專(zhuān)利名稱(chēng)：血管擴(kuò)張刺激磷蛋白在防治肺癌及乳腺癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種血管擴(kuò)張刺激磷蛋白在防治肺癌 及乳腺癌藥物中的應(yīng)用，早期預(yù)測(cè)乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的診斷標(biāo)志物以 及治療腫瘤藥物中的蛋白靶標(biāo)的用途。
背景技術(shù)：
腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的生物學(xué)特征之一，也是腫瘤臨床治療的難題。據(jù)報(bào)道， 60%以上的腫瘤患者在初診時(shí)己經(jīng)發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移。在臨床腫瘤患者中，約有80%— 90%的患者，最終死于侵襲和轉(zhuǎn)移，也就是說(shuō)腫瘤的轉(zhuǎn)移最終成為大多數(shù)患者死 亡的主要原因。根據(jù)衛(wèi)生部"2008年中國(guó)衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)提要"公布的"2007年前十 位疾病死亡專(zhuān)率及死因構(gòu)成"，城市居民中，腫瘤死亡專(zhuān)率為176. 23/10萬(wàn)，占 死亡構(gòu)成28.53%，成為危害人群健康的"頭號(hào)殺手"，與2005年相比，城市居 民、農(nóng)村居民惡性腫瘤的死亡率分別上升18.6個(gè)百分點(diǎn)、23. l個(gè)百分點(diǎn)，這意 味著中國(guó)每年癌癥新發(fā)病例220萬(wàn)人，因癌癥死亡人數(shù)為160萬(wàn)人，每4-5個(gè)死 亡者中就有一個(gè)死于癌癥。隨著我們中國(guó)人口自然增長(zhǎng)率和人口老齡化趨勢(shì)加 劇，隨著我們城市現(xiàn)代化、城市信息化進(jìn)程加快，不良生活方式不斷增加，特別 是農(nóng)村城市化、環(huán)境污染化加劇，惡性腫瘤發(fā)病率持續(xù)上升的趨勢(shì)還在加劇。而 腫瘤轉(zhuǎn)移也具有特異性癌癥的細(xì)胞分化程度越低，浸潤(rùn)性越明顯，轉(zhuǎn)移發(fā)生也 越早。
VASP (Vasodilator-stimulated phosphoprotein) 基因位于人類(lèi)染色體 19q 13. 2 13.3區(qū)域，編碼一種肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白。它最初是在血小板中發(fā)現(xiàn) 的肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)蛋白，Ena /VASP蛋白家族是一組和肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)相關(guān)的多功能 蛋白。該家族成員包括Mena (mammalian Ena) 、 VASP、 EVL ( Ena /VASP-like p rotion)、 Ena (D rosophila Enabled)、 C. elegans Unc34 (Caenorhabditis elegans homologe of enabled)，以及DdVASP(Dictyostelium discoideum VASP)。
其中，Mena、 VASP、 EVL存在于脊椎動(dòng)物中，Ena、 C. elegans Unc234Ena存在 于無(wú)脊椎動(dòng)物中；DdVASP存在于網(wǎng)柱菌屬(D ictyostelium)中。Ena是唯一存 在于果蠅中的該家族成員，是Abelson酪氨酸酶(Abl)的作用底物；VASP最初在 血小板中發(fā)現(xiàn)，是PKG和PKA的作用底物；而Mena和EVL是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的 Ena同系物。Ena/VASP蛋白家族的成員具有60。/。 70。/。的同源性結(jié)構(gòu)，由三個(gè)共 同的結(jié)構(gòu)區(qū)域組成氨基末端是EVH1區(qū)域、中心區(qū)域是富含脯氨酸的區(qū)域PRR、 羧基末端是EVH2區(qū)域。該家族主要與細(xì)胞活動(dòng)中的肌動(dòng)蛋白解聚/聚合密切相 關(guān)，如神經(jīng)細(xì)胞軸突的形成、血小板的聚集、成纖維細(xì)胞的移動(dòng)。
根據(jù)氨基酸的序列及其功能分析可將VASP分為EVH1、 PRR、 EVH2三個(gè)功能區(qū)。
EVH1區(qū)位于VASP的氨基末端，含112個(gè)氨基酸，由兩個(gè)反向的e-sheet 形成一個(gè)e -sandwich結(jié)構(gòu)來(lái)提供一個(gè)可與蛋白質(zhì)結(jié)合溝即V型結(jié)合界面。富含 脯氨酸區(qū)域的蛋白質(zhì)即在此結(jié)合形成PPII型構(gòu)象體(polyproline conformation)。可與EVH1區(qū)域結(jié)合的富含脯氨酸結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)有幾種，其中主 要的包括在Listeria菌表面蛋白ActA中的FP4元件；位于粘附斑(focal adhesion)復(fù)合體中的vinculin和zyxin蛋白；T細(xì)胞受體信號(hào)通路的成分 Fyb/SU\P (Fyb-binding protein/SLP76-associated p rotein)、神經(jīng)軸突的弓i 導(dǎo)蛋白R(shí)0B0 /Semaphorin-6A-1及SAX-3 /Robo ( Ro-undabout)等。PREL1 (proline rich EVH1 ligand)也是一種富含脯氨酸結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞遷移和 伸展過(guò)程中，它一方面直接與VASP的EVHl區(qū)結(jié)合，另一方面與Ras結(jié)合，從而 激活Ras信號(hào)通路發(fā)揮細(xì)胞骨架重排的作用。
PRR區(qū)該區(qū)含有(GP》3多肽鏈。由于該區(qū)域在Listeria等細(xì)菌的基于肌動(dòng)蛋白 的移動(dòng)中起著重要作用，因此也被稱(chēng)為ABM2-( actin-based motility)序列， 其序列可用XPPPPP表示，X可為G、 A、 L、 S、 P。此區(qū)域可與SH3片段、WW片 段及另一種重要的肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)蛋白profilin結(jié)合。VASP的三個(gè)磷酸化位點(diǎn)之 一的Serl57 (serine 157)位點(diǎn)位于此區(qū)域內(nèi)。
EVH2區(qū)位于VASP的羧基末端，由160 190個(gè)氨基酸構(gòu)成,其中含三個(gè)高 保守性a螺旋，被兩個(gè)含幾十個(gè)氨基酸的非保守序列分隔開(kāi)。EVH2區(qū)域從氨基 末端到羧基末端可進(jìn)一步劃分為A(225 245)、 B (259 278) 、 C (343 377)
