪唑立賓測定用組合物、利巴韋林測定用組合物、咪唑立賓和利巴韋林測定用組合物中的任意一種。(Al)第一酶，其能夠催化對咪唑立賓和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的第(A2)磷酸供體；(A3)金屬離子；(A4-l)第二酶，其能夠催化第二反應(yīng)，所述第二反應(yīng)是與上述第一反應(yīng)不同的反應(yīng)，是下述<3><(:>中任意一個反應(yīng)〈a〉不受咪唑立賓抑制，但受上述第一反應(yīng)生成的磷酸咪唑立賓抑制的反應(yīng)，'〈b〉不受利巴韋林抑制，但受上述第一反應(yīng)生成的磷酸利巴韋林抑制的反應(yīng)，〈C〉不受咪唑立賓和利巴韋林這兩者抑制，但受上述第一反應(yīng)生成的磷酸咪唑立賓和磷酸利巴韋林這兩者抑制的反應(yīng)；(A4-2)肌苷5'—磷酸；以及(A4-3)NAD(P)類。本發(fā)明的組合物中包含上述(Al)(A3)和下述的含有(A4-l)(A4-3)成分的組合物。該組合物可以是磷酸咪唑立賓測定用組合物、磷酸利巴韋林測定用組合物、磷酸咪唑立賓和磷酸利巴韋林測定用組合物。(A4-l)第二酶，催化與上述第一反應(yīng)不同的反應(yīng)，受磷酸利巴韋林的抑制；(A4-2)肌苷5'—磷酸；以及(A4-3)NAD(P)類。另外，本發(fā)明的組合物優(yōu)選下述3種成分之中任意一種以上的成分在即將測定前加入，以制成本發(fā)明的組合物。即，制成具有測定時所需的全部成分的本發(fā)明的組合物時，優(yōu)選在測定以前至少下述的3種成分或任意的一種或2種成分是與組合物分開的。將下述的3種成分之中任意一種、兩種或三種成分在即將測定前合并到組合物中的情況下，合并的順序是任意的，可以一個一個合并，也可以同時合并2個或3個。(A4-l)第二酶、(A4-2)肌苷5'—磷酸、以及(A4-3)NAD(P)類。本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林測定用組合物是含有下述的(A)和(B)的組合物。(A)第1試劑，其至少含有下述(A1)(A4):(Al)有效量的本發(fā)明的第一酶、(A2)磷酸供體、(A3)金屬離子、(A4)有效量的本發(fā)明的第二酶、肌苷5'—磷酸和NAD(P)類中的任意一個以上的成分；(P)第2試劑，其至少含有有效量的受磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林抑制的第二酶、肌苷5'—磷酸以及NAD(P)類之中第1試劑中不含的成分。本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林測定用組合物優(yōu)選含有下述的(A)和(B)。(A)第l試劑，其至少含有以下的(A1)(A4):(Al)有效量的本發(fā)明的第--酶、(A2)磷酸供體、(A3)金屬離子、(A4)本發(fā)明的第二酶和NAD(P)類；(B)第2試劑，其至少含有有效量的肌苷5'—磷酸。上述本發(fā)明的咪唑立賓禾P/或利巴韋林測定用組合物(A)和(B)也優(yōu)選含有適當(dāng)?shù)膒H緩沖劑。本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林測定用組合物可以還含有下述的(C)。(C)標(biāo)準(zhǔn)試劑，其至少含有已知量的咪唑立賓和/或利巴韋林。本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林測定用組合物所含有的、本發(fā)明的第一酶、本發(fā)明的第二酶、磷酸供體、金屬離子、肌苷5'—磷酸以及NAD(P)類的種類和有效量即該組合物成為咪唑立賓和/或利巴韋林測定用組合物所需的有效添加量和pH緩沖劑的條件等與上述的本發(fā)明的測定方法相同。本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)試劑可以是至少含有己知量的咪唑立賓和/或利巴韋林的試劑，優(yōu)選為含有pH緩沖劑；疊氮化鈉、抗生素等防腐劑；糖等穩(wěn)定劑的試劑。含有pH緩沖劑的情況下，其種類、濃度等條件等與本發(fā)明的測定方法的工序(l)的情況相同。含有疊氮化鈉、抗生素等的情況下，只要具有防腐效果，則對其種類、濃度沒有限定，例如以疊氮化鈉為例，下限為0.005%以上，優(yōu)選為0.01%以上，進(jìn)一步優(yōu)選為0.03%以上；上限為1%以下，優(yōu)選為0.5%以下，進(jìn)一步優(yōu)選為0.1%以下。例如以抗生物質(zhì)為例，下限為5pg/ml以上，優(yōu)選為10jig/ml以上，進(jìn)一步優(yōu)選為30嗎/ml以上；上限為100嗎/ml以下，優(yōu)選為75嗎/ml以下，進(jìn)一步優(yōu)選為60pg/ml以下。含有穩(wěn)定劑的情況下，其種類、濃度等條件等與上述第一酶的穩(wěn)定劑相同。校準(zhǔn)方法可以選擇單點檢測法、多點檢測法(折線或樣條(？y，<》))或多點檢測的線性回歸等。對于該已知量沒有特別限制，只要選擇能夠準(zhǔn)確測定試樣中的咪唑立賓和/或利巴韋林的量即可。另外，使用兩個以上的標(biāo)準(zhǔn)試劑的情況下，標(biāo)準(zhǔn)試劑的已知量也相同。例如以咪唑立賓為例時，下限為0.0(Vg/ml以上，優(yōu)選為0.005嗎/ml以上，進(jìn)一步優(yōu)選為0.01iig/ml以上；上限為20嗎/ml以下，優(yōu)選為10|ig/ml以下，進(jìn)一步優(yōu)選為8pg/ml以下。本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林測定用組合物和標(biāo)準(zhǔn)試劑可以以液態(tài)品、液態(tài)品的冷凍物、液態(tài)品的冷凍干燥品或液態(tài)品的干燥品(通過加熱干燥和/或風(fēng)干和/或減壓干燥等方式得到)的形式提供。優(yōu)選液態(tài)品的冷凍物，更優(yōu)選液態(tài)品的冷凍干燥品，最優(yōu)選液態(tài)品。作為其他方式，有時也優(yōu)選液態(tài)品的冷凍物。作為其他的其他方式，有時優(yōu)選液態(tài)品的冷凍千燥品。本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林測定用組合物可以是單試劑的組合物，但通常優(yōu)選上述那樣分成二試劑以上。另外，基于提高試劑的品質(zhì)等目的，可以在其中混合NaCl、KC1等鹽；TX-IOO、Tween20等表面活性劑；和/或疊氮化鈉、抗生素等防腐劑。另夕卜，例如用于POC的毛細(xì)管柱或者作為酶傳感器使用的情況下，優(yōu)選各成分的濃度大于平時的濃度，例如優(yōu)選進(jìn)行固定化、或吸印在紙張或膜、或制成凝膠-溶膠狀組合物使用?；旌消}的情況下，對鹽的種類、濃度沒有限定，通常的范圍為5200mM，混合表面活性劑的情況下，對表面活性劑的種類、濃度沒有限定，通常為0.001%2%，混合防腐劑的情況下，與上述標(biāo)準(zhǔn)試劑的情況相同。下面對本發(fā)明的第一酶的制造方法進(jìn)行說明。對于本發(fā)明的第一酶來說，可通過公知的方法由自然界尋找(篩選)形成該第一酶的天然生物，并從該生物的細(xì)胞獲得第一酶。該生物只要是形成能催化第一反應(yīng)的酶的生物，則沒有限制，例如可以舉出包括真正細(xì)菌、真核生物或者古細(xì)菌的微生物。以微生物作為篩選對象的情況下，利用公知的方法，從自然界分離微生物即可，可以從包括高溫、低溫、高壓、酸、堿性環(huán)境等極限環(huán)境的土壤、水中；含有降落菌、冰核等的空中；以及生物的體內(nèi)等得到。特別是從高溫環(huán)境分離的微生物，可以期待從這樣的微生物得到穩(wěn)定性高的第一酶。另外，微生物還可以從ATCC、DSM等菌種庫購買。分離的微生物經(jīng)極限稀釋法、形成單菌落等公知的方法進(jìn)行純分離，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基等進(jìn)行純培養(yǎng)，確認(rèn)該培養(yǎng)物中有無能夠?qū)溥蛄①e和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的酶活性，由此可篩選形成第一酶的生物。另外，還可由使用咪唑立賓和/或利巴韋林的富集培養(yǎng)得到微生物、向培養(yǎng)基添加咪唑立賓和/或利巴韋林來誘導(dǎo)產(chǎn)生第一酶等，這些是可以提高篩選效率的方法。根據(jù)非專利文獻(xiàn)1公開的方法等，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確認(rèn)有無第一酶。分離的菌株的鑒定可以按照實驗書(鈴木健一朗等、微生物^分類*同定実験法一分子遺伝學(xué)*分子生物學(xué)的手法^中心^(微生物的分類'鑒定實驗法—以分子遺傳學(xué)'分子生物學(xué)的方法為主)，Springer-Verlag東京)等進(jìn)行，另外，還可以使用市售的各種菌株鑒定試劑盒(曰本BIOMERIEUX社等)，還可委托財團(tuán)法人日本食品分析中心(東京都涉谷區(qū)元代代木町52番1號)等鑒定。如此得到的形成第一酶的天然微生物還可以進(jìn)一步用NTG等藥劑、紫外線和/或放射線進(jìn)行處理而制成變異株。該變異株有的能提高第一酶的生產(chǎn)率，有的能形成第一酶的變異體，還可能形成具有優(yōu)異的穩(wěn)定性、生產(chǎn)率、反應(yīng)性等性質(zhì)的變異體。另外，可以使用上述的第一酶或形成該第一酶的天然微生物，通過蛋白質(zhì)序列、DNA序列或公知基因工學(xué)方法獲得編碼所得到的該第一酶的堿基序列或其信息。本發(fā)明的第一酶也可通過公知的生物信息學(xué)方法獲得。序列表序列編號1和序列表序列編號2是作為本發(fā)明的測定方法的工序(l)中優(yōu)選的實例的第一酶的氨基酸序列和堿基序列，所以可以以査詢(query)的方式在NCBI、EMBL、GenomeNet等數(shù)據(jù)庫用BLAST搜索等對這些序列進(jìn)行同源檢索，從而獲得具有與序列表序列編號1或序列表序列編號2—致或類似的氨基酸序列或堿基序列的蛋白質(zhì)或基因即有產(chǎn)生第一酶的可能性的生物的信息或基因信息。該酶的制造方法包括獲得基于利用上述的方法得到的形成第一酶的天然微生物、第一酶的堿基序列或堿基序列的信息形成的該酶的工序，利用該酶的制造方法可以獲得該第一酶。作為形成該第一酶的工序，可以舉出例如含有編碼該酶的堿基序列的無細(xì)胞酶合成系，優(yōu)選舉出使用含有編碼該酶的堿基序列的細(xì)胞的工序、使用形成該酶的天然微生物等具有編碼該酶的堿基序列的微生物的工序、使用導(dǎo)入有編碼該酶的堿基序列的轉(zhuǎn)化體的工序等。采用含有編碼第一酶的堿基序列的無細(xì)胞酶合成系的情況下，將編碼上述第一酶的堿基序列用于來源于小麥胚芽、來源于大腸桿菌、來源于兔子網(wǎng)狀紅血球或來源于昆蟲細(xì)胞等公知的無細(xì)胞酶合成系即可。另外，采用使用含有編碼該酶的堿基序列的細(xì)胞的工序的情況下，例如，可以將上述編碼第一酶的堿基序列插入載體，導(dǎo)入宿主微生物，制成轉(zhuǎn)化體，使用該轉(zhuǎn)化體形成該酶。導(dǎo)入有編碼第一酶的堿基序列的轉(zhuǎn)化體包括將插入了該堿基序列的載體即重組噬菌體或重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主而成的細(xì)胞或者微生物。編碼第一酶的堿基序列可以合成部分或全部來使用，優(yōu)選使用公知的方法從基因供體獲得編碼第一酶的堿基序列。作為基因供體，只要是能形成第一酶的細(xì)胞，則沒有限定，優(yōu)選以上述篩選方法篩選出的天然的微生物、包括用生物信息學(xué)方法獲得信息的生物在內(nèi)的形成第一酶的生物。作為插入編碼第一酶的堿基序列的載體，優(yōu)選在宿主微生物體內(nèi)能夠自律增殖的用于基因重組而構(gòu)建的噬菌體或質(zhì)粒，作為噬菌體載體，例如以屬于大腸桿菌的微生物為宿主的情況下，可以使用XgtAC、人gfXB等。另外，作為質(zhì)粒載體，例如以大腸桿菌為宿主的情況下，可以使用Novagen社的pET載體或pBR322、pBR325、pACYC184、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pUC118、pINI、BluescriptKS十；以枯草桿菌為宿主的情況下，可以使用pWH1520、pUB110、pKH300PLK;以放線菌為宿主的情況下，可以使用pIJ680、pIJ702;以酵母特別是釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)為宿主的情況下，可以使用YRp7、pYCl、YEpl3等。本發(fā)明中，優(yōu)選以大腸桿菌為宿主的質(zhì)粒載體。啟動子只要是能夠在宿主中表達(dá)的，則沒有特別限制。利用限制性內(nèi)切酶切斷上述載體，使其生成的末端與通過用于切斷編碼第一酶的堿基序列的限制性內(nèi)切酶所生成的堿基序列末端相同，制成載體片段，根據(jù)常規(guī)方法，將編碼第一酶的堿基序列的片段和載體片段用DNA連接酶連接，將編碼第一酶的堿基序列插入目的載體，制成重組噬菌體或重組質(zhì)粒。作為導(dǎo)入重組質(zhì)粒的宿主，只要是重組質(zhì)?？