專(zhuān)利名稱(chēng)：：血管擴(kuò)張刺激磷蛋白在防治消化系統(tǒng)腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種血管擴(kuò)張刺激磷蛋白(VASP)在防治消化系統(tǒng)惡性腫瘤藥物中的應(yīng)用，早期預(yù)測(cè)胃癌、直腸癌、結(jié)腸癌的診斷標(biāo)志物以及治療腫瘤藥物中的蛋白靶標(biāo)的用途。
背景技術(shù)：
：腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的生物學(xué)特征之一，也是腫瘤臨床治療的難題。據(jù)報(bào)道，60%以上的腫瘤患者在初診時(shí)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移。在臨床腫瘤患者中，約有80%—90%的患者，最終死于侵襲和轉(zhuǎn)移，也就是說(shuō)腫瘤的轉(zhuǎn)移最終成為大多數(shù)患者死亡的主要原因。根據(jù)衛(wèi)生部"2008年中國(guó)衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)提要"公布的"2007年前十位疾病死亡專(zhuān)率及死因構(gòu)成"，城市居民中，腫瘤死亡專(zhuān)率為176.23/10萬(wàn)，占死亡構(gòu)成28.53%，成為危害人群健康的"頭號(hào)殺手"，與2005年相比，城市居民、農(nóng)村居民惡性腫瘤的死亡率分別上升18.6個(gè)百分點(diǎn)、23.l個(gè)百分點(diǎn)，這意味著中國(guó)每年癌癥新發(fā)病例220萬(wàn)人，因癌癥死亡人數(shù)為160萬(wàn)人，每4-5個(gè)死亡者中就有一個(gè)死于癌癥。隨著我們中國(guó)人口自然增長(zhǎng)率和人口老齡化趨勢(shì)加劇，隨著我們城市現(xiàn)代化、城市信息化進(jìn)程加快，不良生活方式不斷增加，特別是農(nóng)村城市化、環(huán)境污染化加劇，惡性腫瘤發(fā)病率持續(xù)上升的趨勢(shì)還在加劇。而腫瘤轉(zhuǎn)移也具有特異性癌癥的細(xì)胞分化程度越低，浸潤(rùn)性越明顯，轉(zhuǎn)移發(fā)生也越早。VASP(Vasodilator-stimulatedphosphoprotein)基因位于人類(lèi)染色體19q13.213.3區(qū)域，編碼一種肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白。它最初是在血小板中發(fā)現(xiàn)的肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)蛋白，Ena/VASP蛋白家族是一組和肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)相關(guān)的多功能蛋白。該家族成員包括Mena(ma隨alianEna)、VASP、EVL(Ena/VASP-likeprotion)、Erm(D.rosophilaEnabled)、C.elegansUnc34(Caenorhabditiseleganshomologeofenabled)，以及DdVASP(DictyosteliumdiscoideumVASP)。其中，Mena、VASP、EVL存在于脊椎動(dòng)物中，Ena、C.elegansUnc234Ena存在于無(wú)脊椎動(dòng)物中；MVASP存在于網(wǎng)柱菌屬(Dictyostelium)中。Ena是唯一存在于果蠅中的該家族成員，是Abelson酪氨酸酶(Abl)的作用底物；VASP最初在血小板中發(fā)現(xiàn)，是PKG和PKA的作用底物；而Mena和EVL是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的Ena同系物。Ena/VASP蛋白家族的成員具有60%70%的同源性結(jié)構(gòu)，由三個(gè)共同的結(jié)構(gòu)區(qū)域組成氨基末端是EVH1區(qū)域、中心區(qū)域是富含脯氨酸的區(qū)域PRR、羧基末端是EVH2區(qū)域。該家族主要與細(xì)胞活動(dòng)中的肌動(dòng)蛋白解聚/聚合密切相關(guān)，如神經(jīng)細(xì)胞軸突的形成、血小板的聚集、成纖維細(xì)胞的移動(dòng)。根據(jù)氨基酸的序列及其功能分析可將VASP分為EVH1、PRR、EVH2三個(gè)功能區(qū)。EVH1區(qū)位于VASP的氨基末端，含112個(gè)氨基酸，由兩個(gè)反向的e-sheet形成一個(gè)P-sandwich結(jié)構(gòu)來(lái)提供一個(gè)可與蛋白質(zhì)結(jié)合溝即V型結(jié)合界面。富含脯氨酸區(qū)域的蛋白質(zhì)即在此結(jié)合形成PPII型構(gòu)象體(polyprolineconformation)?？膳cEVH1區(qū)域結(jié)合的富含脯氨酸結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)有幾種，其中主要的包括在Listeria菌表面蛋白ActA中的FP4元件；位于粘附斑(focaladhesion)復(fù)合體中的vinculin和zyxin蛋白；T細(xì)胞受體信號(hào)通路的成分Fyb/SLAP(Fyb—bindingprotein/SLP76—associatedprotein)、神經(jīng)車(chē)由突的弓l導(dǎo)蛋白R(shí)0B0/Semaphorin-6A-l及SAX-3/Robo(Ro-undabout)等。