三個(gè)部分。A區(qū)域中有磷酸化位點(diǎn)Ser239 (serine 239); B區(qū)域是VASP與肌動(dòng) 蛋白絲結(jié)合的區(qū)域，肌動(dòng)蛋白絲也可使VASP形成二聚體，此區(qū)域含磷酸化位點(diǎn) Thr278 (threonine 278); C區(qū)域?yàn)樾纬蒝ASP四聚體所必需。人類(lèi)VASP的四聚 體結(jié)構(gòu)域是一個(gè)由45個(gè)氨基酸殘基組成的右手a螺旋結(jié)構(gòu)，該右手螺旋結(jié)構(gòu)的 形成基礎(chǔ)是15個(gè)氨基酸殘基的重復(fù)序列?？傊?，EVH2的功能主要是與肌動(dòng)蛋 白絲結(jié)合以及自身形成四聚體，以利于肌動(dòng)蛋白形成束狀結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)VASP與粘 附斑的結(jié)合。
VASP整個(gè)蛋白序列由380個(gè)氨基酸組成，其中含有三個(gè)磷酸化位點(diǎn)，兩個(gè)為 絲氨酸位點(diǎn)(Serl57、 Ser239)， 一個(gè)為蘇氨酸位點(diǎn)(Thr278)，這三個(gè)位點(diǎn)的磷 酸化直接受PKG、 PKA的調(diào)控。最新研究表明，在人胚腎細(xì)胞中，由誘導(dǎo)型一氧 化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)產(chǎn)生的NO可以激活內(nèi)源 性NO敏感性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，并導(dǎo)致VASP磷酸化；在平滑肌細(xì)中，VASP Serl57 位點(diǎn)的磷酸化可以發(fā)揮刺激生長(zhǎng)的效應(yīng)，而其Ser239位點(diǎn)的磷酸化卻與NO介導(dǎo) 的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)有關(guān)。
VASP對(duì)細(xì)胞骨架有調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞骨架不僅可以維持細(xì)胞形態(tài)，在細(xì)胞與細(xì) 胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間的連接中同樣發(fā)揮作用，VASP直接與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合 也說(shuō)明VASP參與細(xì)胞骨架的重構(gòu)。在調(diào)控細(xì)胞遷移和細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)方面發(fā)揮 著重要作用。在細(xì)胞內(nèi)，VASP主要聚集在與細(xì)胞粘附和細(xì)胞移動(dòng)相關(guān)的區(qū)域， 包括細(xì)胞遷移的前沿、局部粘附斑、細(xì)胞間粘附連接處及細(xì)胞膜上具高動(dòng)態(tài)變化 的區(qū)域(leading edge),參與調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附和伸展過(guò)程中肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重 排，在細(xì)胞遷移過(guò)程中起著重要作用1999年KELILIU等人發(fā)現(xiàn)VASP蛋白的缺 失可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生，同時(shí)他們還提出VASP蛋白過(guò)表達(dá)和低水平表達(dá)均 可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)型。最近，Dertsiz等還發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中VASP的表達(dá)明 顯高于正常水平，且隨著腫瘤分化程度的降低其表達(dá)水平逐漸升高。另外VASP 在體內(nèi)分布廣泛，在體內(nèi)，它主要在肺、胃、大腸、及平滑肌中含量豐富；腦、 心臟、腎、小腸中也存在；只有肝臟和骨骼肌中檢測(cè)不到VASP。在這些組織中 VASP的表達(dá)可以見(jiàn)于內(nèi)皮細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，腎 小球系膜細(xì)胞，心肌細(xì)胞，巨核細(xì)胞，浦肯野纖維中。在細(xì)胞內(nèi)，VASP主要存 在于應(yīng)激纖維、粘附斑上應(yīng)激纖維的末端，細(xì)胞間連接及細(xì)胞膜上具有高度動(dòng)態(tài)
性變化的區(qū)域。
.目前，惡性腫瘤病人在來(lái)醫(yī)院就診時(shí)，大多數(shù)惡性腫瘤己經(jīng)有不同程度的腫 瘤的浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移，腫瘤浸潤(rùn)過(guò)程中往往缺乏很好的指標(biāo)對(duì)腫瘤侵襲性強(qiáng)弱判斷的 指標(biāo)，進(jìn)而，對(duì)腫瘤病人預(yù)后的評(píng)估常常不準(zhǔn)確。因此，我們目前發(fā)現(xiàn)研究的 VASP與腫瘤的侵襲和遷移有著密切的聯(lián)系，VASP在侵襲力強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞中高表 達(dá)，同時(shí)，抑制VASP也會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。
癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是一個(gè)多基因參與通過(guò)多步驟完成的復(fù)雜過(guò)程，涉及腫瘤細(xì)胞 自身生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的獲得，細(xì)胞間黏附能力的降低，癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外間質(zhì)和基底膜的 降解與破壞，細(xì)胞骨架重構(gòu)引起細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與遷移，以及腫瘤血管和淋巴管生成， 癌細(xì)胞逃逸凋亡和免疫殺傷等諸多因素，而且這些因素是互相關(guān)聯(lián)和相互影響 的。
目前，Dertsiz L等人在對(duì)正常肺組織和肺腺癌組織以及不同分化層次的癌 組織VASP表達(dá)的差異的研究中已經(jīng)證實(shí)，與正常肺組織相比，VASP在肺腺癌組 織中是高表達(dá)的，而且VASP的表達(dá)和肺癌組織的分化程度、病理分期密切相關(guān)。 Keyi Liu等人研究也發(fā)現(xiàn)，在野生型的NIH 3T3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)VASP能導(dǎo)致其向 腫瘤轉(zhuǎn)化。這些提示VASP在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中的可能作用。