煞€(wěn)定且自律增殖的細(xì)胞或微生物即可，例如宿主微生物是屬于大腸桿菌的微生物時，可以使用包括大腸桿菌BL21、大腸桿菌DH1、大腸桿菌JM109、大腸桿菌JM101、大腸桿菌W3110、大腸桿菌C600等的大腸桿菌B株、K株、C株或它們的溶原菌。另外，宿主微生物是屬于芽孢桿菌屬的微生物時，可以使用枯草桿菌、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)等；宿主微生物是屬于放線菌的微生物時，可以使用變鉛青鏈霉菌(Streptomyceslividans)TK24等；宿主微生物是屬于釀酒酵母菌的微生物時，可以使用釀酒酵母菌INVSC1等。本發(fā)明優(yōu)選以大腸桿菌為宿主微生物。作為可以使用導(dǎo)入有編碼第一酶的堿基序列的轉(zhuǎn)化體形成該酶的優(yōu)選的其他例子，可以舉出形成紅球菌屬細(xì)菌的重組酶的方法(日本特許第3944577號公報、日本特許第3793812號公報)。具體地說，給出了如下方法在適合低溫形成重組酶的pTipQC1、pTipQC2等質(zhì)粒載體中插入編碼第一酶的堿基序列，將該重組質(zhì)粒導(dǎo)入溶菌酶敏感性微生物，形成轉(zhuǎn)化體，從而使用該轉(zhuǎn)化體。作為溶菌酶敏感性微生物，優(yōu)選屬于紅球菌屬的微生物(日本特許第3876310號公報)。形成第一酶的天然微生物、導(dǎo)入有編碼該酶的堿基序列的轉(zhuǎn)化體等的培養(yǎng)條件可以考慮其營養(yǎng)生理性質(zhì)來選擇，通常進(jìn)行液體培養(yǎng)，工業(yè)上進(jìn)行深層通氣攪拌培養(yǎng)是有利的。作為培養(yǎng)基的營養(yǎng)源，可以廣泛使用通常用于微生物培養(yǎng)的物質(zhì)。培養(yǎng)溫度可以在作為宿主的微生物發(fā)育、能形成第一酶的范圍進(jìn)行適當(dāng)變更，宿主為大腸桿菌時，溫度下限為l(TC以上，優(yōu)選為2(TC以上，進(jìn)一步優(yōu)選為25。C以上；上限為45。C以下，優(yōu)選為42"C以下，進(jìn)一步優(yōu)選為38r以下。宿主為放線菌時，下限為fC以上，優(yōu)選為10。C以上，進(jìn)一步優(yōu)選為20。C以上；上限為50。C以下，優(yōu)選為42。C以下，進(jìn)一步優(yōu)選為37r以下。培養(yǎng)條件因條件而多少有些不同，估算第一酶達(dá)到最高形成量的時期，在適當(dāng)?shù)臅r期結(jié)束培養(yǎng)即可，宿主為大腸桿菌時，通常下限為IO小時以上，優(yōu)選為12小時以上，進(jìn)一步優(yōu)選為17小時以上；上限為60小時以下，優(yōu)選為48小時以下，進(jìn)一步優(yōu)選為30小時以下。宿主為放線菌時，通常下限為17小時以上，優(yōu)選為20小時以上，進(jìn)一步優(yōu)選為24小時以上；上限為80小時以下，優(yōu)選為72小時以下，進(jìn)一步優(yōu)選為48小時以下。培養(yǎng)基的pH可以在細(xì)菌發(fā)育并形成第一酶的范圍進(jìn)行適當(dāng)變更，宿主是大腸桿菌、放線菌的情況下優(yōu)選下限為pH5.8以上，更優(yōu)選為pH6.2以上，上限為pH8.5以下，優(yōu)選為pH7.5以下。第一酶可以通過包括獲得如上形成的第一酶的工序的方法來制造，其可以直接是含有簡單的殺菌或沒殺菌的菌體的細(xì)胞等，但優(yōu)選制成簡單除去了培養(yǎng)雜質(zhì)、細(xì)胞破碎物等的含有雜質(zhì)的酶。另外，第一酶的粗酶優(yōu)選根據(jù)目的、用途等制成實質(zhì)上不含雜質(zhì)的酶，通?？梢耘e出制成例如50%以上、70%以上、95%以上的各種純度。純度可通過SDS-PAGE、HPLC等公知方法確認(rèn)。利用培養(yǎng)上述篩選出來的天然微生物、導(dǎo)入有編碼該酶的堿基序列的轉(zhuǎn)化體的微生物等進(jìn)而獲得第一酶的方法來制造第一酶的情況下，首先將該微生物等用營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，使菌體內(nèi)或培養(yǎng)液中形成該酶，在菌體內(nèi)形成該酶的情況下，培養(yǎng)結(jié)束后，通過過濾或離心分離等手段從所得到的培養(yǎng)物中收集菌體。接下來將該菌體用機(jī)械方法或溶菌酶等酶方法破壞，并根據(jù)需要添加EDTA和/或適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┑?，濃縮或不濃縮該酶的條件下，實施利用丙酮、甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑的分級沉淀法；利用硫酸銨、食鹽等的鹽析法等，使第一酶沉淀從而回收。根據(jù)需要，對該沉淀物進(jìn)行透析、等電點沉淀后，可以通過凝膠過濾、親和層析法等吸附層析法、離子交換層析法、疏水層析法進(jìn)行處理，得到第一酶。另外，還可適當(dāng)組合這些方法。另外，在培養(yǎng)液中形成本發(fā)明的酶的情況下，通過過濾或離心分離等手段從培養(yǎng)物中除去菌體，對培養(yǎng)液進(jìn)行與上述本發(fā)明的酶形成在菌體內(nèi)時相同的處理即可。對于如此得到的第一酶，加入或不加入各種鹽類、糖類、酶、脂質(zhì)、表面活性劑等作為穩(wěn)定劑或賦形劑，通過超濾濃縮、冷凍干燥等方法可以得到液態(tài)或固態(tài)的第一酶，另外，適宜進(jìn)行冷凍干燥的情況下，可以添加0.510°/。左右的蔗糖、甘露醇、食鹽、白蛋白等作為穩(wěn)定劑或賦形劑。形成本發(fā)明的第一酶的天然微生物的典型例是泰國伯克霍爾德氏菌DSM13276株。本發(fā)明的測定方法的工序(l)中的第一酶的氨基酸序列的典型例是序列表序列編號1的氨基酸序列。編碼該氨基酸序列的堿基序列的一個例子是序列表序列編號2的堿基序列。根據(jù)H.S.Stanley等、BMCGenomics,6巻、174頁、2005年的發(fā)表內(nèi)容，通過泰國伯克霍爾德氏菌DSM13276株的全基因組解析查明了該堿基序列，但迄今一直沒有闡明該堿基序列編碼的酶的性質(zhì)，僅是簡單推測其類似于核糖激酶。即，以往完全不知道序列表序列編號2的堿基編碼的序列表序列編號1的氮基酸序列對針對咪唑立賓和/或利巴韋林的反應(yīng)有催化作用。下面對本發(fā)明的第二酶的制造方法進(jìn)行說明。本發(fā)明的第二酶與上述第一酶的情況相同，可以通過公知的方法，從自然界尋找形成該第二酶的天然生物，從該生物的細(xì)胞中獲得本發(fā)明的第二酶。咪唑立賓和/或利巴韋林對該第二酶的抑制可以通過例如比較該第二酶在存在和不存在咪唑立賓和/或利巴韋林的情況下的反應(yīng)速度之差來加以確認(rèn)。磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林對第二酶的抑制可以通過比較第二酶的反應(yīng)速度、例如該第二酶在存在和不存在磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的情況下的反應(yīng)速度之差來加以確認(rèn)。計算抑制常數(shù)進(jìn)行比較的情況下，可以根據(jù)蛋白質(zhì)'酶的基礎(chǔ)實驗法(參照修訂第2版、堀尾武一、1994年、南光堂)所記載的方法等進(jìn)行計算、確認(rèn)。磷酸咪唑立賓或磷酸利巴韋林可以通過后述的將咪唑立賓和/或利巴韋林制成磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的制造方法制造，也可以通過ShutoS.等、J.Chem.Soc.、PerkinTrans.1巻、3603頁、2000年所記載的方法合成。第二酶的堿基序列獲得方法、生物信息學(xué)方法得到的堿基序列和產(chǎn)生該酶的生物的信息的獲得方法、形成方法以及利用包括獲得工序的方法的制造方法等與上述第一酶的情況相同。本發(fā)明的第二酶的典型例是肌苷5'—磷酸脫氫酶。形成本發(fā)明的第二酶的天然微生物的典型例是枯草桿菌ATCC23857株或OceanobacillusiheyensisDSM14731株。本發(fā)明的測定方法的工序(2)中的第二酶的氨基酸序列的典型例是序列表序列編號7或序列表序列編號9的氨基酸序列。編碼該氨基酸序列的堿基序列的一個例子是序列表序列編號8或序列表序列編號10的堿基序列。根據(jù)WuT.W.等、Can.J.Biochem.、51巻、1391頁、1973年的發(fā)表內(nèi)容，表明序列表序列編號8的堿基序列編碼肌苷5'一磷酸脫氫酶，但是以往完全不知道該肌苷5'—磷酸脫氫酶不受咪唑立賓和利巴韋林這兩者抑制而受磷酸咪唑立賓和磷酸利巴韋林這兩者抑制。另外，根據(jù)TakamamiH.等、Nucleic.Acids.Res.、30巻、3927頁、2002年的發(fā)表內(nèi)容，通過OceanobacillusiheyensisDSM14731株的全基因組解析查明了序列表序列編號10的堿基序列，但是迄今一直沒有闡明該堿基序列編碼的酶的性質(zhì)，以往尚不知道序列表序列編號io的堿基編碼的序列表序列編號9的氨基酸序列是肌苷5'—磷酸脫氫酶。另外，以往完全不知道該酶不受咪唑立賓和利巴韋林這兩者抑制而受磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林這兩者抑制。實施例下面基于實施例等對本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明的范圍不應(yīng)解釋為僅限于下述實施例等。此外，記為"通過常規(guī)方法"的技術(shù)是可以按照例如Maniatis等的方法(Maniatis,T.等，分子克隆，冷泉港實驗室，l982年、1989年)、上述的蛋白質(zhì)'酶的基礎(chǔ)實驗法、市售的各種酶或試劑盒類中附帶的操作方法實施的。另外，由于測定條件、使用機(jī)器的精度等，下面給出的測定值等有可能有變化。此外，沒有特別指出的話，本發(fā)明使用的試劑類為和光純藥工業(yè)株式會社、SIGMA-ALDRICH公司、Takara-Bio株式會社等的制品，可以使用易于從市售獲得的試劑。DSM菌株可以在DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH購買。ATCC菌株可以在AmericanTypeCultureCollection購買。對試劑的生產(chǎn)商、純度等沒有特別限制。另外，本發(fā)明中使用的血清等生物材料是市售品、或獲得了知情同意(在正確說明了使用目的的信息的基礎(chǔ)上得到了同意)的材料。本發(fā)明的第一酶的活性量是通過下述的活性測定法1或活性測定法3測定的，本發(fā)明的第二酶的活性量是通過下述的活性測定法2測定的。本發(fā)明的第一酶的活性測定法3的反應(yīng)工序少，能夠簡單地測定準(zhǔn)確的活性值。本發(fā)明的第一酶的活性測定法1能夠以任意物質(zhì)作為底物進(jìn)行測定。此外，本說明書中，需要明確本發(fā)明的第一酶的活性量時，沒有特別說明測定法時，全部換算成活性測定法1中的活性量進(jìn)行表示。換算時，可以用各測定方法測定相同的檢體，根據(jù)該值的變化量的比率進(jìn)行換算。由于測定條件、使用機(jī)器的精度等，變化量的比率有可能有變化，例如測定法h測定法3二0.7:3.0。[活性測定法l][反應(yīng)試劑混合液]20mMTris/HCl緩沖液pH7.520mM葡萄糖ImMATP(pH7)ImM氯化鎂ImMNADP50mMKC15U/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(旭化成制藥株式會社制造)5U/mlADP依賴性HK(旭化成制藥株式會社制造)ImM咪唑立賓在石英制的1.0cm比色杯中量取1.3ml反應(yīng)試劑混合液，在3TC預(yù)加熱2分鐘。加入0.03ml經(jīng)20mMTris/HCl緩沖液pH7.5稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛鹊牡谝幻溉芤海M(jìn)行混和，在37。C開始反應(yīng)。反應(yīng)開始后，測定340nm處的吸光度，求出線性反應(yīng)中每1分鐘的吸光變化。將求出的吸光變化記作As/min，將用精制水代替第一酶溶液的盲檢記作Ab/min，利用(式2)計算出酶活性(U/ml)。(式2)酶活性(U/ml)二{(As/min-Ab/min)/6.22}X1.33/0.03X稀釋倍數(shù)50mMTris/HCl緩沖液pH8.02mM肌苷5'—磷酸2mMNAD、50mMKCl在石英制的l.Ocm比色杯中量取2ml反應(yīng)試劑混合液，在37'C預(yù)加熱2分鐘。加入0.03ml經(jīng)50mMTris/HCl緩沖液pH8.0稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛鹊牡诙溉芤?，進(jìn)行混和，在37"C開始反應(yīng)。反應(yīng)開始后，測定340nm處的吸光度，求出線性反應(yīng)中每1分鐘的吸光變化。將求出的吸光變化記作As/min，將用精制水代替第二酶溶液的盲檢記作Ab/min，利用(式3)計算出酶活性(U/ml)。