PREL1(prolinerichEVH1ligand)也是一種富含脯氨酸結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞遷移和伸展過(guò)程中，它一方面直接與VASP的EVH1區(qū)結(jié)合，另一方面與Ras結(jié)合，從而激活Ras信號(hào)通路發(fā)揮細(xì)胞骨架重排的作用。PRR區(qū)該區(qū)含有(GPs):,多肽鏈。由于該區(qū)域在Listeria等細(xì)菌的基于肌動(dòng)蛋白的移動(dòng)中起著重要作用，因此也被稱(chēng)為ABM2-(actin-basedraotility)序列，其序列可用XPPPPP表示，X可為G、A、L、S、P。此區(qū)域可與SH3片段、WW片段及另一種重要的肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)蛋白profilin結(jié)合。VASP的三個(gè)磷酸化位點(diǎn)之一的Serl57(serine157)位點(diǎn)位于此區(qū)域內(nèi)。EVH2區(qū)位于VASP的羧基末端，由160190個(gè)氨基酸構(gòu)成,其中含三個(gè)高保守性a螺旋，被兩個(gè)含幾十個(gè)氨基酸的非保守序列分隔開(kāi)。EVH2區(qū)域從氨基末端到羧基末端可進(jìn)一步劃分為A(225245)、B(259278)、C(343377)三個(gè)部分。A區(qū)域中有磷酸化位點(diǎn)Ser239(serine239);B區(qū)域是VASP與肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合的區(qū)域，肌動(dòng)蛋白絲也可使VASP形成二聚體，此區(qū)域含磷酸化位點(diǎn)Thr278(threonine278);C區(qū)域?yàn)樾纬蒝ASP四聚體所必需。人類(lèi)VASP的四聚體結(jié)構(gòu)域是一個(gè)由45個(gè)氨基酸殘基組成的右手a螺旋結(jié)構(gòu)，該右手螺旋結(jié)構(gòu)的形成基礎(chǔ)是15個(gè)氨基酸殘基的重復(fù)序列?？傊珽VH2的功能主要是與肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合以及自身形成四聚體，以利于肌動(dòng)蛋白形成束狀結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)VASP與粘附斑的結(jié)合。VASP整個(gè)蛋白序列由380個(gè)氨基酸組成，其中含有三個(gè)磷酸化位點(diǎn)，兩個(gè)為絲氨酸位點(diǎn)(Serl57、Ser239)，一個(gè)為蘇氨酸位點(diǎn)(Thr278)，這三個(gè)位點(diǎn)的磷酸化直接受PKG、PKA的調(diào)控。最新研究表明，在人胚腎細(xì)胞中，由誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)產(chǎn)生的NO可以激活內(nèi)源性NO敏感性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，并導(dǎo)致VASP磷酸化在平滑肌細(xì)中，VASPSerl57位點(diǎn)的磷酸化可以發(fā)揮刺激生長(zhǎng)的效應(yīng)，而其Ser239位點(diǎn)的磷酸化卻與NO介導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)有關(guān)。VASP對(duì)細(xì)胞骨架有調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞骨架不僅可以維持細(xì)胞形態(tài)，在細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間的連接中同樣發(fā)揮作用，VASP直接與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合也說(shuō)明VASP參與細(xì)胞骨架的重構(gòu)。在調(diào)控細(xì)胞遷移和細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)方面發(fā)揮著重要作用。在細(xì)胞內(nèi)，VASP主要聚集在與細(xì)胞粘附和細(xì)胞移動(dòng)相關(guān)的區(qū)域，包括細(xì)胞遷移的前沿、局部粘附斑、細(xì)胞間粘附連接處及細(xì)胞膜上具高動(dòng)態(tài)變化的區(qū)域(leadingedge),參與調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附和伸展過(guò)程中肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重排，在細(xì)胞遷移過(guò)程中起著重要作用1999年KELILIU等人發(fā)現(xiàn)VASP蛋白的缺失可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生，同時(shí)他們還提出VASP蛋白過(guò)表達(dá)和低水平表達(dá)均可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)型。最近，Dertsiz等還發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中VASP的表達(dá)明顯高于正常水平，且隨著腫瘤分化程度的降低其表達(dá)水平逐漸升高。