我們通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究揭示VASP在多種常見(jiàn)惡性腫瘤細(xì)胞遷移中的正性調(diào) 控作用及其上游調(diào)控機(jī)制，提示VASP可以作為早期預(yù)測(cè)乳腺癌、肺癌轉(zhuǎn)移能 力、侵襲性的診斷標(biāo)志物，并且成為治療這些惡性腫瘤的靶向蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種血管擴(kuò)張刺激磷蛋白(VASP)在防治肺癌及乳 腺癌藥物中的應(yīng)用，VASP作為早期預(yù)測(cè)乳腺癌、肺癌轉(zhuǎn)移能力、侵襲性的診斷 標(biāo)志物及治療乳腺癌、肺癌藥物中的新蛋白靶標(biāo)。si脂A-VASP能夠使乳腺癌 MCF-7細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞遷移速度分別下降31. 3%、 36.3%,使肺癌A549細(xì) 胞遷移速度下降39.8%。
本發(fā)明涉及一種早期預(yù)測(cè)乳腺癌、肺癌轉(zhuǎn)移能力、侵襲性的診斷標(biāo)志物及治 療乳腺癌、肺癌藥物中的新蛋白靶標(biāo)的應(yīng)用。涉及采取siRNA技術(shù)特異性沉默人 乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞中VASP、 Racl的表達(dá)水平，
并進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移能力，這表明抑制Racl活化、下調(diào)VASP基因可以 顯著抑制惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移；免疫組化檢測(cè)臨床肺癌組織中VASP的表達(dá)水平，結(jié) 合病理分期分級(jí)，結(jié)果顯示，VASP在腫瘤組織中高表達(dá)，并且與高轉(zhuǎn)移有正相
關(guān)。以上結(jié)果表明VASP可以作為早期預(yù)測(cè)乳腺癌、肺癌轉(zhuǎn)移能力、侵襲性的
診斷標(biāo)志物，并且成為治療乳腺癌、肺癌藥物中的新蛋白耙標(biāo)。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施
本發(fā)明使用上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司化學(xué)合成的，針對(duì)VASP (Genbank accession number :BC038224)革巴基因的三對(duì)siRNA片段VASP-siRNAs(VASP-942、 VASP-薩、VASP-1024)、陰性對(duì)照si腿和FAM標(biāo)記的siRNA，通過(guò)脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000，(購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Invitrogen公司，目錄號(hào)297975)法，分 別轉(zhuǎn)染至常規(guī)方法培養(yǎng)的人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞(武 漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心提供)，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況，轉(zhuǎn)染48h后，RT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞VASPmRNA水平，Western Blot檢測(cè)細(xì)胞VASP蛋白水平，二維或三位 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)鑒定腫瘤細(xì)胞遷移或侵襲能力；同時(shí)在武漢大學(xué)中南醫(yī)院腫瘤科收 集臨床肺癌的組織標(biāo)本，采用免疫組化的方法檢測(cè)組織中的VASP的表達(dá)水平。 具體發(fā)明內(nèi)容如下
A. 化學(xué)合成VASP siRNA及Racl siRNA
采用化學(xué)方法合成(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)針對(duì)VASP (Genbank accession number:BC038224 )耙基因的三對(duì)siRNA片段(VASP-942、 VASP-1002、 VASP-1024)、陰性對(duì)照siRNA和FAM標(biāo)記的siRNA。合成針對(duì)調(diào)控VASP的 Racl(Genbank accession number:AF498964)耙基因的三對(duì)siRNA片段(Racl-439、 Racl-99、 Racl-328)、陰性對(duì)照siRNA。 siRNA用來(lái)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，觀 察通過(guò)抑制VASP基因能否到達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用及其機(jī)制。
B. 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染VASP siRNA沉默VASP基因
常規(guī)方法培養(yǎng)的人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞(武漢 大學(xué)細(xì)胞典藏中心提供)，細(xì)胞隔天換液，生長(zhǎng)至80% 90%融合時(shí)傳代。轉(zhuǎn)染前
一天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)、細(xì)胞鋪于六孔板、使其在轉(zhuǎn)染日密度為90%，用 無(wú)血清的培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12 h, Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染VASP-siRNAs (942、 1002、 1024)、陰性對(duì)照siRNA，在37。C、 5%(:02及飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育，6h 后換生長(zhǎng)培養(yǎng)液直至48 h備用。
C. RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中VASP mRNA表達(dá)水平
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNAs 48h后用RT-PCR測(cè)定細(xì)胞VASP mRNA表達(dá)水平，鑒定在 mRNA水平VASP siRNA抑制VASP表達(dá)的效果。
D. Western Blot檢測(cè)VASP蛋白表達(dá)水平
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNAs 48h后，裂解細(xì)胞提取總蛋白，用Western Blot檢測(cè)細(xì) 胞VASP蛋白表達(dá)水平，鑒定在蛋白水平VASP siRNA抑制VASP表達(dá)的效果。
E. 二維遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力