(式3)酶活性(U/ml)二{(As/min-Ab/min)/6.22}X2.03/0.03X稀釋倍數(shù)30mM磷酸鉀緩沖液pH7.010mMATP(pH7)20mM氯化鎂5mM肌苷50mM氯化鉀100mMTris/HCl緩沖液pH9.013U/ml實施例33制備的BsuIMPDH20mMNAD50mM氯化鉀ImMDTT200mMEDTA(pH9)在石英制的1.0cm比色杯中量取1.0ml反應(yīng)試劑混合液，在37。C預(yù)加熱2分鐘。加入0.01ml經(jīng)用30mM磷酸鉀緩沖液pH7.0稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛鹊谋景l(fā)明的酶溶液，進(jìn)行混和，在37"C開始反應(yīng)。反應(yīng)開始5分鐘后，混合2ml0.1N的鹽酸，結(jié)束反應(yīng)，測定550nm處的吸光度，求出吸光變化。將求出的吸光變化記作As/min，將用精制水代替第一酶溶液的盲檢記作Ab/min，利用(式4)計算出酶活性(U/ml)。(式4)酶活性(U/ml)二{(As/min-Ab/min)/19}X3.01/0.01X稀釋倍數(shù)本發(fā)明的第一酶和第二酶等的蛋白質(zhì)濃度通過常規(guī)方法使用Bio-Rad社的蛋白定量試劑盒進(jìn)行測定，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計算。<能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶的尋找1〉將通過常規(guī)方法從糞肥中分離的微生物用含有0.5%的肌苷的100mlLB培養(yǎng)基在37。C培養(yǎng)17小時，經(jīng)離心分離得到菌體。將菌體用10ml的10mMTris/HCl緩沖液pH7.5懸浮，進(jìn)行超聲波破碎，經(jīng)離心分離得到粗酶液。在500^1下述的反應(yīng)液中添加1(^1粗酶液，在37'C反應(yīng)30分鐘。用精制水將反應(yīng)后的反應(yīng)液稀釋10倍，用HPLC對25^1進(jìn)行分離。HPLC使用昭和電工社制的AsahipakGS-320,移動相為200mM磷酸鈉緩沖液pH3.0，流速為0.5ml/min，在室溫實施分離，監(jiān)視260nm的吸光，檢測到能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的活性即本發(fā)明的第一酶的活性，所以篩選該微生物為形成第一酶的微生物。使10ml上述的粗酶液吸附于經(jīng)10mM的Tris/HCl緩沖液pH8.0平衡化的Qs印.FF(通用電氣醫(yī)療生物科學(xué)社制造)。用10mM的Tris/HCl緩沖液pH8.0充分清洗后，使用含有O和0.5M的KC1的10mM的Tris/HCl緩沖液pH8.0進(jìn)行線性梯度洗脫。在活性組分中添加硫酸銨，使其最終濃度為15%，使其吸附于經(jīng)含有15%硫酸銨的lOmM磷酸鉀緩沖液pH7.5平衡化的Phenylsep.FF(通用電氣醫(yī)療生物科學(xué)社制造)，使用含有15%和0%的硫酸銨的lOmM磷酸鉀緩沖液pH7.5進(jìn)行線性梯度洗脫?；钚越M分用經(jīng)lOmM磷酸鉀緩沖液pH7.5平衡化的G-25(通用電氣醫(yī)療生物科學(xué)社制造)脫鹽后，使其吸附于經(jīng)10mM磷酸鉀緩沖液pH7.5平衡化的ResourceQ(通用電氣醫(yī)療生物科學(xué)社制造)。用10mM磷酸鉀緩沖液pH7.5充分清洗后，使用含有0和0.5M的KC的10mM磷酸鉀緩沖液pH7.5進(jìn)行線性梯度洗脫?；钚越M分用經(jīng)10mM磷酸鉀緩沖液pH7.0平衡化的G-25脫鹽，得到第一酶。將該酶用SDS-PAGE分離，使主要蛋白吸印在PVDF膜上，進(jìn)行蛋白質(zhì)測序，結(jié)果證明了本實施例得到的本發(fā)明的第一酶是大腸桿菌的鳥苷肌苷激酶。本實施例得到的第一酶的比活性為0.01U/mg以下。于是，根據(jù)H.Kawasaki等、Biosci.Biotechnol.Biochem.、64巻、972頁、2000年記載的方法，制備大腸桿菌JM109的大量表達(dá)鳥苷肌苷激酶的轉(zhuǎn)化體，獲取該鳥苷肌苷激酶，檢測能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶活性，結(jié)果得到了與上述相同的結(jié)果。10mMTris/HCl緩沖液pH7.5、30mMKC1、5mM氯化鎂、5mMATPpH7、lmMDTT、lmM咪唑立賓。<能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶的尋找2>根據(jù)ThomasHansen等、Extr畫philes、11巻、105-114頁、2007年所記載的方法，制備來源于詹氏甲烷球菌的磷酸果糖激酶-B(Phosphofmctokinase-B)。具體地說，以詹氏甲垸球菌DSM2661株作為模板，使用序列表序列編號13和序列表序列編號14的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增基因連接于pET17b，轉(zhuǎn)化在大腸桿菌BL21(DE3)中。將轉(zhuǎn)化體用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)該基因編碼的磷酸果糖激酶-B，用與上述實施例1相同的方法精制該酶。通過與上述實施例1相同的HPLC，確認(rèn)到精制酶具有能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶活性即本發(fā)明的第一酶的活性。本實施例得到的第-一酶的比活性約為0.02U/mg。[實施例3]<能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶的尋找3〉以閃爍古生球菌DSM4304株作為模板，使用序列表序列編號15和序列表序列編號16的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增基因連接于pET21a(+)，轉(zhuǎn)化在大腸桿菌BL21(DE3)中。將轉(zhuǎn)化體用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)該基因編碼的酶，用與上述實施例1相同的方法精制該酶。通過與實施例1相同的HPLC，確認(rèn)到精制酶具有能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶活性即本發(fā)明的第一酶的活性。本實施例得到的第一酶的比活性為0.01U/mg以下。<能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶的尋找4〉參考B.Sahin等、Eur.J.Biochem、271巻、3547頁、2004年中記載的方法，制備來源于小鼠的腺苷激酶。具體地說，以小鼠腦的cDNA(Clontech社)作為模板，使用序列表序列編號17和序列表序列編號18的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增基因連接于pET21a(+)，轉(zhuǎn)化在大腸桿菌BL21(DE3)中。將轉(zhuǎn)化體用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)該基因編碼的酶，用與上述實施例l'相同的方法精制該酶。通過與實施例1相同的HPLC，確認(rèn)到精制酶具有能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶活性即本發(fā)明的第一酶的活性。本實施例得到的第一酶的比活性為0.01U/mg以下，與實施例2得到的第一酶的反應(yīng)速度相比，反應(yīng)速度約為其二分之一。另外，來源于小鼠的腺苷激酶和來源于人的腺苷激酶的氨基酸序列的相同性近似約90%，保存了活性中心的氨基酸，所以推測來源于小鼠的腺苷激酶和來源于人的腺苷激酶的性質(zhì)相同(Structure、1998年、6巻、183-193頁等)。即，來源于人的腺苷激酶也可以與來源于小鼠的腺苷激酶同樣地成為本發(fā)明的第一酶，據(jù)推測比活性為0.01U/mg以下，但實施例2得到的第一酶的反應(yīng)速度好，約為二倍。[實施例5]<能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶的尋找5〉將泰國伯克霍爾德氏菌DSM13276株用含有0.5%的肌苷的100mlLB培養(yǎng)基在3(TC培養(yǎng)2天，進(jìn)行離心分離，得到菌體。將菌體用10ml的10mMTris/HCl緩沖液pH7.5懸浮，進(jìn)行超聲波破碎，經(jīng)離心分離得到粗酶液。通過與實施例1相同的HPLC，確認(rèn)到粗酶液具有能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶活性即本發(fā)明的第一酶的活性。[實施例6]<DNA的提取〉使用LB培養(yǎng)基，在3(TC培養(yǎng)泰國伯克霍爾德氏菌DSM13276株2天，對經(jīng)集菌的菌體用含有50mMTris/HCl緩沖液pH8.0、50mMEDTA、15%蔗糖的lmg/ml溶菌酶溶液于37。C處理IO分鐘后，添加SDS,使其最終濃度為0.25%，溶解菌體。另外，加入等量的苯酚/三氯甲垸的1:1混合液，攪拌30分鐘后，進(jìn)行離心分離(12,000rpm、15分鐘)，回收水層。在回收的水層中混合十分之一量的3M乙酸鈉(pH5.5)后，輕輕地添加2倍量的乙醇，用玻璃棒巻起基因組DNA進(jìn)行分離。將經(jīng)分離的基因組DNA溶解在10mMTris/HCl緩沖液pH8.0、lmMEDTA水溶液(以下有時記作TE)中，加入適量的RNaseA，在37。C保溫1小時，分解混合存在的RNA。接下來，加入等量的苯酚/三氯甲垸的1:l混合液，進(jìn)行與上述相同的處理，分取水層。在分取的水層中加入十分之一量的3M乙酸鈉(pH5.5)和2倍量的乙醇，用上述方法再次分離基因組DNA。將該染色體溶解于TE中，加入TE飽和的苯酚和三氯甲垸的1:1混合液，將全部懸浮后，反復(fù)進(jìn)行相同的離心分離，將上層再次轉(zhuǎn)移到其他的容器。在該分離的上層中加入3M乙酸鈉緩沖液(pH5.5)和乙醇，攪拌后在-70。C冷卻5分鐘，然后進(jìn)行離心分離(2，000G、4°C、15分鐘)，將沉淀的染色體用75%乙醇清洗，進(jìn)行減壓干燥。通過以上的操作，得到了泰國伯克霍爾德氏菌DSM13276株的DNA標(biāo)準(zhǔn)品。[實施例7]<利用PCR法進(jìn)行序列表序列編號2所示基因的擴(kuò)增>設(shè)計序列表序列編號3和序列表序列編號4的引物，以便在pTipQC1或pTipQC2(日本特許第3944577號公報以及日本特許第3793812號公報)的多克隆位點Ndel和BamHI部位插入序列表序列編號2的基因。PCR使用KODDNA聚合酶(東洋紡社制造)。PCR條件依照使用說明書記載的方法。所得到的約l.Okbp的PCR產(chǎn)物按常規(guī)方法精制。[實施例8]<與表達(dá)載體的連接〉按照常規(guī)方法，用Ndel和BamHI對實施例7中精制的PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理，制成插入片段。將經(jīng)常規(guī)方法精制的插入片段與用Ndel和BamHI進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理后精制的pTipQC1或pTipQC2用常規(guī)方法連接，制成pTipQCl/BthNK和pTipQC2/BthNK。通過常規(guī)方法將pTipQCl/BthNK和pTipQC2/BthNK導(dǎo)入大腸桿菌DH5a，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過DNA測序確認(rèn)到由利用菌落直接PCR法得到的陽性克隆精制的重組質(zhì)粒的插入片段序列是正確的。[實施例9]<pTipQCl/BthNK以及pTipQC2/BthNK在紅串紅球菌中的轉(zhuǎn)化〉pTipQCl/BthNK以及pTipQC2/BthNK在紅串紅球菌中的轉(zhuǎn)化是按照曰本特開2004-073116號公報等所記載的方法利用電穿孔法(electroporation)實施的。電穿孔條件如下。融化感受態(tài)細(xì)胞，與p丁ipQC1/BthNK或pTipQC2/BthNK混合，放入2mm的專用杯，在7.5mS、2500V、25|iF、400Q的條件下施加脈沖。[實施例10]<表達(dá)確認(rèn)>將實施例9得到的轉(zhuǎn)化體接種于含有34pg/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基中，在30。C培養(yǎng)2天，制成種子。在含有34^ig/ml氯霉素和lpg/ml硫鏈絲菌素的LB培養(yǎng)基中接種1/10量的上述種子，在3(TC培養(yǎng)1天。離心分離培養(yǎng)液，進(jìn)行集菌，懸浮于培養(yǎng)液的1/5倍量的20mMTris/HCl緩沖液pH7.5中，進(jìn)行超聲波破碎，經(jīng)離心分離，將得到的上清作為粗酶液。粗酶液的SDS-PAGE結(jié)果見圖1，確認(rèn)到酶的大量表達(dá)。