另外VASP在體內(nèi)分布廣泛，在體內(nèi)，它主要在肺、胃、大腸、及平滑肌中含量豐富；腦、心臟、腎、小腸中也存在；只有肝臟和骨骼肌中檢測(cè)不到VASP。在這些組織中VASP的表達(dá)可以見(jiàn)于內(nèi)皮細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，腎小球系膜細(xì)胞，心肌細(xì)胞，巨核細(xì)胞，浦肯野纖維中。在細(xì)胞內(nèi)，VASP主要存在于應(yīng)激纖維、粘附斑上應(yīng)激纖維的末端，細(xì)胞間連接及細(xì)胞膜上具有高度動(dòng)態(tài)性變化的區(qū)域。目前，惡性腫瘤病人在來(lái)醫(yī)院就診時(shí)，大多數(shù)惡性腫瘤已經(jīng)有不同程度的腫瘤的浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移，腫瘤浸潤(rùn)過(guò)程中往往缺乏很好的指標(biāo)對(duì)腫瘤侵襲性強(qiáng)弱判斷的指標(biāo)，進(jìn)而，對(duì)腫瘤病人預(yù)后的評(píng)估常常不準(zhǔn)確。因此，我們目前發(fā)現(xiàn)研究的VASP與腫瘤的侵襲和遷移有著密切的聯(lián)系，VASP在侵襲力強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，同時(shí)，抑制VASP也會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是一個(gè)多基因參與通過(guò)多步驟完成的復(fù)雜過(guò)程，涉及腫瘤細(xì)胞自身生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的獲得，細(xì)胞間黏附能力的降低，癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外間質(zhì)和基底膜的降解與破壞，細(xì)胞骨架重構(gòu)引起細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與遷移，以及腫瘤血管和淋巴管生成，癌細(xì)胞逃逸凋亡和免疫殺傷等諸多因素，而且這些因素是互相關(guān)聯(lián)和相互影響的。目前，DertsizL等人在對(duì)正常肺組織和肺腺癌組織以及不同分化層次的癌組織VASP表達(dá)的差異的研究中已經(jīng)證實(shí)，與正常肺組織相比，VASP在肺腺癌組織中是高表達(dá)的，而且VASP的表達(dá)和肺癌組織的分化程度、病理分期密切相關(guān)。KeyiLiu等人研究也發(fā)現(xiàn)，在野生型的NIH3T3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)VASP能導(dǎo)致其向腫瘤轉(zhuǎn)化。這些提示VASP在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中的可能作用。我們通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究揭示VASP在多種常見(jiàn)惡性腫瘤細(xì)胞遷移中的正性調(diào)控作用及其上游調(diào)控機(jī)制涉及采取siRNA技術(shù)特異性沉默人乳腺癌MCF-7等各種惡性腫瘤細(xì)胞株中VASP、Racl的表達(dá)水平，并進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移能力，這表明抑制Racl活化、下調(diào)VASP基因可以顯著抑制惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移；免疫組化檢測(cè)臨床胃癌、肺癌等組織中VASP的表達(dá)水平，結(jié)合病理分期分級(jí)，結(jié)果顯示，VASP在多種常見(jiàn)惡性腫瘤組織中高表達(dá)，并且與高轉(zhuǎn)移有正相關(guān)。以上結(jié)果表明VASP可以作為早期預(yù)測(cè)肺癌、胃癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、黑色素瘤等惡性腫瘤轉(zhuǎn)移能力、侵襲性的診斷標(biāo)志物，并且成為治療這些惡性腫瘤的靶向蛋白。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種血管擴(kuò)張刺激磷蛋白(VASP)在防治消化系統(tǒng)腫瘤藥物中的應(yīng)用，VASP作為早期預(yù)測(cè)胃癌、直腸癌、結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移能力、侵襲性的診斷標(biāo)志物及治療胃癌、直腸癌、結(jié)腸癌藥物中的新蛋白耙標(biāo)。siRNA-VASP能夠使人胃癌BGC-823細(xì)胞、直腸癌ColO320細(xì)胞、結(jié)腸癌SW620細(xì)胞株細(xì)胞遷移速度分別下降44.4%、38.9%、42.1%。本發(fā)明涉及一種早期預(yù)測(cè)胃癌、直腸癌、結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移能力、侵襲性的診斷標(biāo)志物及治療胃癌、直腸癌、結(jié)腸癌藥物中的新蛋白靶標(biāo)的應(yīng)用。