二維遷移實(shí)驗(yàn)，即損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)，用于鑒定細(xì)胞二維的遷移能力于六孔 板中每孔加入細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用1 ml槍頭的尖端在孔中央作一垂直 的劃痕，沿劃痕邊緣等距離間隔作5-6個(gè)標(biāo)記作為數(shù)據(jù)測(cè)定點(diǎn)，加入含或不含 siRNA的無(wú)血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)0h， 48h拍照。測(cè)量每個(gè)時(shí)間 點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的劃痕兩側(cè)的細(xì)胞間距(um)，即以0h劃痕邊沿距離減去48h劃痕 邊沿距離作為細(xì)胞遷移距離，計(jì)算單位時(shí)間細(xì)胞遷移速度，反應(yīng)細(xì)胞二維遷移 能力。
F. 三維遷移/侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移/侵襲能力
三維侵襲實(shí)驗(yàn)，即Transwell法，用于鑒定細(xì)胞三維的遷移/侵襲能力采 用細(xì)胞侵襲小室Transwell (裝有聚碳酸酯微孔膜孔徑8um，美國(guó)Costar公 司)，預(yù)先侵襲小室上表面沒(méi)有包被任何材料的用于細(xì)胞三維遷移能力檢測(cè)，而 預(yù)先用10 ug/mL I型膠原(購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司)包被Transwell小室底部以 模擬細(xì)胞外基質(zhì)用于細(xì)胞三維侵襲能力檢測(cè)。將細(xì)胞接種于預(yù)處理好的侵襲小 室上室內(nèi)，下室內(nèi)加入含高血清的培養(yǎng)液誘導(dǎo)，規(guī)定時(shí)間后計(jì)數(shù)遷移至下表面
的細(xì)胞總數(shù)，反應(yīng)細(xì)胞三維/侵襲能力。
G.免疫組化SP法檢測(cè)腫瘤組織中VASP的表達(dá)
臨床病理標(biāo)本按病理檢査標(biāo)準(zhǔn)確定分期、分級(jí)，VASP表達(dá)水平檢査采用免 疫組化SP法，按照鏡下細(xì)胞內(nèi)染色顆粒的有無(wú)和細(xì)胞染色的深淺對(duì)VASP陽(yáng)性 程度進(jìn)行分類(lèi)，統(tǒng)計(jì)分析惡性腫瘤組織中VASP表達(dá)水平與病理分期分級(jí)的相關(guān)性。
本發(fā)明與現(xiàn)有惡性腫瘤防治技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果
1. VASP作為細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞遷移過(guò)程中發(fā)揮 重要作用。
2. 本發(fā)明表明在各種惡性腫瘤轉(zhuǎn)移調(diào)控過(guò)程中VASP蛋白發(fā)揮重要的作用。
3. 本發(fā)明表明VASP可以作為一種早期預(yù)測(cè)乳腺癌、肺癌轉(zhuǎn)移能力、侵襲 性的診斷標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移。
4. 本發(fā)明表明VASP可以作為治療乳腺癌、肺癌的新靶標(biāo)蛋白。


圖1.人乳腺癌MCF-7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
A. 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞普通光鏡下形態(tài)
B. 轉(zhuǎn)染siRNA的MCF-7細(xì)胞發(fā)綠色熒光
圖2. RT-PCR檢測(cè)人乳腺癌細(xì)胞中VASP mRNA表達(dá)水平
A. 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中VASP mRNA表達(dá)水平
VASP-942 siRNA組的VASP mRNA表達(dá)水平下調(diào)到陰性對(duì)照組的46%,兩者 差異有顯著性(*代0.05)。
B. 人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中VASP mRNA表達(dá)水平
VASP-942 siRNA組的VASP mRNA表達(dá)水平較陰性對(duì)照組下調(diào)，兩者差異有顯 著性(*代0. 05)
圖3. Western Blot檢測(cè)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞VASP蛋白表達(dá)水平
VASP-942 siRNA組VASP蛋白表達(dá)水平下調(diào)到陰性對(duì)照組的32%,兩者差
異有顯著性(*尸<0.05)。該結(jié)果與RT-PCR提示結(jié)果一致。因此，在隨后實(shí)驗(yàn) 中，我們選擇了沉默VASP效果最佳的VASP-942siRNA進(jìn)行VASP在細(xì)胞遷移中的 作用研究。
圖4. siRNA沉默VASP表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞二維遷移能力的影響 A、 B.對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移能力的影響
VASP-942 siRNA組(圖4A:Bi、 B2)對(duì)MCF-7細(xì)胞移動(dòng)的平均速度為0.692 Hm/h，而陰性對(duì)照siRNA組(圖4A: Ai、 A2)細(xì)胞移動(dòng)的平均速度為1.008 pm/h， 兩者差異顯著('尸<0.05)(表1和圖4A)。
A, ， A2:陰性對(duì)照組0 h與48 h; (X100)
B, , B2:分別是VASP-942siRNA組0 h與48 h; (X100) C.對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響
VASP-942 siRNA組MDA-MB-231細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞遷移速度滿(mǎn)，兩者差異顯 著(*戶(hù)<0.05)。
圖5. MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力比較
A. MDA-MB-231和MCF-7兩種細(xì)胞二維遷移速度比較 MDA-MB-231細(xì)胞較MCF-7細(xì)胞二維遷移速度快，兩者差異顯著(4尸<0.05)
B. MDA-MB-231和MCF-73D兩種細(xì)胞的遷移和侵襲在中的比較
MDA-MB-231細(xì)胞較MCF-7細(xì)胞三維遷移/侵襲能力弱，兩者差異顯著C 戶(hù)<0.05)
圖6. siRNA沉默Racl表達(dá)對(duì)VASP蛋白表達(dá)水平的影響
Racl-439siRNA組的Racl蛋白表達(dá)水平下調(diào)到陰性對(duì)照組的47%， VASP 的表達(dá)水平下調(diào)到陰性對(duì)照組的53%，兩者差異有顯著性(*尸<0.05)。說(shuō)明Racl 是VASP的上游調(diào)控因素。
圖7. VASP-si脂A抑制肺癌A549細(xì)胞二維遷移能力
VASP-942 siRNA組肺癌A549細(xì)胞二維遷移速度較對(duì)照組低，兩者差異有顯 著性(*代0.05)。 圖8.肺癌組織中VASP的強(qiáng)表達(dá)