此外，圖1(A)中箭頭和圖l(B)中箭頭分別是在pTipQCl/BthNK、pTipQC2/BthNK的轉(zhuǎn)化體中表達(dá)的第一酶(BthNK)(能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶)。[實施例ll]<由pTipQCl/BthNK轉(zhuǎn)化體精制能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶〉使實施例10中培養(yǎng)pTipQCl/BthNK轉(zhuǎn)化體所得到的粗酶液吸附于用含有0.1M氯化鎳以及0.3M氯化鈉的50mM磷酸緩沖液pH8.0平衡化的CheratingSepharoseFF(通用電氣醫(yī)療生物科學(xué)社制造)。用含有0.3M氯化鈉的50mM的磷酸緩沖液pH8.0充分清洗后，用含有10%甘油和0.3M氯化鈉的50mM磷酸緩沖液pH6.0充分清洗。用含有0.4M咪唑、10%甘油和0.3M氯化鈉的50mM磷酸緩沖液pH6.0洗脫。活性組分用含有0.03M氯化鈉、0.05MKC1和lmMDTT的30mM磷酸緩沖液pH7.0透析，得到第一酶(BthNK)(能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶)。本實施例得到的BthNK的比活性約為0.04U/mg。1L的培養(yǎng)得到約80mgBthNK。[實施例12]<由pTipQC2/BthNK轉(zhuǎn)化體精制能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶>使實施例10中培養(yǎng)pTipQC2/BthNK轉(zhuǎn)化體所得到的粗酶液吸附于用10mM的Tris/HCl緩沖液pH8.0平衡化的Qsep.BB(通用電氣醫(yī)療生物科學(xué)社制造)。用10mM的Tris/HCl緩沖被pH8.0充分清洗后，使用含有0和0.5MKC1的lOmM的Tris/HCl緩沖液pH8.0進(jìn)行線性梯度洗脫。在活性組分中添加硫酸銨，使其最終濃度為15%，使活性組分吸附于用含有15%的硫酸銨的10mM磷酸鉀緩沖液pH7.5平衡化的Phenylsep.FF，使用含有15%和0%的硫酸銨的lOmM磷酸鉀緩沖液pH7.5進(jìn)行線性梯度洗脫?；钚越M分用經(jīng)10mM磷酸鉀緩沖液pH7.5平衡化的G-25脫鹽后，使其吸附于用10mM磷酸鉀緩沖液pH7.5平衡化的DEAEsep.FF(通用電氣醫(yī)療生物科學(xué)社制造)。用lOmM磷酸鉀緩沖液pH7.5充分清洗后，使用含有0和0.5MKC1的10mM磷酸鉀緩沖液pH7.5進(jìn)行線性梯度洗脫?；钚越M分用經(jīng)10mM磷酸鉀緩沖液pH7.0平衡化的G-25脫鹽，得到第一酶(BthNK)(能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶)。本實施例得到的BthNK的比活性約為0.04U/mg。1L的培養(yǎng)得到約50mgBthNK。[實施例13]<使用了pET系統(tǒng)的能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶的表達(dá)>通過常規(guī)方法將實施例7得到的插入片段與用Ndel和BamHI進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理后精制的pET21a(+)連接，制成pET21a(+)/BthNK。通過常規(guī)方法將pET21a(+)/BthNK導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過DNA測序確認(rèn)到由利用菌落直接PCR法得到的陽性克隆精制的重組質(zhì)粒的插入片段序列是正確的。將所得到的轉(zhuǎn)化體接種到含有50pg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中。在3(TC培養(yǎng)1天，制成種子。在含有50嗎/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中接種1/100量的上述種子，在3(TC培養(yǎng)一天。加入IPTG，使培養(yǎng)液中的濃度為lmM，進(jìn)一步在3(TC培養(yǎng)3小時。對培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離而集菌，懸浮于培養(yǎng)液的1/5倍量的20mMTris/HCl緩沖液pH8.5中，進(jìn)行超聲波破碎，經(jīng)離心分離，將得到的上清作為粗酶液。粗酶液的SDS-PAGE結(jié)果見圖2，確認(rèn)到酶的大量表達(dá)。此外，圖中箭頭是本發(fā)明的第一酶(能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶)。粗酶液以與實施例12相同的方法精制。本實施例得到的第一酶(BthNK)(能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶)的比活性約為0.04U/mg。1L的培養(yǎng)得到約50mgBthNK。<咪唑立賓的磷酸化方法和磷酸咪唑立賓的制造〉在500(^1實施例1所述的反應(yīng)液中加入10^1用10mMTris/HCl緩沖液pH7.5稀釋的實施例12中制備的BthNK，在37。C反應(yīng)30分鐘。通過與實施例1相同的HPLC分離反應(yīng)后的反應(yīng)液。反應(yīng)后的色譜圖見圖3(C)，反應(yīng)前的色譜圖見圖3(B)。圖3(A)是在相同的HPLC條件下用HPLC對標(biāo)準(zhǔn)品的磷酸咪唑立賓進(jìn)行分離得到的色譜圖。確認(rèn)到實施例12中制備的BthNK具有能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶活性。同樣，也確認(rèn)到實施例13中制備的BthNK具有能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶活性。[實施例15]<底物特異性〉使用由實施例12制備的BthNK。使用表l中的各底物代替咪唑立賓，利用上述的活性測定法1測定BthNK的相對活性。表1給出比較了相對活性的底物特異性。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>本實施例的結(jié)果表明，BthNK即本發(fā)明的第一酶(能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶)至少在磷酸供體存在下催化將核苷變成磷酸核苷的反應(yīng)。特別作用于腺苷、肌苷以及鳥苷，而實質(zhì)上(即在本實施例的條件下)不作用于胞苷和黃苷，也實質(zhì)上不作用于核糖。另外，本實施例的結(jié)果表明，BthNK即本發(fā)明的第一酶(能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶)催化將咪唑立賓和/或利巴韋林變成磷酸咪唑立賓和/或磷酸利巴韋林的反應(yīng)。[實施例16]<最適pH>使用由實施例12制備的BthNK。改變活性測定法3中的緩沖液，進(jìn)行活性測定，測定最適pH，其中pH4.56.0的范圍使用檸檬酸/NaOH(圖4中用O表示)，pH6.07.5的范圍使用磷酸鉀緩沖液(圖4中用參表示)，pH7.09.0的范圍使用Tris/HCl緩沖液(圖4中用A表示)，pH9.5使用甘氨酸/NaOH緩沖液(圖4中用口表示)。圖4給出了以最大活性為100%的相對活性(％)。BthNK表現(xiàn)出最大活性的最適pH在pH5.57.5的范圍。[實施例17]〈pH穩(wěn)定性〉使用由實施例12制備的BthNK，測定pH穩(wěn)定性。將BthNK按pH稀釋到lOOmM下述緩沖液中，使?jié)舛葹?.475mg/ml，在37。C加溫處理3小時后，用活性測定法3測定BthNK的殘存活性，其中，pH4.56.0的范圍使用檸檬酸/NaOH(圖5中用0表示)，pH6.07.5的范圍使用磷酸鉀緩沖液(圖5中用參表示)，pH7.09.0的范圍使用Tris/HCl緩沖液(圖5中用A表示)，pH9.511.0使用甘氨酸/NaOH緩沖液(圖5中用口表示)。如圖5所示，BthNK在37°C、3小時的條件下在pH610的范圍保持70%以上的活性。<熱穩(wěn)定性〉使用由實施例12制備的BthNK，測定熱穩(wěn)定性。將BthNK稀釋到100mM磷酸鉀緩沖液pH7.0中，使?jié)舛葹?.475mg/ml，在各溫度熱處理20分鐘后，用活性測定法3測定BthNK的殘存活性。如圖6所示，BthNK在100mM磷酸鉀緩沖液pH7.0的水溶液中，于50。C進(jìn)行20分鐘的熱處理時，保持80%以上的活性。[實施例19]<BthNK的分子量〉如圖7所示，由實施例12制備的BthNK的基于SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)的分子量約為34kDa。由序列表序列編號1的氨基酸序列得到的計算值為33994。[實施例20]<BthNK的作用溫度范圍〉用活性測定法3測定由實施例12制備的BthNK，其中，在1570°C的范圍改變反應(yīng)溫度，測定BthNK對肌苷進(jìn)行磷酸化的反應(yīng)速度(圖8)。對其結(jié)果做阿累尼烏斯圖，示于圖9。如圖8所示，作用溫度的范圍至少是1570。C。另外，由圖9可知，2045t:之間的活化能約為64kJ/mol。此外，圖9中T表示絕對溫度。另外，由圖8可見，在5(TC以上相對活性沒有提高，據(jù)認(rèn)為這是由于反應(yīng)液中的BthNK的穩(wěn)定性和ATP的分解導(dǎo)致的結(jié)果。<金屬的利用性>在使用了由實施例12制備的BthNK的下述[混合物]中，使用表2所示的金屬化合物，測定此時利用BthNK生成AMP的速度，以相對比的形式將其結(jié)果列于表2。在lml[混合物]中添加腺苷，使其最終濃度為lmM，在37。C對腺苷進(jìn)行30分鐘磷酸化。用精制水將磷酸化后的[混合物]稀釋10倍，將25夂d用HPLC分離。HPLC使用昭和電工社制的AsahipakGS-320，移動相使用200mM磷酸鈉緩沖液pH3.0，流速為0.5ml/min，在室溫實施分離，以260nm的吸光測定AMP的生成量。[混合物]50mMTris/HCl緩沖液pH7.52.5mMATP5mM表2所示的金屬化合物0.5mU/ml實施例12制備的BthNK表2金屬化合物相對比(％)氯化鎂90氯化錳100氯化鎳86氯化鈷85BthNK至少利用鎂離子、鈷離子、鎳離子或錳離子之中的任意一種以上。<Vmax和Km〉用活性測定法1測定由實施例12制備的BthNK，其中，在Km值的1/10倍10倍之間調(diào)整底物濃度為5個以上的不同濃度，利用Lineweaver-Burk倒數(shù)作圖法，計算各表觀的Vmax和Km值。其結(jié)果見表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>另外，利用其他方法測定由實施例12制備的BthNK對肌苷的Vmax和Km。30mM磷酸鉀緩沖液pH7.010mMATP(pH7)20mM氯化鎂5mM肌苷50mMKC11OOmMTris/HCl緩沖液pH9.013U/ml實施例33制備的BsuIMPDH20mMNAD50mMKC1lmMD丁T200mMEDTA(pH9)在石英制的1.0cm比色杯中量取l.Oml反應(yīng)試劑混合液1，在37°C預(yù)加熱2分鐘。加入0.05ml用30mM磷酸鉀緩沖液pH7.0稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛鹊腂thNK，進(jìn)行混和，在37。C開始反應(yīng)。5分鐘后混合l.Oml反應(yīng)試劑混合液2，測定340nm處的吸光度，求出吸光變化。在Km值的1/10倍10倍之間調(diào)整肌苷濃度和NAD濃度為5個以上的不同的濃度，根據(jù)Lineweaver-Burk倒數(shù)作圖法計算出對肌苷的Km和Vmax。其結(jié)果為，Vmax=1.59(imol/min/mg、Km二0,18jimol/min/mg。[實施例23]<核苷的磷酸化方法和磷酸核苷的制造>使用由實施例12制備的BthNK，制備下述的[組合物]作為核苷的磷酸化劑，實施腺苷的磷酸化方法，由腺苷制造磷酸腺苷(AMP)。在lml[組合物]中添加腺苷，使其最終濃度為lmM，在37。C實施30分鐘腺苷的磷酸化方法。用精制水將實施腺苷的磷酸化方法后的[組合物]稀釋10倍，將25pl用HPLC分離。與實施例1中記載的方法同樣地實施HPLC。實施腺苷的磷酸化方法后的色譜圖見圖IO(C)，實施前的色譜圖見圖IO(B)。圖IO(A)是在相同HPLC條件下對標(biāo)準(zhǔn)品的ATP、ADP、AMP以及腺苷組合物用HPLC進(jìn)行分離得到的色譜圖。用使用了本發(fā)明的能夠?qū)溥蛄①e進(jìn)行磷酸化的酶的核苷的磷酸化劑來實施腺苷的磷酸化方法，可以由腺苷制造磷酸腺苷(AMP)。盲檢使用精制水代替由實施例12制備的BthNK進(jìn)行實施，確認(rèn)到實施前后的色譜圖與圖IO(B)無變化。[組合物]50mMTris/HCl緩沖液pH7.52.5mMATP5mM氯化鎂0.5mU/ml由實施例12制備的BthNK[實施例24]<核苷混合物的測定〉使用由實施例12制備的BthNK，制成下述的[組合物]，實施腺苷、肌苷以及鳥苷的混合物的測定方法。