涉及采取siRNA技術(shù)特異性沉默人乳腺癌MCF-7等多種惡性腫瘤細(xì)胞株中VASP、Racl的表達(dá)水平，并進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移能力，這表明抑制Racl活化、下調(diào)VASP基因可以顯著抑制惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移；免疫組化檢測(cè)臨床胃癌、肺癌等組織中VASP的表達(dá)水平，結(jié)合病理分期分級(jí)，結(jié)果顯示，VASP在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)，并且與高轉(zhuǎn)移有正相關(guān)。以上結(jié)果表明VASP可以作為早期預(yù)測(cè)胃癌、直腸癌、結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移能力、侵襲性的診斷標(biāo)志物，并且成為治療胃癌、直腸癌、結(jié)腸癌藥物中的新蛋白靶標(biāo)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施本發(fā)明使用上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司化學(xué)合成的，針對(duì)VASP(Genbankaccessionnumber:BC038224)耙基因的三對(duì)siRNA片段VASP-siRNAs(VASP-942、VASP-1002、VASP-1024)、陰性對(duì)照siRNA和FAM標(biāo)記的siRNA，通過(guò)脂質(zhì)體Lipofectamine2000，(購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Invitrogen公司，目錄號(hào)297975)法，分別轉(zhuǎn)染至常規(guī)方法培養(yǎng)的人胃癌BGC-823細(xì)胞、直腸癌Colo320細(xì)胞、結(jié)腸癌SW620細(xì)胞株(武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心提供)，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況，轉(zhuǎn)染48h后，RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞VASPmRNA水平，WesternBlot檢測(cè)細(xì)胞VASP蛋白水平，二維或三位細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)鑒定腫瘤細(xì)胞遷移或侵襲能力；同時(shí)在武漢大學(xué)中南醫(yī)院腫瘤科收集臨床胃癌、直腸癌、結(jié)腸癌的組織標(biāo)本，采用免疫組化的方法檢測(cè)組織中的VASP的表達(dá)水平。具體
發(fā)明內(nèi)容如下A.化學(xué)合成VASPsiRNA及RaclsiRNA采用化學(xué)方法合成(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)針對(duì)VASP(Genbankaccessionnumber:BC038224)耙基因的三對(duì)siRNA片段(VASP-942、VASP-1002、VASP-1024)、陰性對(duì)照siRNA和FAM標(biāo)記的siRNA。合成針對(duì)調(diào)控VASP的Racl(Genbankaccessionnumber:AF498964)耙基因的三對(duì)siRNA片段(Racl-439、Racl-99、Racl-328)、陰性對(duì)照siRNA。siRNA用來(lái)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，觀察通過(guò)抑制VASP基因能否到達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用及其機(jī)制。B.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染VASPsiRNA沉默VASP基因常規(guī)方法培養(yǎng)的人胃癌BGC-823細(xì)胞、直腸癌Colo320細(xì)胞、結(jié)腸癌SW620細(xì)胞株(武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心提供)，細(xì)胞隔天換液，生長(zhǎng)至80%90%融合時(shí)傳代。轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)、細(xì)胞鋪于六孔板、使其在轉(zhuǎn)染日密度為90%，用無(wú)血清的培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12h，Lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)染VASP-si腿s(942、1002、1024)、陰性對(duì)照siRNA，在37。C、5%〔02及飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育，6h后換生長(zhǎng)培養(yǎng)液直至48h備用。C.RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中VASPmRNA表達(dá)水平脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNAs48h后用RT-PCR測(cè)定細(xì)胞VASPmRNA表達(dá)水平，鑒定在m腦A水平VASPsiRNA抑制VASP表達(dá)的效果。