具體實(shí)施例方式
下面以VASP在乳腺癌、肺癌中的作用，說(shuō)明其用途
實(shí)施例1: siRNA沉默VASP抑制人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞遷移
材料與方法 一、試劑和儀器 1.采用試劑
(1) RPMI-1640培養(yǎng)基 Sigma
(2) 小牛血清 (calf serum， CS) Hyclone
(3) 胰蛋白酶Amresco
(4) L-谷氨酰胺(L-Glutamine) Gibco
(5) EDTA-Na2'2H20 Amresco
(6) 十二垸基磺酸鈉(SDS) Sigma
(7) N， N'-亞甲雙丙烯酰胺 Fluka
(8) 丙烯酰胺 Amresco
(9) TEMED Sigma
(10) 甘氨酸 Amresco
(11) 過(guò)硫酸銨(AP) Sigma
(12) 二硫蘇糖醇(DTT) Amresco
(13) 硝酸纖維素膜(NC膜)A.P
(14) 牛血清白蛋白(BSA) Amresco
(15) TritonX-100 Amresco
(16) Tween_20 Amresco
(17) 單克隆鼠抗人VASP抗體(IE273) Alexis Biochemicals
(18) 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司
(19) 鼠抗人Racl抗體23A8Upstate Biotechnology公司
(20) BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒碧云天生物技術(shù)研究所
(21) DAB顯色試劑盒 Piecre
(22) RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit Fermentas
(23) 瓊脂糖 Spanish
(24) Tris-HCl Sigma
(25) EDTA Sigma
(26) PMSF Amresco
(27) EGTA Sigma
(28) P -mercaptoethanol Amresco
(29) 印rotinin Sigma ■(30) leupeptin Sigma
(31) RNAi片段 上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司 其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。 2.試劑的配制
2. 1細(xì)胞培養(yǎng)主要試劑的配制
(1) RPMI-1640培養(yǎng)基RPMI-1640干粉一袋溶解于1000 ml雙蒸水中， 振蕩使之完全溶解，經(jīng)孔徑為0.22 的濾膜過(guò)濾除菌后即為基 礎(chǔ)培養(yǎng)基，分裝后凍存于-20'C。臨用前每85ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入 10 ml小牛血清，0.2 mol/L的L-谷氨酰胺1 ml,雙抗1 ml (含 青霉素1萬(wàn)單位，鏈霉素1萬(wàn)單位)，用10%的NaHCO"周pH為 7.0-7.2， 4 。C保存。
(2) PBS緩沖液NaCl 8.0 g， KC1 0.2 g， Na2HP04 12H20 2.89 g， NaH2P04 0 . 2 g，加雙蒸水至1000 ml,高壓滅菌后室溫(20-25 °C, 以下相同)保存。
(3) 細(xì)胞傳代消化液(0.25"y。胰蛋白酶-EDTA):胰蛋白酶2.5 g， EDTA Na2 2H20 0. 2 g,加PBS緩沖液至1000 ml，用NaOH將消化液的 pH調(diào)至7.2左右，經(jīng)孔徑為0.22 ym的濾膜過(guò)濾除菌，分裝后凍 存于-20 "C備用。
(4) 青、鏈霉素雙抗溶液青霉素100萬(wàn)單位，鏈霉素100萬(wàn)單位，溶 于lOOml滅菌雙蒸水中，分裝后-20 'C保存。使用時(shí)每100ml培養(yǎng) 液中加入lnil雙抗溶液。
(5)谷氨酰胺谷氨酰胺粉末2. 922g，溶于lOOml雙蒸水中，0. 22 y m 的微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝，_20°(:保存。使用時(shí)每100ml培養(yǎng)液 中加入lml谷氨酰胺溶液。
2.2免疫印跡主要試劑的配制
(1) 細(xì)胞裂解液20 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)， 150誦ol/L NaCl, 1% Triton X-100。
(2) 1. 5 mol/L Tris-Cl (pH 8. 8): 9. 0825 g Tris堿，40 ml雙蒸水， 調(diào)pH至8. 8，定容至50 ml。
(3) 1 mol/L Tris-Cl (pH 6.8): 6.055 g Tris堿，40 ml雙蒸水，調(diào) pH至6. 8，定容至50 ml。
(4) 30%凝膠儲(chǔ)備液29 g丙烯酰胺，60 ml雙蒸水，水浴30-40 。C， 直至丙烯酰胺溶解。1 g N， N'-亞甲雙丙烯酰胺，10 ml雙蒸水， 溶解后與丙烯酰胺液混合，定容至100 ml， 4 'C避光保存。
(5) 10% SDS: 10 g SDS， 90 ml雙蒸水，加熱助溶，定容至100 ml， 4 'C保存?zhèn)溆谩?br> (6) 5XSDS-PAGE上樣緩沖液:250誦ol/L Tris-Cl (pH 6. 8)， 10%SDS， 5%溴酚藍(lán)，50%甘油，DTT臨用前加入，終濃度為100 mmol/L。
(7) 10% AP: 0. 3 g AP, 3 ml雙蒸水，4 。C保存，隔周配制。
(8) 15 ml 10%分離膠:雙蒸水5. 9 ml， 30%凝膠儲(chǔ)備液5. 0 ml， 1.5 mol/L Tris-Cl (pH 8.8) 3.8 ml, 10% SDS 0. 15 ml, 10% AP 0. 15 ml, TEMED 0.008 ml。
(9) 4 ml 5%濃縮膠雙蒸水2. 7 ml， 30%凝膠儲(chǔ)備液0. 67 ml， 1.0 mol/L Tris-Cl (pH 8.8) 0.5 ml， 10% SDS 0.04 ml， 10% AP 0.04 ml， TEMED 0.006 ml。
(10) 5X電泳緩沖液7.55 g Tris堿，47 g甘氨酸，25 ml 10% SDS， 450 ml雙蒸水，調(diào)pH至8. 3,定容至500 ml。
(11) 轉(zhuǎn)移緩沖液5.81 g Tris堿，2.93 g甘氨酸，0. 37 g SDS，溶于 500 ml雙蒸水，溶解后加200 ml甲醇和250 ml雙蒸水，調(diào)pH至
8. 3，定容至1000 ml。
(12) 漂洗液(pH 7.6): Tris堿2.42 g， NaCl 8.0 g， Tween-20 1 ml， 雙蒸水溶解后，調(diào)pH 7.6，定容至1000 ml。
(13) 封閉液2.5 gBSA溶于50 ml漂洗液(pH 7.6)。
2. 3 RT-PCR試劑的配制
(1) 5XTBE緩沖液Tris堿lO. 8g，硼酸5. 5 g， 0. 5 mol/L EDTA 4 ml， 加水至200 ml，室溫保存。使用時(shí)，稀釋為O. 5XTBE緩沖液。
(2) 2。/。DNA凝膠制備(20 ml):瓊脂糖O. 4 g， 5XTBE緩沖液2 ml，雙蒸 水18ml，加熱溶解，待溫度降至60'C時(shí)加入1 "1EB G0mg/ml)， 混勻后加入預(yù)先準(zhǔn)備的制膠板中，放置lh后即可進(jìn)行DNA電泳，電 泳緩沖液為O. 5XTBE。