測定中使用日立7080型自動分析機(jī)。參數(shù)如下試樣為5^1、Rl為100(xl[組合物l]、R2為10(V1[組合物2]、測定主波長為340nm、測定副波長為405nm，測定條件為1點終點法、10分鐘反應(yīng)、0-31，減去精制水產(chǎn)生的空白。試樣使用腺苷、肌苷以及鳥苷的l:1:l混合物，將合計濃度調(diào)整到圖11的橫軸范圍，測定結(jié)果見圖11。利用使用了BthNK的組合物實施了腺苷、肌苷以及鳥苷混合物的測定。需要說明的是，所謂l點終點法、IO分鐘反應(yīng)、0-31指的是測定機(jī)器(日立7080型自動分析機(jī))的測定方法之一，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過參照日立7080型自動分析機(jī)的操作說明書來理解。[組合物l]20mM磷酸鉀緩沖液pH7.010mMATP(pH7)20mM氯化鎂0.025U/mlBthNK5()mMKC1[組合物2]20mM磷酸鉀緩沖液pH7.020mM葡萄糖20mM氯化鎂50mMKC15mMNADP5U/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶5U/mlADP依賴性HK[實施例25]<核苷的測定〉使用由實施例12制備的BthNK，制作下述的[組合物]，實施腺苷、肌苷以及鳥苷的測定方法。測定中使用日立7080型自動分析機(jī)。參數(shù)如下試樣為3.ul、Rl為130|il[組合物]、測定主波長為340nm、測定副波長為405nm，測定條件為速率法A、5分鐘反應(yīng)、7-9，減去精制水產(chǎn)生的空白。試樣使用腺苷、肌苷以及鳥苷，將各自的濃度調(diào)整到圖12圖14的橫軸的濃度范圍，此時的測定結(jié)果見圖12圖14。利用使用了BthNK的組合物實施了腺苷、肌苷以及鳥苷的測定。需要說明的是，所謂速率法A(RATE-A)、5分鐘反應(yīng)、7-9(下文中為20-22)指的是測定機(jī)器(日立7080型自動分析機(jī))的測定方法之一，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過參照日立7080型自動分析機(jī)的操作說明書來理解。[組合物]50mM磷酸鉀緩沖液pH7.050mMKC1lmMATP(pH7)0.5mM氯化鎂0.5mMPEPO.lmMNADH50U/ml丙酮酸激酶15U/ml乳酸脫氫酶2mMDTT2.5mU/mlBthNK[實施例26]<核苷的測定〉使用由實施例12制備的BthNK，制作下述的[組合物]，實施腺苷、肌苷以及鳥苷的測定方法。測定中使用日立7080型自動分析機(jī)。參數(shù)如下試樣為3^1、Rl為130^1[組合物]、測定主波長為340nm、測定副波長為405nm，測定條件為速率法A、5分鐘反應(yīng)、7-9，減去精制水產(chǎn)生的空白。試樣使用腺苷、肌苷以及鳥苷，將各自的濃度調(diào)整到圖15圖17的橫軸的濃度范圍，此時的測定結(jié)果見圖15圖17。利用使用了BthNK的組合物實施了腺苷、肌苷以及鳥苷的測定。[組合物]:20mM磷酸鉀緩沖液pH7.0、20mM葡萄糖、lmMATP(pH7)、lmM氯化鎂、lmMNADP、50mMKC1、5U/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、5U/mlADP依賴性HK、0.6mU/mlBthNK。[實施例27]對由實施例11制備的BthNK、由實施例12制備的BthNK和由實施例13制備的BthNK同時進(jìn)行上述的理化性質(zhì)<1><4〉的測定，并進(jìn)行比較。結(jié)果確認(rèn)到該3種BthNK是具有上述的理化性質(zhì)<1〉<4>的酶?！碊NA的提取〉使用含有2.3%營養(yǎng)物、0.2%馬鈴薯提取液的培養(yǎng)基，對枯草桿菌ATCC23857株在26"培養(yǎng)1天，得到菌體。將5g/L蛋白胨、lg/L酵母提取液、20g/LNaCl、0.1g/L檸檬酸鐵、5.9g/L氯化鎂、3.24g/L硫酸鈉用工業(yè)用水溶解，配制成pH7.6的培養(yǎng)基，使用該培養(yǎng)基將OceanobacillusiheyensisDSM14731株在25。C培養(yǎng)1天，得到菌體。通過與實施例5同樣的操作，由這些菌體得到枯草桿菌ATCC23857株和OceanobacilusiheyensisDSM14731株的DNA標(biāo)準(zhǔn)品。[實施例29]<利用PCR法進(jìn)行序列表序列編號8所示基因的擴(kuò)增>以實施例28得到的枯草桿菌ATCC23857株的DNA作為模板，使用序列表序列編號19和序列表序列編號20的引物以PCR進(jìn)行基因擴(kuò)增。使用KODDNA聚合酶按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR。所得到的約1.5kbp的PCR產(chǎn)物按照常規(guī)方法進(jìn)行精制。[實施例30]<利用PCR法進(jìn)行序列表序列編號IO所示基因的擴(kuò)增〉以實施例28得到的OceanobacillusiheyensisDSM14731株的DNA作為模板，使用序列表序列編號21和序列表序列編號22的引物以PCR進(jìn)行基因擴(kuò)增。使用KODDNA聚合酶按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR。所得到的約1.5kbp的PCR產(chǎn)物按照常規(guī)方法進(jìn)行精制。[實施例31]<與表達(dá)載體的連接>按照常規(guī)方法，用Xbal和Sacl對實施例29中精制的PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理，制成插入片段。按照常規(guī)方法，將經(jīng)常規(guī)方法精制的插入片段與用Xbal和Sacl進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理后精制的pHSG399連接，制成pHSG399/BsuIMPDH。通過常規(guī)方法將pHSG399/BsuIMPDH導(dǎo)入大腸桿菌W3110，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過DNA測序確認(rèn)到由利用菌落直接PCR法得到的陽性克隆精制的重組質(zhì)粒的插入片段序列是正確的。[實施例32]<與表達(dá)載體的連接〉按照常規(guī)方法，用Xbal和Sacl對實施例29中精制的PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理，制成插入片段。按照常規(guī)方法，將經(jīng)常規(guī)方法精制的插入片段與用Xbal和Sacl進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理后精制的pHSG399連接，制成pHSG399/OblMPDH。通過常規(guī)方法將pHSG399/OblMPDH導(dǎo)入大腸桿菌W3110，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過DNA測序確認(rèn)到由利用菌落直接PCR法得到的陽性克隆精制的重組質(zhì)粒的插入片段序列是正確的。[實施例33]<BsuIMPDH的獲得〉將實施例31得到的轉(zhuǎn)化體接種于含有34嗎/ml氯霉素和lmMIPTG的LB培養(yǎng)基中，在3(TC培養(yǎng)1天。對培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離而集菌，懸浮于培養(yǎng)液的1/5倍量的含有l(wèi)mMDTT的20mMTris/HCl緩沖液pH7.5中，進(jìn)行超聲波破碎，經(jīng)離心分離得到粗酶液。使該粗酶液吸附于經(jīng)含有l(wèi)mMDTT的10mMTris/HCl緩沖液pH8.0平衡化的Qsep.BB。用含有l(wèi)mMDTT的10mMTris/HCl緩沖液pH8.0充分清洗后，使用含有l(wèi)mMDTT和0或0.5MKC1的10mMTris/HCl緩沖液pH8.0進(jìn)行線性梯度洗脫。在活性組分中加入最終濃度為15%的硫酸銨，使其吸附于經(jīng)含有l(wèi)mMDTT和15%的硫酸銨的10mM磷酸鉀緩沖液pH7.5平衡化的Phenyls印.FF，使用含有l(wèi)mMDTT和15%或0%的硫酸銨的10mM磷酸鉀緩沖液pH7.5進(jìn)行線性梯度洗脫?；钚越M分用經(jīng)10mM磷酸鉀緩沖液pH7.5平衡化的G-25脫鹽，得到來源于枯草桿菌的肌苷5'—磷酸脫氫酶(BsuIMPDH)。1L的培養(yǎng)得到約10mg的BsuIMPDH。[實施例34]<ObIMPDH的獲得>使用實施例32得到的轉(zhuǎn)化體，與實施例33同樣地操作，得到來源于Oceanobacillusiheyensis的肌苷5'—磷酸脫氫酶(OblMPDH)。1L的培養(yǎng)得到約10mg的ObIMPDH。<BsuIMPDH和ObIMPDH的最適pH〉測定實施例33和實施例34中制備的BsuIMPDH和ObIMPDH的最適pH。改變上述活性測定法2中的緩沖液，進(jìn)行活性測定，測定最適pH，其中，pH4.56.0的范圍使用檸檬酸/NaOH(圖18中用O表示)，pH6.07.5的范圍使用磷酸鉀緩沖液(圖18中用參表示)，pH7.09.0的范圍使用Tris/HCl緩沖液(圖18中用A表示)，pH9.510.5使用甘氨酸/NaOH(圖18中用口表示)。圖18給出了以最大活性為100%的相對活性(％)。圖18的(A)是BsuIMPDH，(B)是ObIMPDH。BsuIMPDH和ObIMPDH表現(xiàn)出最大活性的最適pH在pH89的范圍。[實施例36]<BsuIMPDH和ObIMPDH的pH穩(wěn)定性>測定實施例33和實施例34制備的BsuIMPDH和ObIMPDH的pH穩(wěn)定性。將BsuIMPDH和ObIMPDH按pH稀釋到100mM下述緩沖液中，使?jié)舛葹閘mg/ml，在37。C加溫處理3小時后，用活性測定法2測定殘存活性，其中，pH4.56.0的范圍使用檸檬酸/NaOH(圖19中用〇表示)，pH6.07.5的范圍使用磷酸鉀緩沖液(圖19中用參表示)，pH7.09.0的范圍使用Tris/HCl緩沖液(圖19中用A表示)，pH9.511.0使用甘氨酸/NaOH(圖19中用口表示)，pH10.512.5使用磷酸鈉緩沖液(圖19中用顯表示)。圖19中，(A)是BsuIMPDH，(B)是ObIMPDH。BsuIMPDH和OblMPDH在37。C、3小時的條件下在pH611的范圍保持70%以上的活性。<BsuIMPDH和ObIMPDH的熱穩(wěn)定性〉測定實施例33和實施例34制備的BsuIMPDH和ObIMPDH的熱穩(wěn)定性。將BsuIMPDH和ObIMPDH稀釋到含有l(wèi)mMDTT的50mM磷酸鉀緩沖液pH7.0中，使?jié)舛葹閘mg/ml，在各溫度熱處理30分鐘后，用活性測定法2測定殘存活性。圖20中，(A)是BsuIMPDH，(B)是ObIMPDH。如圖20所示，BsuIMPDH和ObIMPDH在含有l(wèi)mMDTT的50mM磷酸鉀緩沖液pH7的水溶液中，于6(TC進(jìn)行30分鐘的熱處理時，保持85%以上的活性。<BsuIMPDH和ObIMPDH的分子量>如圖21所示，實施例33和實施例34中制備的BsuIMPDH和ObIMPDH的基于SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法的分子量為5254kDa。圖21中，(A)是ObIMPDH，(B)是BsuIMPDH。根據(jù)由序列表序列編號7和序列表序列編號9的氨基酸序列得到的計算值，BsuIMPDH為52990，ObIMPDH為52487。[實施例39]<鹽對BsuIMPDH和ObIMPDH的活性的影響〉改變上述活性測定法2中的KC1濃度，測定實施例33和實施例34制備的BsuIMPDH和ObIMPDH的活性，其結(jié)果在圖22中用(O)表示，將KC1換成氯化銨并改變濃度進(jìn)行測定的結(jié)果在圖22中用(參)表示。圖22中，(A)是ObIMPDH，(B)是BsuIMPDH。在50100mM的KC1或氯化銨中，BsuIMPDH和ObIMPDH的活性最大。[實施例40]<BsuIMPDH和ObIMPDH的動力學(xué)參數(shù)〉使用實施例33和實施例34制備的BsuIMPDH和OblMPDH。在Km的1/10倍10倍之間，將上述活性測定法2中的NAD和肌苷5'—磷酸(表中表示為IMP)的濃度調(diào)整為5個以上的不同濃度，用Lineweaver-Burk倒數(shù)作圖法測定BsuIMPDH和ObIMPDH的Vmax和Km，結(jié)果見表4。在上述活性測定法2的反應(yīng)試劑混合液中，在Ki'的1/10倍10倍之間調(diào)整霉酚酸(表中表示為MPA)的濃度為5個以上的不同濃度，利用Lineweaver-Burk作圖法的2次作圖測定BsuIMPDH和ObIMPDH的Ki'，結(jié)果見表4。在上述活性測定法2的反應(yīng)試劑混合液中，在Ki的1/10倍10倍之間調(diào)整磷酸咪唑立賓、黃苷5'—磷酸(表中表示為MZR-P、XMP)、ATP、ADP、AMP的濃度為5個以上的不同濃度，用Dixon作圖法測定BsuIMPDH和ObIMPDH的Ki，結(jié)果見表4。