D.WesternBlot檢測(cè)VASP蛋白表達(dá)水平脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNAs48h后，裂解細(xì)胞提取總蛋白，用WesternBlot檢測(cè)細(xì)胞VASP蛋白表達(dá)水平，鑒定在蛋白水平VASPsiRNA抑制VASP表達(dá)的效果。E.二維遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力二維遷移實(shí)驗(yàn)，即損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)，用于鑒定細(xì)胞二維的遷移能力于六孔板中每孔加入細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用1ml槍頭的尖端在孔中央作一垂直的劃痕，沿劃痕邊緣等距離間隔作5-6個(gè)標(biāo)記作為數(shù)據(jù)測(cè)定點(diǎn)，加入含或不含siRNA的無(wú)血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)0h，48h拍照。測(cè)量每個(gè)時(shí)間點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的劃痕兩側(cè)的細(xì)胞間距(um)，即以0h劃痕邊沿距離減去48h劃痕邊沿距離作為細(xì)胞遷移距離，計(jì)算單位時(shí)間細(xì)胞遷移速度，反應(yīng)細(xì)胞二維遷移能力。F.三維遷移/侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移/侵襲能力三維侵襲實(shí)驗(yàn)，即Transwell法，用于鑒定細(xì)胞三維的遷移/侵襲能力采用細(xì)胞侵襲小室Transwell(裝有聚碳酸酯微孔膜孔徑8um，美國(guó)Costar公司)，預(yù)先侵襲小室上表面沒(méi)有包被任何材料的用于細(xì)胞三維遷移能力檢測(cè)，而預(yù)先用10yg/mLI型膠原(購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司)包被Transwell小室底部以模擬細(xì)胞外基質(zhì)用于細(xì)胞三維侵襲能力檢測(cè)。將細(xì)胞接種于預(yù)處理好的侵襲小室上室內(nèi)，下室內(nèi)加入含高血清的培養(yǎng)液誘導(dǎo)，規(guī)定時(shí)間后計(jì)數(shù)遷移至下表面的細(xì)胞總數(shù)，反應(yīng)細(xì)胞三維/侵襲能力。G.免疫組化SP法檢測(cè)腫瘤組織中VASP的表達(dá)臨床病理標(biāo)本按病理檢查標(biāo)準(zhǔn)確定分期、分級(jí)，VASP表達(dá)水平檢查采用免疫組化SP法，按照鏡下細(xì)胞內(nèi)染色顆粒的有無(wú)和細(xì)胞染色的深淺對(duì)VASP陽(yáng)性程度進(jìn)行分類(lèi)，統(tǒng)計(jì)分析惡性腫瘤組織中VASP表達(dá)水平與病理分期分級(jí)的相關(guān)性。本發(fā)明與現(xiàn)有惡性腫瘤防治技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1.VASP作為細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞遷移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。2.本發(fā)明表明在消化系統(tǒng)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移調(diào)控過(guò)程中VASP蛋白發(fā)揮重要的作用。3.本發(fā)明表明VASP可以作為一種早期預(yù)測(cè)胃癌、直腸癌、結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移能力、侵襲性的診斷標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移。4.本發(fā)明表明VASP可以作為治療胃癌、直腸癌、結(jié)腸癌的新靶標(biāo)蛋白。圖1.胃癌BCG-823細(xì)胞VASP-siRNART-PCR結(jié)果VASP-942siRNA組的VASPmRNA表達(dá)水平較陰性對(duì)照組下調(diào)，兩者差異有顯著性(*代0.05)，表明VASPsiRNA顯著抑制細(xì)胞中VASP表達(dá)。圖2.VASP-siRNA抑制胃癌BCG-823細(xì)胞二維遷移能力VASP-942siRNA組胃癌BCG-823細(xì)胞二維遷移速度較對(duì)照組低，兩者差異有顯著性(*代0.05)，表明VASPsiRNA顯著抑制胃癌BCG-823細(xì)胞二維遷移能力。圖3.胃癌組織中VASP的表達(dá)(A)高分化腺癌中VASP的表達(dá)(B)中分化腺癌中VASP的表達(dá)(C)低分化的腺癌中VASP的表達(dá)(X200)圖4.VASP-siRNA抑制直腸癌Colo320細(xì)胞二維遷移能力VASP-942siRNA組細(xì)胞二維遷移速度較對(duì)照組低，兩者差異有顯著性(承代O.05)。圖5.直腸癌組織中VASP的強(qiáng)表達(dá)圖6.VASP-siRNA抑制結(jié)腸癌SW620細(xì)胞二維遷移能力VASP-942siRNA組細(xì)胞二維遷移速度較對(duì)照組低，兩者差異有顯著性(*代0.05)。