3. 儀器
(1) 超凈工作臺(tái)YJ-1450型蘇州凈化設(shè)備公司
(2) 二氧化碳培養(yǎng)箱S服L-LAB， USA
(3) DMBRI倒置相差熒光顯微鏡LEICA， Germany
(4) 電子天平JY型上海精密科學(xué)儀器有限公司
(5) -90 。C冰箱382 E型日本三洋
(6) -20 。C冰箱中國(guó)海爾
(7) 臺(tái)式低溫高速離心機(jī)TGL-16G型上海醫(yī)用分析儀器廠
(8) 臺(tái)式離心機(jī)TDL-40B型上海安亭科學(xué)儀器廠
(9) 普通恒溫?fù)u床HYA型中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠
(10) 熒光酶標(biāo)儀TECAN
(11) 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYY-6B型北京市六一儀器廠
(12) 電泳槽DYPC-24D型北京市六一儀器廠
(13) 轉(zhuǎn)印槽DYCZ-40D型北京市六一儀器廠
(14) 水浴鍋HH-WZ1-420型北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠
(15) 凝膠成像分析系統(tǒng)WD-9413A型北京市六一儀器廠
(16) 超純水系統(tǒng)北京市六一儀器廠
(17) 微型旋渦混合儀WH-2型上海滬西分析儀器廠
(18) 微量移液器200-1000 yl、 20-200 w 1、 1-20 ul、 0.5-10 u 1
大龍
(19) 制冰機(jī)GRANT
(20) 紫外投射反射檢測(cè)分析儀上?？等A生化儀器制作廠
二、實(shí)驗(yàn)方法
1.化學(xué)合成VASP siRNA和Racl siRNA
采用化學(xué)方法合成針對(duì)VASP (Genbank accession number:BC038224)耙基 因的三對(duì)siRNA片段(VASP-942、 VASP-1002、 VASP-1024)、陰性對(duì)照siRNA 和FAM標(biāo)記的siRNA。合成針對(duì)Racl (Genbank accession number:AF498964) 靶基因的三對(duì)siRNA片段(Racl-439、 Racl-99、 Racl-328)、陰性對(duì)照siRNA。 序列如下
sense 5,-CAACCUUGCCAAGGAUGAATT-3'
antisense 5' -UUCAUCCUUGGCAAGGUUGTG陽(yáng)3'
sense 5 ， -CGCCCAGCUCCAGUGAUUATT-3'
antisense 5 ，-UAAUCACUGGAGCUGGGCGTG-3'
sense 5,陽(yáng)GGACCU AC AG AGGGUGA AATT-3'
antisense 5 ， -UUUCACCCUCUGUAGGUCCGA-3'
sense5，-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT陽(yáng)3，
antisense 5 ，-ACGUGACACGUUCGGAGAATT國(guó)3'
sense: 5'-GGAGATTGGTGCTGTAAAA-3'
antisense:5'-UUUUACAGCACCAAUCUCC-3'
sense: 5'-CUACUGUCUUUGACAAUUA-3';
antisense:5'-UAAUUGUCAAAGACAG UAG-3'
sense:5'-CAUCCUAGUGGGAACUAAA-3';
antisense: 5'-UUUAGUUCCCAC UAGGAUG3' sense: 5 '-UUCUCCG AACGUGUC ACGU-3'
VASP 942 -960bp
VASP 1002-1020bp
VASP 1024 -1042bp
Negative control
Racl 439-457bp
Racl 99-117bp
Racl 328-346bp Negative control
2.細(xì)胞培養(yǎng)
人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株、MDA-MB-231細(xì)胞株(由武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中 心提供)用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 。C、 5%0)2及飽和濕 度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞隔天換液，生長(zhǎng)至80% 90°/。融合時(shí)傳代。經(jīng)臺(tái) 盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率〉95%。
3. 細(xì)胞分組和處理
轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)、細(xì)胞鋪于六孔板、使其在轉(zhuǎn)染曰 密度為90%，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合時(shí)，用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基饑餓細(xì) 胞12h，實(shí)驗(yàn)分為四組陰性對(duì)照siRNA組、VASP-942 siRNA組，VASP-1002 siRNA組，VASP-1024 si腿組;陰性對(duì)照siRNA組、Racl-439 siRNA組， Racl-99 siRNA組，Racl-328 siRNA組。
對(duì)于每組細(xì)胞，使用250 y l無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋100 pmol siRNA，使 用250 u l無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋5 u 1 Lipofectamine 2000，后者室溫孵育5 min。混合稀釋的siRNA和稀釋的Lipofectamine 2000，室溫孵育20 min。 直接將復(fù)合物加入每孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板、輕輕混勻。在37 'C、 5%0)2及飽 和濕度培養(yǎng)箱中孵育，6 h后換生長(zhǎng)培養(yǎng)液直至48 h。
4. Western Blot鑒定VASP蛋白表達(dá)的改變
4. 1細(xì)胞總蛋白的提取
(1) 取各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌后吸凈殘余的PBS液體。
(2) 加入細(xì)胞裂解液，置冰上裂解15 min。
(3) 裂解結(jié)束后，用干凈的細(xì)胞刮迅速將細(xì)胞刮至培養(yǎng)瓶的一側(cè)，然后 用移液器將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 ml Ep管中。
(4) 4 。C， 14000 rpm離心10 min。
(5) 將離心后的上清液轉(zhuǎn)移到另一Ep管中，-90 。C保存。 4. 2細(xì)胞總蛋白的定量
(1) 配制工作液根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1 體積BCA試劑B (50:1)配制適量BCA工作液，充分混勻。