結(jié)果BsuIMPDH和ObIMPDH不受咪唑立賓和利巴韋林這兩者的抑制。抑制形式中，UC表示反競爭性抑制，CO表示競爭性抑制，NC表示非競爭性抑制，CO+NC表示競爭性抑制和非競爭性抑制的混合型。由本實施例的結(jié)果確認(rèn)到BsuIMPDH和ObIMPDH是能夠催化第二反應(yīng)的酶即第二酶。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>[實施例41]<咪唑立賓的測定l>使用實施例2制備的第一酶，制成下述的[組合物]，實施咪唑立賓的測定方法。測定中使用日立7080型自動分析機(jī)。參數(shù)如下試樣為5pl、Rl為100^1[組合物l]、R2為50|il[組合物2]、測定主波長為340nm、測定副波長為405nm，測定條件為速率法A、10分鐘反應(yīng)、23-25。作為試樣，將咪唑立賓用PBS分別在010|iM的范圍進(jìn)行調(diào)整后進(jìn)行測定，測定結(jié)果見圖23。利用使用了實施例2制備的第一酶的組合物實施了咪唑立賓的測定。[組合物l]30mM磷酸鉀緩沖液pH7.075mMKC15mMATP(pH7)10mM氯化鎂lmMDTT2mM肌苷5'—磷酸[組合物2]50mMTris/HCl緩沖液pH8.575mMKC110mMNADlmMDTT0.2U/ml實施例33制備的BsuIMPDH<利巴韋林的測定〉使用實施例12制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH，制成下述的[組合物]，實施利巴韋林的測定方法。測定中使用日立7080型自動分析機(jī)。參數(shù)如下試樣為10|il、Rl為200^1[組合物l]、R2為100W[組合物2]、測定主波長為340nm、測定副波長為405nm，測定條件為速率法A、IO分鐘反應(yīng)、20-22。作為試樣，將利巴韋林用PBS分別在010mM的范圍調(diào)整后進(jìn)行測定，測定結(jié)果見圖24。利用使用了實施例12制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH的組合物實施了利巴韋林的測定。[組合物1]30mM磷酸鉀緩沖液pH7.050mMKC110mMATP(pH7)5mMNAD20mM氯化鎂0.05%TX-1004U/ml實施例12制備的BthNK0.2U/ml實施例33制備的BsuIMPDHImMDTT30mMNaCl0.05%疊氮化鈉[組合物2]1OOmMTris/HCl緩沖液pH9.050mMKC10.05%TX-100ImMDTT20mM肌苷5'—磷酸0.05%疊氮化鈉[實施例43]<咪唑立賓的測定2〉使用實施例11制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH，制作下述的[組合物]，實施咪唑立賓的測定方法。測定中使用日立7080型自動分析機(jī)。參數(shù)如下試樣為2^1、Rl為230^1[組合物l]、R2為115^1[組合物2]、測定主波長為340nm、測定副波長為405nm，測定條件為速率法A、10分鐘反應(yīng)、20-22。作為試樣，將咪唑立賓用PBS分別在040pM的范圍調(diào)整后進(jìn)行測定，測定結(jié)果見圖25。利用使用了實施例ll制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH的組合物實施了咪唑立賓30mM磷酸鉀緩沖液pH7.050mMKC110mMATP(pH7)5mMNAD20mM氯化鎂0.05%TX-1000.3U/ml實施例11制備的BthNK0.29U/ml實施例33制備的BsuIMPDHImMDTT1OOmMTris/HCl緩沖液pH9.050mMKC10.05%TX-100ImMDTT20mM肌苷5'—磷酸[實施例44]<咪唑立賓的測定3〉使用實施例11制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH，制作下述的[組合物]，實施咪唑立賓的測定方法。測定中使用日立7080型自動分析機(jī)。參數(shù)如下試樣為2|il、Rl為230pl[組合物l]、R2為115^1[組合物2]、測定主波長為340nm、測定副波長為405nm，測定條件為速率法A、IO分鐘反應(yīng)、20-22。將02pM范圍的用蒸餾水稀釋咪唑立賓的試樣的測定結(jié)果在圖26中用O表示，將用血清(SeronormHuman(Sero社))稀釋的試樣的測定結(jié)果在圖26中用參表示。利用使用了實施例11制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH的組合物實施了蒸餾水中的咪唑立賓和血清中的咪唑立賓的測定。[組合物l]30mM磷酸鉀緩沖液pH7.050mMKC110mMATP(pH7)5mMNAD20mM氯化鎂0.05%TX-1000.3UZml實施例11制備的BthNK0.06U/ml實施例33制備的BsuIMPDHImMDTTlOOmMTris/HCl緩沖液pH7.050mMKC10.05%TX畫IOOImMDTT20mM肌苷5'—磷酸[實施例45]<咪唑立賓的測定4〉使用實施例12制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH或?qū)嵤├?4制備的OblMPDH，制作下述的[組合物]，實施咪唑立賓的測定方法。測定中使用日立7080型自動分析機(jī)。參數(shù)如下試樣為2pl、Rl為230^1[組合物l]、R2為115)il[組合物2]、測定主波長為340nm、測定副波長為405nm，測定條件為速率法A、10分鐘反應(yīng)、20-22。作為試樣，將咪唑立賓用PBS分別在040pM的范圍調(diào)整，使用其中使用了實施例33制備的BsuIMPDH的組合物1的情況在圖27中用O表示，使用其中使用了實施例34制備的ObIMPDH的組合物1的情況在圖27中用參表示。利用使用了實施例12制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH或?qū)嵤├?4制備的ObIMPDH的組合物實施了咪唑立賓的測定。[組合物l]:30mM磷酸鉀緩沖液pH7.050mMKC110mMATP(pH7)5mMNAD20mM氯化鎂0.05%TX-1000.3U/ml實施例12制備的BthNK0.12U/ml實施例33制備的BsuIMPDH或?qū)嵤├?4制備的lmMDTT30mMNaCl[組合物2]1OOmMTris/HCl緩沖液pH9.050mMKC10.05%TX-100lmMDTT20mM肌苷5'—磷酸[實施例46]<咪唑立賓的測定5〉使用實施例12制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH，制作下述的[組合物]，研究干涉物質(zhì)對測定值的影響。干涉物質(zhì)使用國際試劑社制的干涉檢驗A(干渉于工:y夕A)。在混合有圖28(A)(D)的橫軸濃度的膽紅素C、膽紅素F、乳糜、血紅蛋白的血清中溶解2iig/ml的咪唑立賓，用下述的[組合物]進(jìn)行測定。測定中使用日立7080型自動分析機(jī)。參數(shù)如下試樣為2.2^1、Rl為200|il[組合物l]、R2為100(il[組合物2]、，測定主波長為340nm、測定副波長為405nm，測定條件為速率法A、10分鐘反應(yīng)、20-22。利用使用了實施例12制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH的組合物實施了咪唑立賓的測定而不受干涉物質(zhì)的影響。30mM磷酸鉀緩沖液pH7.050mMKC11OmMATP(pH7)5mMNAD20mM氯化鎂0.05%TX-1000.4U/ml實施例12制備的BthNK0.16U/ml實施例33制備的BsuIMPDHlmMDTT30mMNaCl[組合物2]1OOmMTris/HCl緩沖液pH9.050mMKC10.05%TX-IOOlmMDTT20mM肌苷5'—磷酸[實施例47]<咪唑立賓的測定6〉使用實施例12制備的BthNK或?qū)嵤├?3制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH，制作下述的[組合物]，實施咪唑立賓的測定方法。測定中使用日立7080型自動分析機(jī)。參數(shù)如下試樣為2.2pl、Rl為200^1[組合物l]、R2為100|il[組合物2]、測定主波長為340nm、測定副波長為405nm，測定條件為速率法A、10分鐘反應(yīng)、20-22。作為試樣，將咪唑立賓闬PBS分別在05pg/ml的范圍調(diào)整，使用其中使用了實施例12制備的BthNK的組合物1的情況在圖29中用O表示，使用其中使用了實施例13制備的BthNK的組合物1的情況在圖29中用參表示。利用使用了實施例12制備的BthNK或?qū)嵤├?3制備的BthNK的組合物實施了咪唑立賓的測定。:30mM磷酸鉀緩沖液pH7.050mMKC110mMATP(pH7)5mMNAD20mM氯化鎂0.4U/ml實施例12制備的BthNK或?qū)嵤├?3制備的BthNK0.16U/ml實施例33制備的BsuIMPDH2mMDTT30mMNaCl0.05%TX-函0.05%疊氮化鈉[組合物2]100mMTris/HCl緩沖液pH9.050mMKC10.05%TX-1002mMDTT20mM肌苷5'—磷酸0.05%疊氮化鈉[實施例48]<咪唑立賓的測定7〉使用實施例13制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH，制作下述的[組合物]，實施咪唑立賓的測定方法。測定中使用日立7080型自動分析機(jī)。測定主波長為340nm、測定副波長為405nm，測定條件為速率法A、10分鐘反應(yīng)、20-22。參數(shù)是試樣為2^1、Rl為200^1[組合物l]、R2為100pl[組合物2]的情況下，測定用PBS調(diào)整在07.5pg/ml的范圍的試樣(圖30(A))。參數(shù)是試樣為5^1、Rl為lOOpl[組合物l]、R2為[組合物2]的情況下，測定用PBS調(diào)整在00.5|ag/ml的范圍的試樣(圖30(B))。利用使用了實施例13制備的BthNK的組合物測定了07.5嗎/ml范圍和00.5(ig/ml范圍的咪唑立賓。[組合物l]30mM磷酸鉀緩沖液pH7.050mMKC110mMATP(pH7)5mMNAD20mM氯化鎂0.05%TX-1000.4U/ml實施例13制備的BthNK0.12U/ml實施例33制備的BsuIMPDHlm丄MDTT30mMNaCl1OOmMTris/HCl緩沖液pH9.050mMKC10.05%TX-100lmMDTT20mM肌苷5'—磷酸[實施例49]<咪唑立賓的測定8>使用實施例11制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH，制作下述的[組合物]，實施咪哇立賓的測定方法。測定中使用日立7080型自動分析機(jī)。測定主波長為340nm、測定副波長為405nm，測定條件為速率法A、IO分鐘反應(yīng)、20-22。參數(shù)如下試樣為5|il、Rl為lOO)il[組合物]]、R2為50(!l[組合物2]。作為試樣，用血清稀釋制備咪唑立賓(02)aM)的情況在圖31中用參表示，用以蒸餾水5倍稀釋血細(xì)胞而成的血細(xì)胞破壞液稀釋制備咪唑立賓(02(iM)的情況在圖31用〇表示。利用使用了實施例11制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH的組合物測定了02〖iM范圍的血清稀釋的咪唑立賓和血細(xì)胞破壞液稀釋的咪唑立賓。[組合物l]30mMTris/HCl緩沖液pH7.550mMKC110mMATP(pH7)5mM肌苷5'—磷酸20mM氯化鎂0.05%TX-1000.1U/ml實施例11制備的BthNK[組合物2]1OOmMTris/HCl緩沖液pH9.050mMKC110mMNAD0.05%TX畫IOOlmMDTT0.06U/ml實施例33制備的BsuIMPDH<咪唑立賓的測定9〉在人血清40個檢體中添加0.56.9jig/ml范圍的咪唑立賓，制成試樣。對于該試樣，將使用實施例12制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH并使用下述的[組合物]測定血清中咪唑立賓得到的結(jié)果(本發(fā)明的咪唑立賓測定方法)與通過使用實施例1所述的HPLC的方法(利用HPLC測定咪唑立賓)測定血清中咪唑立賓得到的結(jié)果作以比較。如圖32所示，本發(fā)明的咪唑立賓測定方法(X軸)和利用HPLC的咪唑立賓測定(Y軸)的關(guān)系式約為Y=l.lX+0.09。從而確認(rèn)到，本發(fā)明的咪唑立賓測定方法與利用HPLC的咪唑立賓測定方法具有同等的準(zhǔn)確性。[組合物l]30mM磷酸鉀緩沖液pH7.050mMKC110mMATP(pH7)5mMNAD20mM氯化鎂0.05%TX-畫0.19U/ml實施例12制備的BthNK0.16U/ml實施例33制備的BsuIMPDHlmMDTT30mMNaCl[組合物2]1OOmMTris/HCl緩沖液pH9.050mMKC10.05%TX-100lmMDTT20mM肌苷5'—磷酸[實施例51]<磷酸咪唑立賓的測定>使用實施例33制備的BsuIMPDH，制作下述的[組合物]，實施磷酸咪唑立賓的測定方法。