圖7.結(jié)腸癌組織中VASP的強(qiáng)表達(dá)具體實(shí)施例方式下面以VASP在胃癌、直腸癌、結(jié)腸癌中的作用，說(shuō)明其用途實(shí)施例1:siRNA沉默VASP抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞遷移及胃癌組織中VASP表達(dá)與病理分期關(guān)系分析材料與方法一、試劑和儀器1.采用試劑(1)RPMI-1640培養(yǎng)基Sigma(2)小牛血清(calfserum,CS)Hyclone(3)胰蛋白酶Amresco(4)L-谷氨酰胺(L-Glutandne)Gibco(5)EDTA-Na2'2H20Amresco(6)十二烷基磺酸鈉(SDS)Sigraa.(7)N，N'-亞甲雙丙烯酰胺Fluka(8)丙烯酰胺Amresco(9)TEMEDSigma(10)甘氨酸Amresco(11)過(guò)硫酸銨(AP)Sigma(12)二硫蘇糖醇(DTT)Amresco(13)硝酸纖維素膜(NC膜)A.P(14)牛血清白蛋白(BSA)Amresco(15)TritonX-100Amresco(16)Tween-20Amresco(17)單克隆鼠抗人VASP抗體(IE273)AlexisBiochemicals(18)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(19)鼠抗人Racl抗體23A8UpstateBiotechnology公司(20)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒碧云天生物技術(shù)研究所(21)DAB顯色試劑盒Piecre(22)RevertAidTMFirstStrandc腿SynthesisKitFermentas(23)瓊脂糖Spanish(24)Tris-HClSigma(25)EDTASigma(26)PMSFAmresco(27)EGTASigma(28)P-merc鄰toethanolAmresco(29)aprotininSigma(30)le叩印tinSigma(31)RNAi片段上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。2.試劑的配制2.1細(xì)胞培養(yǎng)主要試劑的配制(1)RPMI-1640培養(yǎng)基RPMI-1640干粉一袋溶解于1000ml雙蒸水中，振蕩使之完全溶解，經(jīng)孔徑為0.22的濾膜過(guò)濾除菌后即為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分裝后凍存于-2(TC。臨用前每85ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入10ml小牛血清，0.2mol/L的L-谷氨酰胺1ml，雙抗1ml(含青霉素1萬(wàn)單位，鏈霉素1萬(wàn)單位)，用10%的NaHCO"周pH為7.0-7.2，4。C保存。(2)PBS緩沖液-.NaCl8.0g，KC10.2g，Na2HP0412H202.89g，NaH2P040.2g，加雙蒸水至1000ml，高壓滅菌后室溫(20-25°C，以下相同)保存。(3)細(xì)胞傳代消化液(0.25%胰蛋白酶-EDTA):胰蛋白酶2.5g，EDTANa22H,00.2g，加PBS緩沖液至1000ml，用NaOH將消化液的pH調(diào)至7.2左右，經(jīng)孔徑為0.22um的濾膜過(guò)濾除菌，分裝后凍存于-20"C備用。(4)青、鏈霉素雙抗溶液青霉素100萬(wàn)單位，鏈霉素100萬(wàn)單位，溶于100ml滅菌雙蒸水中，分裝后-2(TC保存。使用時(shí)每100ml培養(yǎng)液中加入lml雙抗溶液。(5)谷氨酰胺谷氨酰胺粉末2.922g，溶于100tnl雙蒸水中，0.22urn的微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝，-2(TC保存。使用時(shí)每100ml培養(yǎng)液中加入lml谷氨酰胺溶液。2.2免疫印跡試劑的配制(1)細(xì)胞裂解液20咖ol/LTris-Cl(pH7.5)，150咖ol/LNaCl,1%TritonX-亂(2)1.5mol/LTris-Cl(pH8.8):9.0825gTris堿，40ml雙蒸水，調(diào)pH至8.8，定容至50ml。(3)1mol/LTris-Cl(pH6.8):6.055gTris堿，40ml雙蒸水，調(diào)pH至6.8，定容至50ml。(4)30%凝膠儲(chǔ)備液29g丙烯酰胺，60ml雙蒸水，水浴30-40。C，直至丙烯酰胺溶解。1gN，N，-亞甲雙丙烯酰胺，10ral雙蒸水，溶解后與丙烯酰胺液混合，定容至IOOml，4'C避光保存。(5)10%SDS:10gSDS，90ml雙蒸水，加熱助溶，定容至100ml，4'C保存?zhèn)溆谩?6)5XSDS-PAGE上樣緩沖液250mmol/LTris-Cl(pH6.8)，10%SDS，5%溴酚藍(lán)，50%甘油，DTT臨用前加入，終濃度為100mmol/L。(7)10%AP:0.3gAP，3ml雙蒸水，4。C保存，隔周配制。(8)15ml10%分離膠:雙蒸水5.9ml，30%凝膠儲(chǔ)備液5.0ml,1.5mol/LTris-Cl(pH8.8)3.8ml，10%SDS0.15ml，10%AP0.15ml，TEMED0.008ml。(9)4ml5%濃縮膠:雙蒸水2.7ml,30%凝膠儲(chǔ)備液0.67ml,1.0mol/LTris-Cl(pH8.8)0.5ml，10%SDS0.04ral，10%AP0.04ml,TEMED0.006ml。