(2) 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品取10 W標(biāo)準(zhǔn)品用適量PBS稀釋?zhuān)蛊浣K濃度為0. 5
mg/mL。將標(biāo)準(zhǔn)品按O， 1， 2， 4， 8， 12， 16， 20 W加到96孔板 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中，再分別加適量PBS補(bǔ)足到20 W。
(3) 加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中，補(bǔ)加PBS到20 W。
(4) 每孔加入200 W BCA工作液，37 。C放置30 min。
(5) 冷卻到室溫，用酶標(biāo)儀測(cè)定0D570 nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各樣 本蛋白濃度。
4. 3 SDS-PAGE電泳
(1) 準(zhǔn)備玻璃板、梳子，依次用無(wú)水乙醇、自來(lái)水、雙蒸水洗滌，晾干 或用濾紙擦干。
(2) 將玻璃板固定于垂直電泳槽。
(3) 配制10%的分離膠，小心地將分離膠緩慢灌入兩塊玻璃板之間，留 出濃縮膠所需空間，然后加適量雙蒸水于凝膠表面以隔絕空氣，室 溫下靜置30 min左右，待分離膠凝固。
(4) 分離膠凝固后，倒掉凝膠表面的雙蒸水，然后將配制好的5°/。的濃 縮膠灌入膠板之間，插入合適的梳子，置室溫30 min左右，待濃 縮膠凝固。
(5) 在濃縮膠聚合的同時(shí)，在上樣的蛋白樣品中加入適量5XSDS上樣 緩沖液至終濃度為1 X ，同時(shí)加入適量DTT，其終濃度為100 mmol/L， 混勻后，于沸水中煮5 min使蛋白變性。
(6) 濃縮膠凝固后，拔去梳子，加入1X電泳緩沖液，將處理好的樣品 及marker小心上樣到凝膠上樣孔內(nèi)。
(7) 將電泳裝置與電源相接，選擇穩(wěn)壓模式，出孔電壓為40 V，當(dāng)指 示劑進(jìn)入濃縮膠后將電壓提高至80 V，進(jìn)入分離膠后將電壓提高 至150V，電泳3 4h后關(guān)閉電源。
(8) 電泳結(jié)束后，取出玻璃板，小心將其分開(kāi)，用手指沿邊緣小心剝出 凝膠。
4. 4蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移
(1)在托盤(pán)中倒入轉(zhuǎn)移緩沖液，高度以剛剛浸沒(méi)轉(zhuǎn)印夾和海綿為宜。浸
泡轉(zhuǎn)印夾和海綿。
(2) 戴手套剪2塊Whatman 3固濾紙、1塊NC膜(靠膠面的濾紙《膠 的大小，靠膜面的濾紙《膜的大小)，浸泡于托盤(pán)轉(zhuǎn)移緩沖液中5
min0
(3) 在海綿上從負(fù)極到正極依次鋪上濾紙、凝膠、NC膜、濾紙，逐層 趕出氣泡，蓋上海綿，扣好轉(zhuǎn)印夾，放入轉(zhuǎn)印槽。將轉(zhuǎn)印槽置于冰 上，接上轉(zhuǎn)印儀，選擇穩(wěn)流模式，電流大小為膜的長(zhǎng)(cm) X寬(cm) X2，轉(zhuǎn)印2 h后關(guān)閉電源。
4. 5免疫顯色
(1) 轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出轉(zhuǎn)印夾，用平頭小鑷子夾出NC膜，蛋白面朝上， 剪去左上角作為標(biāo)記，浸泡于含有適量新配置的封閉液的平皿中， 蓋上錫紙，室溫輕搖封閉2 h。
(2) 加入用封閉液稀釋的I抗(VASP 1 : 800稀釋?zhuān)琑acl 1: 300稀釋)， 4 。C孵育，靜置過(guò)夜。
(3) 用漂洗液洗膜3次，每次10 min。
(4) 漂洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的II抗(1 : 2000稀釋)，置于搖 床上室溫振蕩孵育1 h。
(5) 用漂洗液洗膜3次，每次IO min。
(6) 取1 ml雙蒸水，加入DAB試劑盒中A試劑1滴，混勻后再分別加 入B試劑1滴和C試劑1滴，充分混勻后倒在NC膜上，避光顯色 2 3 min，自來(lái)水終止反應(yīng)，凝膠成像系統(tǒng)拍照。
5. RT-PCR鑒定VASP mRNA表達(dá)的改變
5. 1細(xì)胞總RNA的提取于鑒定
(1) 取各處理組細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，用DEPC水配置并4 。C預(yù)冷的PBS清 洗1次，倒置。
(2) 每孔細(xì)胞加入Trizol試劑1 ml，直接裂解細(xì)胞，5 min后，將充 分混勻的細(xì)胞裂解液移至EP管中。
(3) 每ml Trizol加入0. 2 ml氯仿，vortex混勻15 s,室溫放至2-3min。
(4) 12000g 4 。C離心15 min，然后吸取含總RNA的上層水相至一新的 離心管中，每ml Trizol約可吸取O. 5-0. 55 ml。
(5) 按每ml最初的Trizol加入0. 5 ml異丙醇，顛倒數(shù)次混勻，室溫 沉淀10 min。
(6) 12000g 4 r離心10 min，在管底可見(jiàn)膠狀RNA沉淀，棄上清。
(7) 每ml最初的Trizol加入1 ml 75%乙醇，vortex混勻。
(8) 7500g 4 。C離心5 min，棄上清，再用離心機(jī)甩一下，小心吸盡液體。
(9) 待RNA略干后，加入20 DEPC水溶解，-70。C保存。 5. 2逆轉(zhuǎn)錄試劑盒樣品RNA 6 u 1，下游引物1 ul，加入DEPC處理雙蒸水至總體積為12 lU，混勻并上下顛倒3-5 s，于7(TC，孵育5min。立即冰上冷卻，加 入5Xbuffer 4 ii 1， RNA酶抑制劑1 ul， 10 mM dNTP mix 2 ul，混 勻后稍離心，37°C， 5 min孵育，加入逆轉(zhuǎn)錄酶1 "1, 42 °C 60 min 孵育，70°C, lOmin終止反應(yīng)，冰上冷卻，-20。C保存。
5. 3 PCR
IOXPCR緩沖液 5 Hi
Mg'+ 3 ul
dNTP mix (10 mM) 1 u 1
10 mM上下游引物各 1 y 1
TaqDNA聚合酶 1. 5 u 1
逆轉(zhuǎn)錄cDNA 5 y 1
DEPC處理水 32.5 yl
反應(yīng)體系 50 ul
輕柔混合反應(yīng)體系，短暫離心。 反應(yīng)條件
VASP: 94°C， 40s; 60°C， 30s; 72°C， 30s; 30個(gè)循環(huán)
Racl: 94°C， 40s; 54°C， 30s; 72°C， 30s; 30個(gè)循環(huán)。 5. 4凝膠的制備
(1) 將瓊脂糖加入50 mm/L Tris-CI (pH 8.0)中配制成1%瓊脂糖凝 膠溶液20 nl，微波加熱至瓊脂糖完全溶解。
(2) 待冷卻至60。C左右時(shí)，加入EB替代品1 yl，將混勻的瓊脂糖凝 膠溶液倒入插有梳子的水平電泳槽中，約20 min后溶液凝固。
(3) 待溶液凝固后將梳子從凝膠中快速拔出。 5. 5上樣、電泳
(1) 上樣之前加l W Loading buffer于各反應(yīng)體系中。
(2) 向電泳槽中倒入50 ram/LTris-Cl (pH 8. 0)，緩沖液要將凝膠上樣 孔完全覆蓋。
(3) 快速將各反應(yīng)樣本上樣到凝膠上樣孔中。
(4) 將電泳裝置與電源相通，選擇穩(wěn)壓模式，145 V，電泳40min。 5. 6拍照
在紫外波長(zhǎng)下用凝膠成像系統(tǒng)拍照。