測定中使用日立7080型自動分析機(jī)。參數(shù)如下試樣為2W、Rl為230pl[組合物l]、R2為115(il[組合物2]、測定主波長為340nm、測定副波長為405nm，測定條件為速率法A、10分鐘反應(yīng)、20-22。035pM范圍的以蒸餾水稀釋磷酸咪唑立賓的試樣的測定結(jié)果見圖33。利用使用了實施例33制備的BsuIMPDH的組合物實施了蒸餾水中的磷酸咪唑立賓的測定。[組合物l]30mM磷酸鉀緩沖液pH7.050mMKC15mMNAD0.05%TX-1000.16U/ml實施例33制備的BsuIMPDHlmMDTT1OOmMTris/HCl緩沖液pH7.050mMKC10.05%TX-100lmMDTT20mM肌苷5'—磷酸[實施例52]<咪唑立賓的測定10>以從正在使用咪唑立賓的患者采集到的血清47個檢體作為試樣。將使用實施例12制備的BthNK和實施例33制備的BsuIMPDH并使用下述的[組合物]測定血清中咪唑立賓得到的結(jié)果(本發(fā)明的咪唑立賓測定方法)與通過Journalofchromatography、432巻、1988年、340-345頁記載的使用HPLC的方法(利用HPLC測定咪唑立賓)測定血清中咪唑立賓得到的結(jié)果作以比較。如圖34所示，本發(fā)明的咪唑立賓測定方法(Y軸)與利用HPLC的咪唑立賓測定(X軸)的關(guān)系式約為Y=l.lX+0.06。從而確認(rèn)到，本發(fā)明的咪唑立賓測定方法與利用HPLC的咪唑立賓測定方法具有同等的準(zhǔn)確性。[組合物1]30mM磷酸鉀緩沖液pH6.050mMKC110mMATP(pH7)5mMNAD20mM氯化鎂0.05%TX-1000.19U/ml實施例12制備的BthNK0.16U/ml實施例33制備的BsuIMPDHImMDTT30mMNaCl100mMTris/HCl緩沖液pH9.050mMKC10:05%TX-100ImMDTT20mM肌苷5'—磷酸[實施例53]<第一酶的比較〉使用實施例33制備的BsuIMPDH、實施例2制備的來源于詹氏甲烷球菌的第一酶、或?qū)嵤├?制備的來源于閃爍古生球菌的第一酶、或?qū)嵤├?2制備的BthNK，制成下述的[組合物]，測定ljig/ml的咪唑立賓。測定中使用日立7080型自動分析機(jī)。參數(shù)如下試樣為5^1、Rl為lOO^il[組合物l]、R2為50^1[組合物2]、測定主波長為340nm、測定副波長為405nm，測定條件為速率法A、10分鐘反應(yīng)、20-22。其結(jié)果如下使用實施例2制備的來源于詹氏甲垸球菌的第一酶的情況下，得到了約80mAbs/分鐘(9.3mAbs/分鐘/mg)的靈敏度；使用實施例3制備的來源于閃爍古生球菌的第一酶的情況下，得到了約80mAbs/分鐘(16.7mAbs/分鐘/mg)的靈敏度；使用實施例12制備的BthNK的情況下，得到了約200mAbs/分鐘(100mAbs/分鐘/mg)的靈敏度。由該結(jié)果可知，實施例12制備的BthNK對咪唑立賓的磷酸化的效率至少是實施例2制備的第一酶的10.7倍以上、實施例3制備的第一酶的6倍以上。另外，結(jié)合考慮該結(jié)果和實施例4的結(jié)果，推測實施例12制備的BthNK對咪唑立賓的磷酸化的效率是來源于小鼠的腺苷激酶、或來源于人的腺苷激酶的21倍以上。因此，雖然來源于閃爍古生球菌的第一酶、來源于詹氏甲垸球菌的第一酶、來源于小鼠的腺苷激酶、來源于人的腺苷激酶均可用作本發(fā)明的咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法中的第一酶，但通常需要增加該酶的用量，所以BthNK最適合作為本發(fā)明的第一酶。[組合物1]30mM磷酸鉀緩沖液pH7.075mMKC15mMATP(pH7)5mM氯化鎂lmM肌苷5'—磷酸lmMDTT8.6mg/ml實施例2制備的第一酶、或4.8mg/ml實施例3制備的第一酶、或2.0mg/ml實施例12制備的BthNK[組合物2]50mMTris/HCl緩沖液pH8.575mMKC110mMNADlmMDTT0.3U/ml實施例33制備的BsuIMPDH<制作第二酶的變異體〉以與實施例28、實施例29以及實施例31相同的方法制作pHSG399/BsuIMPDH。以該pHSG399/BsuIMPDH為模板，使用序列表序列編號25、序列表序列編號26、序列表序列編號27以及序列表序列編號28的引物，通過使用PCR的常規(guī)方法或與實施例28、實施例29以及實施例31相同的方法，制備pHSG399/BsuIMPDH[V432I、K449I],其是含有編碼BsuIMPDH的2氨基酸變異體的堿基序列的質(zhì)粒。使用序列表序列編號29、序列表序列編號30、序列表序列編號31、序列表序列編號32、序列表序列編號33、序列表序列編號34、序列表序列編號35、序列表序列編號36、序列表序列編號37以及序列表序列編號38的引物，同樣地制作pHSG399/BsuIMPDH[D29N、S33Y、T158S、T270A、V387E]，其是含有編碼BsuIMPDH的5氨基酸變異體的堿基序列的質(zhì)粒。同樣地制作pHSG399/BsuIMPDHK345N和pHSG399/BsuIMPDHL367I,它們是含有編碼BsuIMPDH的1氨基酸變異體的堿基序列的質(zhì)粒。將通過與實施例31相同的方法得到的各轉(zhuǎn)化體接種于含有34pg/ml氯霉素和lmMIPTG的LB培養(yǎng)基中，在30。C培養(yǎng)1天。其結(jié)果，pHSG399/BsuIMPDH、pHSG399/BsuIMPDH[V432I、K449I]、pHSG399/BsuIMPDHK345N、pHSG399/BsuIMPDH[D29N、S33Y、T158S、T270A、V387E]以及pHSG399/BsuIMPDHL367I的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)效價分別是0.64U/ml、1.57U/ml，2.69U/ml、2.82U/ml以及3.09U/ml。通過這些取代，在本發(fā)明的第二酶的制造方法中，提高了本發(fā)明的第二酶的生產(chǎn)量。[實施例55]<紅血球中的咪唑立賓的測定〉在5ml肝素采血的全血中添加10|ig/ml的咪唑立賓，在37度進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)開始后，在表5所示的時間每次采集0.5ml培養(yǎng)中的全血，并將其離心分離為血漿和血細(xì)胞。血細(xì)胞用生理鹽水清洗3次后，懸浮于0.5ml蒸餾水中，進(jìn)行超聲波破碎，用Ultrafree-MCCentrifugalFilterUnitsBiomax-10過濾。利用與實施例52相同的方法測定所得到的血漿中的咪唑立賓的濃度和濾液中的咪唑立賓的濃度。結(jié)果見表5，實現(xiàn)了血紅細(xì)胞中的咪唑立賓的測定。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>[實施例56]<白細(xì)胞中的咪唑立賓的測定〉將小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞在由500mlDMEM(GIBCO)、FBS(GIBCO)、100U青霉素、lOOpg/ml鏈霉素組成的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞懸浮液濃度為3X106個/1111。在其中加入5ng/ml或10pg/ml的咪唑立賓，進(jìn)一步在37'C培養(yǎng)3小時或18小時。將20ml培養(yǎng)液離心分離成離心上清和細(xì)胞。細(xì)胞用lml的PBS清洗3次后，懸浮于0.5ml的蒸餾水中，進(jìn)行超聲波破碎，用Ultrafree-MCCentrifUgalFilterUnitsBiomax-10過濾。用與實施例52相同的方法測定所得到的離心上清中的咪唑立賓的濃度和濾液中的咪唑立賓的濃度。結(jié)果見表6，實現(xiàn)了白細(xì)胞中的咪唑立賓的測定。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>[實施例57]<白細(xì)胞中的磷酸咪唑立賓的測定〉在與實施例56相同的濃度為3X1()S個/ml的小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞懸浮液中添加表8所示濃度的咪唑立賓，進(jìn)一步在37。C培養(yǎng)4小時。利用與實施例56相同的方法得到細(xì)胞破碎濾液。利用與實施例52相同的方法測定所得到的濾液的咪唑立賓的濃度，用與實施例51相同的方法測定磷酸咪唑立賓的濃度。咪唑立賓的濃度測定結(jié)果見表7，磷酸咪唑立賓的濃度測定結(jié)果見表8。實現(xiàn)了白細(xì)胞中的咪唑立賓和磷酸咪唑立賓的<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>方法進(jìn)行冷凍干燥，制成標(biāo)準(zhǔn)試劑。該標(biāo)準(zhǔn)試劑用3ml蒸餾水溶解后使用。用HPLC法測定標(biāo)準(zhǔn)試劑中的咪唑立賓濃度，結(jié)果如下以濃度為25pg/ml的冷凍干燥用母液制成的校準(zhǔn)液為4.90pg/ml、以濃度為15(ig/ml的冷凍干燥用母液制成的校準(zhǔn)液為3.40pg/ml、以濃度為5pg/ml的冷凍干燥用母液制成的校準(zhǔn)液為1.01pg/ml。[實施例60]<本發(fā)明的測定方法的日內(nèi)差和日間差〉用與實施例52相同的方法測定實施例59中制作的標(biāo)準(zhǔn)試劑，測定本發(fā)明的測定方法的日內(nèi)差和日間差。日內(nèi)差通過在同日內(nèi)測定5次來進(jìn)行計算，日間差通過連續(xù)5天在同日內(nèi)測定1次來進(jìn)行計算。結(jié)果如表10所示，日內(nèi)差的CV(。/。)的平均值為0.64。/。、日間差的CV(y。)的平均值為.67%。據(jù)報道，J.Ch讓ato.、432巻、340頁、1988年記載的HPLC法的日內(nèi)差和日間差為2.503%和3.898%，所以本發(fā)明的咪唑立賓測定方法是HPLC法同等以上的能夠以良好精度進(jìn)行測定的方法。表IO<table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table>產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明提供了測定咪唑立賓和/或利巴韋林的簡單方法。<110〉〈120〉〈130〉<140〉<141〉<160〉<210>〈211>〈212〉<213〉<400〉序列表旭化成制藥株式會社咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法X1071061381312PRT泰國伯克霍爾德氏菌DSM132761Met1PhelieCysArg65ArgAspGinHisGly145ValAlaAspGluGly225ArgGlyGlyPro丁hr305AlaThrGluGlyAsnLeu35AlaGlv50MetMetMetAspThrTyrlieThr115AlaGly130PheGinProPheThrLeu丁yrGlu195lieAla210AlaThrAlaGluGlyLeuArgLeu275GinThr290AlaPheLeulieCys5ArgPheArg20SerPheleuAsnlieAlaGlyThrLeu70AlaLeuGly85SerAlaGin100AlaPheHisGluAlal>ysGlyMetVal150liePheAsp165ArgArgSer180AlaLysLeuSerArgVallieArgHis230ArgVallie245LeuTyrGly260AlaSerLeuTyrAlaProGly丁yrArg310GlyGluValTyr55GlyLeuAlaProAsp135GinProlieValGin215ArgAsplieMetThr295ProSerHisPro40AlaAlaSerMetGly120lieHisGlyGluCys200AlaAspProGluGly280ArgLyslielie25ThrLeuValArglie105AlaLysThrGinLeu185AspLeuGlyThrHis265AlaAlaAla10LeuMetAsnAspGlu90ThrMetLeuGluGIy17bAlaLyslieThrGly250GlyLeuGluTyrProArgLeuAla75TyrThrMetAlaGlu155LeuThrThrlieGlu235CysPheLyslieAspAspArgLeu60GinValAspGinlie140LeuProTyrGlyThr220GinGlyAsplieAsp300AsnGinlieVal30Glu45GlyLeuSer125ValAlaLeulieTrp205ArglieAspTrpAla285AlaMet15HisGlyAspPheGlyProTyrLeuArgValAsp110HisGlyGinPheAla190SerGlyProAlaAla270HisArgLeu95AsnValProAlaAsp175ValGluGluAlaPhe255ThrGinPheThrLeuGlyAlaAsp80ProAsnAsnAspGly16i)GlyAsnAspHisVal240ArgAlaGlyGlu〈210