(10)5X電泳緩沖液7.55gTris堿，47g甘氨酸，25ml10%SDS，450ml雙蒸水，調(diào)pH至8.3，定容至500ml。(11)轉(zhuǎn)移緩沖液5.81gTris堿，2.93g甘氨酸，0.37gSDS，溶于500ml雙蒸水，溶解后加200ml甲醇和250ml雙蒸水，調(diào)pH至8.3,定容至1000ml。(12)漂洗液(pH7.6):Tris堿2.42g，NaCl8.0g，Tween-201ml,雙蒸水溶解后，調(diào)pH7.6，定容至1000ml。(13)封閉液2.5gBSA溶于50ml漂洗液(pH7.6)。2.3RT-PCR試劑的配制(1)5XTBE緩沖液:Tris堿10.8g，硼酸5.5g，0.5mol/LE歸4ml,加水至200ml，室溫保存。使用時(shí)，稀釋為0.5XTBE緩沖液。(2)2。/。DNA凝膠制備(20ml):瓊脂糖0.4g，5XTBE緩沖液2ml，雙蒸水18ml，加熱溶解，待溫度降至6(TC時(shí)加入1iilEB00mg/ml)，混勻后加入預(yù)先準(zhǔn)備的制膠板中，放置lh后即可進(jìn)行副A電泳，電泳緩沖液為0.5XTBE。3.采用儀器(1)超凈工作臺(tái)YJ-1450型蘇州凈化設(shè)備公司(2)二氧化碳培養(yǎng)箱SHEL-LAB,USA(3)DMBRI倒置相差熒光顯微鏡LEICA，Germany(4)電子天平JY型上海精密科學(xué)儀器有限公司(5)-90。C冰箱382E型日本三洋(6)-20。C冰箱中國(guó)海爾(7)臺(tái)式低溫高速離心機(jī)TGL-16G型上海醫(yī)用分析儀器廠(chǎng)(8)臺(tái)式離心機(jī)TDL-40B型上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)(9)普通恒溫?fù)u床HYA型中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠(chǎng)(10)熒光酶標(biāo)儀TECAN(11)穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYY-6B型北京市六一儀器廠(chǎng)(12)電泳槽DYPC-24D型北京市六一儀器廠(chǎng)(13)轉(zhuǎn)印槽DYCZ-40D型北京市六一儀器廠(chǎng)(14)水浴鍋HH-WZ1-420型北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠(chǎng)(15)凝膠成像分析系統(tǒng)WD-9413A型北京市六一儀器廠(chǎng)(16)超純水系統(tǒng)北京市六一儀器廠(chǎng)(17)微型旋渦混合儀WH-2型上海滬西分析儀器廠(chǎng)(18)微量移液器200-1000"1、20-200u1、1-20u1、0.5-10ul大龍(19)制冰機(jī)GRANT(20)紫外投射反射檢測(cè)分析儀上?？等A生化儀器制作廠(chǎng)二、實(shí)驗(yàn)方法1.化學(xué)合成VASPsiRNA和RaclsiRNA采用化學(xué)方法合成針對(duì)VASP(Genbankaccessionnumber:BC038224)靶基因的三對(duì)siRNA片段(VASP-942、VASP-1002、VASP-1024)、陰性對(duì)照siRNA和FAM標(biāo)記的siRNA。合成針對(duì)Racl(Genbankaccessionnumber:AF498964)靶基因的三對(duì)siRNA片段(Racl-439、Racl-99、Racl-328)、陰性對(duì)照siRNA。序列如下VASP942-960bpVASP1002-1020bpVASP1024-1042bpNegativecontrolRacl439-457bpRacl99-117bpRacl328-346bpNegativecontrol2.細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株、MDA-MB-231細(xì)胞株(由武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心提供)用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37°C、5%0)2及飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞隔天換液，生長(zhǎng)至80%90%融合時(shí)傳代。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率〉95%。3.細(xì)胞分組和處理轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)、細(xì)胞鋪于六孔板、使其在轉(zhuǎn)染日密度為90%，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合時(shí)，用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12h，實(shí)驗(yàn)分為四組陰性對(duì)照siRNA組、VASP-942siRNA組，VASP-1002siRNA組，VASP-1024siRNA組；陰性對(duì)照si認(rèn)A組、Racl-439siRNA組，Racl-99siRNA組，Racl-328siRNA組。