6. 二維遷移速度測(cè)定(損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn))
(1) 于六孔板中每孔加細(xì)胞約4X105，用含10°/。小牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)。
(2) 待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用含無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液使細(xì)胞饑餓12 h。
(3) 用1 ml槍頭的尖端在孔中央作一垂直的劃痕，用PBS將刮掉的 細(xì)胞沖洗干凈。沿劃痕邊緣等距離間隔作5 6個(gè)標(biāo)記作為數(shù)據(jù)測(cè) 定點(diǎn)，測(cè)量時(shí)取平均值。
(4) 加入含或不含si脂A的無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。
(5) 分別于培養(yǎng)O h， 48 h拍照。
(6) 測(cè)量每個(gè)時(shí)間點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的劃痕兩側(cè)的細(xì)胞間距(ixm)，即以O(shè) h 劃痕邊沿距離減去48 h劃痕邊沿距離作為細(xì)胞遷移距離。 遷移速度二遷移距離/遷移時(shí)間
表l小干擾RNA沉默VASP表達(dá)對(duì)MCF-7 cell細(xì)胞遷移能力的影響(i 土s， n = 5)
VASP-942 siRNA組
陰性對(duì)照組
(200 uM)
細(xì)胞遷移速率("m/h)1.008±0. 37670. 692 ±0. 1864*
與陰性對(duì)照組相比* Z3 < 0.05
三維遷移/侵襲能力測(cè)定(Transwell)
于6孔培養(yǎng)板中放入細(xì)胞侵襲小室Transwell (裝有聚碳酸酯微孔膜孔徑 8pm，美國(guó)Costar公司)，用10嗎/mL I型膠原(購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司)包被 Transwdl小室底部(沒(méi)有包被步驟的為遷移實(shí)驗(yàn)，有包被則為侵襲實(shí)驗(yàn))， 無(wú)菌風(fēng)干。將細(xì)胞懸液加入上室，培養(yǎng)于37'C、 5%<:02培養(yǎng)箱至設(shè)定時(shí)間點(diǎn)， 取出細(xì)胞侵襲小室，PBS淋洗，用棉簽擦去微孔膜上層的細(xì)胞，將己經(jīng)侵 入并貼附于微孔膜下層的細(xì)胞固定于4 %多聚甲醛中10 min，結(jié)晶紫染色。 隨機(jī)計(jì)數(shù)8個(gè)視野，以確定遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)量，對(duì)比分析評(píng)價(jià)。侵襲能力, 移動(dòng)能力表示方法為各組侵入下層的細(xì)胞數(shù)。
8.統(tǒng)計(jì)方法
所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(f ± s)表示，組間數(shù)據(jù)比較采用方差 齊性檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。尸<0.05時(shí)各組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)施例1結(jié)果見(jiàn)附圖1-6,表1.
實(shí)施例2: siRNA沉默VASP抑制人肺癌A549細(xì)胞遷移及肺癌組織中VASP表達(dá) 1. siRNA沉默VASP抑制人肺癌A549細(xì)胞遷移能力
培養(yǎng)人肺癌A549細(xì)胞，細(xì)胞遷移能力的檢測(cè)操作步驟同具體實(shí)施例1步驟6.， 遷移速度測(cè)定(損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn))結(jié)果見(jiàn)圖7。 2..免疫組化SP法檢測(cè)肺癌中的VASP表達(dá)
收集武漢大學(xué)中南醫(yī)院腫瘤科臨床肺癌手術(shù)切除標(biāo)本，行常規(guī)HE染色供病 理診斷。
VASP免疫組化檢測(cè)采用SP法，其操作步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。所用VASP 單克隆抗體為鼠抗人VASP抗體(正273)購(gòu)于Alexis Biochemicals公司。VASP及
PCNA染色判斷標(biāo)準(zhǔn)按鏡下細(xì)胞內(nèi)染色顆粒的有無(wú)和細(xì)胞染色的深淺分為①陰 性(-):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)〈25。/。;染色淡；②陽(yáng)性(十 + + ):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)25 % 50 %; 染色為棕色； 強(qiáng)陽(yáng)性(+ + + + + + + ):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%;染色為深棕色。 免疫組化結(jié)果見(jiàn)圖8。
權(quán)利要求
1、 一種血管擴(kuò)張刺激磷蛋白在制備治療或預(yù)防肺癌藥物中的蛋白靶標(biāo)的應(yīng)用。
2、 一種血管擴(kuò)張刺激磷蛋白在制備治療或預(yù)防乳腺癌藥物中的蛋白靶標(biāo)的 應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種血管擴(kuò)張刺激磷蛋白在防治肺癌及乳腺癌藥物中的應(yīng)用，VASP作為早期預(yù)測(cè)乳腺癌、肺癌轉(zhuǎn)移能力、侵襲性的診斷標(biāo)志物及治療乳腺癌、肺癌藥物中的新蛋白靶標(biāo)的應(yīng)用。涉及采取siRNA技術(shù)特異性沉默人乳腺癌MCF-7等乳腺癌、肺癌細(xì)胞株中VASP、Rac1的表達(dá)水平，并進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移能力，這表明抑制Rac1活化、下調(diào)VASP基因可以顯著抑制惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移；免疫組化檢測(cè)臨床肺癌組織中VASP的表達(dá)水平，結(jié)合病理分期、分級(jí)，結(jié)果顯示，VASP在腫瘤組織中高表達(dá)，并且與高轉(zhuǎn)移有正相關(guān)。以上結(jié)果表明VASP可以作為早期預(yù)測(cè)乳腺癌、肺癌轉(zhuǎn)移能力、侵襲性的診斷標(biāo)志物，并且成為治療乳腺癌、肺癌藥物中的新蛋白靶標(biāo)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101361964SQ200810197009
公開(kāi)日2009年2月11日 申請(qǐng)日期2008年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月18日
發(fā)明者璇 周, 張京偉, 張懿敏, 靜 王, 彪 范, 韓國(guó)鴿, 蕾 魏 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)