〉2<211〉939<formula>formulaseeoriginaldocumentpage105</formula>275280285ccgcaaacgtacgcgccgacccgcgcggaaategatgcgcgcttcgag912ProGinThrTyrAlaProThrArgAlaGlulieAspAlaArgPheGlu290295300accgcgttcggctatcgtccgaagtga939ThrAlaPheGlyTyrArgProLys305310<210〉3<211〉30<212>腿〈213〉人工序列<400〉3tttcatatggetacgctgatttgcggtteg30<210>4<211〉33<212〉DNA<213〉人工序列<400〉4aaaggatecteactteggacgatagecgaacgc33<210〉5〈211>15<212〉PRT<213〉未知〈223〉Xaa表示任意的氨基酸<柳〉5ArgArgGluPheGlyGlyCysAlaXaa.AsnlieXaaXaaXaaLeu15<210〉6<2I1〉12<212〉PRT〈213〉未知〈223〉Xaa表示任意的氨基酸<400〉6AspProThrGlyXaaGlyAspAlaXaaArgXaaGly12<210>7<211〉487<212>PRT〈213〉枯草桿菌ATCC23867<223〉<400〉7Met1LeuSerAlaArg65GinThrHisGluPhe145TrpLeuValGly50GinAlaAsnLeuGlu130lieGluValGlu35MetGlyGluProMet115AspSerSerPro20LeuAspGlyGinPhe100GlyGinAspLys5AlaThrThrLeuVal85PheUsLysTyrPheLysLysValGly70AspLeuTyrLeuSer150SerSerThrThr55lieLysThrArgVal135MetGluLeu40GlulieValProlie120GlyLysGluVal25LysSerHisLysAsp105SerlielieGIy10LeuLeuAlaLysArg90HisGlylieSerLeuProAsnMetAsn75SerGinValThrAsp155ThrArglieAla60MetGiuValProAsn140ValPheAspPro45lieSerArgPhelie125ArgMetAspAspVal15VeilAspLeu30VallieSerAlaMetAlalieGluGin80GlyVallie95AspAlaGlu110ValAsnAsnAspLeuArgThrLysGlu160106GlulieAsnGluAla225ValSerGluAlaGly305lieThrAlaGlyPhe385SerGlyTyrLysGly艦GluLeuValLeuGinLysLeu195PhePro210AlaValGluAlaGinGlyLeuAsn275Leulie290SerlieThrAlalielieLeuAla355ThrSer370LysValLysAsplieGluGinLeu435AspLeu450AlaGlySerProThrAla165LysHis180LysGlyAsnSerGlyValAsnVsl245ValLeu260lielieGluAlaCysThrlieTyrAlaAsp340AlaGlyGluSerTyrArgArgTyr405GlyArg420ValGlyArgAlaLeuArgAsnTvr485SerLysLeuSer丁hr230AspAsnAlaGlyThr310AspGlyGlyProGly390PheThrGlyLeuGlu470ThrlielieLys215GlyValThrGlyAla295ArgCysGlyHisGly375MetGinProLeuArg455SerlieGlyGluThr200AspAsplieValAsn280AspValAlalieAla360GluGlyGluTyrArg440GluHisSerThrThr170LysLeu185lieLyslieHisThrMetVallie250ThrLys265ValAlaValValVslAlaThrGlu330LysPhe345ValMetThrGluSerValGluAsn410LysGly425SerGlyGluAlaProHisLeuProAspGlyThr235AsplieThrLysGlyAlaSerLeulieAla395LysProMetGinAsp475AspleulieArg220ArgThri\rgAlaVal300ValArgGlyGlyTyr380AlaLysValGlyPhe柳ValGluValGlu205LeuValAlaGluGlu285GlyGlyLysAspSer365GinMetPheGlu丁yr445lieGinAsp190LyslieLysHisThr270AlalieValHislie350LeuGlyGluValGlu430CysArglie175AspValValLysGly255TyrThi.GlyProGly335ThrLeuArgLysPro415ThrGlyMetThr乙ysGinlieGlyLeu240HisProArgProGin320LysLysAlaArgGly400GluValSerThrLys480<210〉8<211〉1467<212>DNA<213〉枯草桿菌ATCC23867〈221〉<222〉(0001)..(1464)<400>8atgtggga&3gtaaaMetTrpGluSerLys15ctgcttgtaccagcaLeuLeuValProAlatttPhe肪gLysteaSertctSerlysgagGlugaaggcGluGly10gtacttValLeutteiLeuccgProacgThrcgtArgttcPhegatAspgacAspgtgValgatAsp15AspgtgValttaLeu4896202530tctg"tagaacttacaaaaacgttaaagetaaatattcctgtcateage144SerValGluLeuThrLysThrLeuLysLeuAsnlieProVallieSer354045gcaggtatggacactgtaacagaateagcaatggcaattgcaatggca192AlaGlyMetAspThrValThrGluSerAlaMetAlalieAlaMetAla505560agacagggcggcttgggcateattcacaaaaatatgtecattgaacag240ArgGinGlyGlyLeuGlylielieHisLysAsnMetSerlieGluGin65707580caggetgaac朋gttgataaagtaaagcgttctgagcgcggcgttate288GinAlaGluGinValAspLysValLysArgSerGluArgGlyVallie859095acaaatcccttc"tt"tt"taactcctgatcaccaagta"Utgatgcggag336ThrAsnProPhePheLeuThrProAspHisGinValPheAspAlaGlu100105110catttgatggggaaatacagaatttecggtgttccgattgtaaataac384HisLeuMetGlyLysTyrArglieSer&yValProlieValAsnAsn115120125gaagaagaccagaagcttgttggaattattacaaaccgtgaccttcgt432GluGluAspGinLysLeuValGlylielieThrAsnArgAspLeuArg130135140tttatttctgactacteaatgaaaateagegacgtcatgacgaaagaa480PhelieSerAspTyrSerMetLyslieSerAspValMetThrLysGlu145150155160gagetagttactgcatctgtaggaactactctggatgaagetgaaaag528GluLeuValThrAlaSerValGlyThrThrLeuAspGluAlaGluLys165170175attttgcagaaacataaaattgaaaagcttcctetcgtagatgaccag576lieLeuGinLysHisLvslieGluLvsleuProLeuValAspAspGin180*190aata貼ttaaaaggtcttateaca3ttaaagacattgaaaaagtcatt624AsnLysLeuLysGlyLeulieThrlieLysAsplieGluLysVallie195200205gagttcccgaacteatct犯agacattcacggccgcctgategttggc672GluPheProAsnSerSerLysAsplieHisGlyArgLeulieValGly210215220gcggcagttggtgtaactggcgatacaatgactcgcgtcaaaaagctt720AlaAlaValGlyValThrGlyAspThrMetThrArgValLysLysLeu225230235240gttgaagccaatgttgatgtgattgttategatacagetcacggaesc768ValGluAlaAsnValAspVallieVallieAspThrAlaHisGlvHis245250255tctcaaggcgttttaaacacagtcacaaaaatecgtgaaacgtatccc816SerGinGlyValLeuAsnThrValThrUslieArgGluThrTyrPro260265270gaattaaacattattgetggaaacgtggcaacagetgaagcgaca卿864GluLeuAsnlielieAlaGlyAsnValAlaThrAlaGluAlaThrArg275280285gcgcUategaagetggagcagacgUgtcaaagU卿atagggcct912AlaLeulieGluAlaGlyAlaAspValValLysValGlylieGlyPro290295300ggtteaatttgtactacacgtgttgtagccggcgtgggtgUccgcaa%0GlySerlieCysThrThrArgValValAlaGlyValGlyValProGin305310315320attacagcaatttatgattgtgcgactgaagcaagaaaacacggcaaa1008lieThrAlalieTyrAspCysAlaThrGluAlaArgLysHisGlyLys325330335acaateategccgacggtgggattaaattctctggcgatateactaaa1056ThrlielieAlaAspGlyGlylieLysPheSerGlyAsplieThrLys340345350gcattggcagccggcggacatgetgttatgetcggaageUgcttgca1104AlaLeuAlaAlaGlyGlyHisAlaValMetLeuGlySerLeuLeuAla355360365ggcac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咪唑立賓測定用組合物，所述成分是CA1)第一酶，其能夠催化對咪唑立賓進(jìn)行磷酸化的第一反應(yīng)；(A2)磷酸供體；(A3)金屬離子；(A4-l)第二酶，其催化與上述第一反應(yīng)不同的反應(yīng)，其不受咪唑立賓抑制，但受磷酸咪唑立賓抑制；(A4-2)肌苷5'—磷酸；以及(A4匿3)NAD(P)類。13、如權(quán)利要求11所述的組合物，其中，該組合物是含有下述成分的利巴韋林測定用組合物，所述成分是(Al)第一酶，其能夠催化對利巴韋林進(jìn)行磷酸化的第一反應(yīng)；(A2)磷酸供體；(A3)金屬離子；(A4-l)第二酶，其催化與上述第一反應(yīng)不同的反應(yīng)，其不受利巴韋林抑制，但受磷酸利巴韋林抑制；(A4-2)肌苷5'—磷酸；以及(A4-3)NAD(P)類。14、如權(quán)利要求1113任一項所述的組合物，其中，在該測定用組合物中，下述3種成分之中任意一種以上是在即將測定前加入的(A4-l)第二酶、(A4-2)肌苷5'—磷酸、以及(A4-3)NAD(P)類。15、如權(quán)利要求1114任一項所述的組合物，其中，能夠催化對咪唑立賓和/或利巴韋林進(jìn)行磷酸化的第一反應(yīng)的第一酶來自泰國伯克霍爾德氏菌。16、如權(quán)利要求1115任一項所述的組合物，其中，能夠催化第二反應(yīng)的第二酶是肌苷5'—磷酸脫氫酶。17、如權(quán)利要求1116任一項所述的組合物，其中，能夠催化第二反應(yīng)的第二酶來自枯草桿菌或Oceanobacillusiheyensis。全文摘要本發(fā)明的課題是提供咪唑立賓和/或利巴韋林的測定方法。具體地說，本發(fā)明提供測定咪唑立賓和/或利巴韋林的簡單方法，其中，使用能夠催化第一反應(yīng)的第一酶和能夠催化第二反應(yīng)的第二酶，所述第一反應(yīng)是將咪唑立賓和/或利巴韋林磷酸化的反應(yīng)，所述第二反應(yīng)是與該第一反應(yīng)不同的反應(yīng)，其不受咪唑立賓和利巴韋林這兩者抑制，但受上述第一反應(yīng)生成的磷酸咪唑立賓和磷酸利巴韋林這兩者抑制。文檔編號G01N1/28GK101441148SQ200810176320公開日2009年5月27日申請日期2008年11月14日優(yōu)先權(quán)日2007年11月20日發(fā)明者太田纮子,酒瀬川信一申請人:旭化成制藥株式會社