對(duì)于每組細(xì)胞，使用250ul無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋100pmolsiRNA，使15sense5，-CAACCUUGCCAAGGAUGAATT-3'antisense5，-UUCAUCCUUGGCAAGGUUGTG-3，sense5，-CGCCCAGCUCCAGUGAUUATT-3'antisense5，-UAAUCACUGGAGCUGGGCGTG-3'sense5，-GGACCUACAGAGGGUGAAATT-3'antisense5，-UUUCACCCUCUGUAGGUCCGA-3'sense5，-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3，antisense5，-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'sense:5'-GGAGATTGGTGCTGTAAAA-3'antisense:5'-UUUUACAGCACCAAUCUCG-3,sense:5'-CUACUGUCUUUGACAAUUA-3';antisense:5'誦UAAUUGUCAAAGACAGUAG-3'sense:5'-CAUCCUAGUGGGAACUAAA隱3、antisense:5'-UUUAGUUCCCACUAGGAUG3'sense:5'陽(yáng)UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'用250yl無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋5u1Lipofectamine2000，后者室溫孵育5min?；旌舷♂尩膕iRNA和稀釋的Lipofectamine2000,室溫孵育20min。直接將復(fù)合物加入每孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板、輕輕混勻。在37'C、5%0)2及飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育，6h后換生長(zhǎng)培養(yǎng)液直至48h。4.WesternBlot鑒定VASP蛋白表達(dá)的改變4.1細(xì)胞總蛋白的提取(1)取各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌后吸凈殘余的PBS液體。(2)加入細(xì)胞裂解液，置冰上裂解15min。(3)裂解結(jié)束后，用干凈的細(xì)胞刮迅速將細(xì)胞刮至培養(yǎng)瓶的一側(cè)，然后用移液器將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5mlEp管中。(4)4。C，14000rpm離心10min。(5)將離心后的上清液轉(zhuǎn)移到另一Ep管中，-90。C保存。4.2細(xì)胞總蛋白的定量(1)配制工作液根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50:1)配制適量BCA工作液，充分混勻。(2)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品取10W標(biāo)準(zhǔn)品用適量PBS稀釋?zhuān)蛊浣K濃度為0.5mg/mL。將標(biāo)準(zhǔn)品按0，1,2，4，8，12，16，20W加到96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中，再分別加適量PBS補(bǔ)足到20W。(3)加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中，補(bǔ)加PBS到20W。(4)每孔加入200WBCA工作液，37。C放置30min。(5)冷卻到室溫，用酶標(biāo)儀測(cè)定0D570nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出各樣本蛋白濃度。4.3SDS-PAGE電泳(1)準(zhǔn)備玻璃板、梳子，依次用無(wú)水乙醇、自來(lái)水、雙蒸水洗滌，晾干或用濾紙擦干。(2)將玻璃板固定于垂直電泳槽。(3)配制10%的分離膠，小心地將分離膠緩慢灌入兩塊玻璃板之間，留出濃縮膠所需空間，然后加適量雙蒸水于凝膠表面以隔絕空氣，室溫下靜置30min左右，待分離膠凝固。(4)分離膠凝固后，倒掉凝膠表面的雙蒸水，然后將配制好的5%的濃縮膠灌入膠板之間，插入合適的梳子，置室溫30min左右，待濃縮膠凝固。(5)在濃縮膠聚合的同時(shí)，在上樣的蛋白樣品中加入適量5XSDS上樣緩沖液至終濃度為1X，同時(shí)加入適量DTT，其終濃度為100mmol/L,混勻后，于沸水中煮5min使蛋白變性。(6)濃縮膠凝固后，拔去梳子，加入1X電泳緩沖液，將處理好的樣品及marker小心上樣到凝膠上樣孔內(nèi)。(7)將電泳裝置與電源相接，選擇穩(wěn)壓模式，出孔電壓為40V，當(dāng)指示劑進(jìn)入濃縮膠后將電壓提高至80V，進(jìn)入分離膠后將電壓提高至150V，電泳34h后關(guān)閉電源。(8)電泳結(jié)束后，取出玻璃板，小心將其分開(kāi)，用手指沿邊緣小心剝出凝膠。4.4蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移(1)在托盤(pán)中倒入轉(zhuǎn)移緩沖液，高度以剛剛浸沒(méi)轉(zhuǎn)印夾和海綿為宜。浸泡轉(zhuǎn)印夾和海綿。(2)戴手套剪2塊Whatman3顧濾紙、1塊NC膜(靠膠面的濾紙《膠的大小，靠膜面的濾紙《膜的大小)，浸泡于托盤(pán)轉(zhuǎn)移緩沖液中5min。(3)在海綿上從負(fù)極到正極依次鋪上濾紙、凝膠、NC膜、濾紙，逐層趕出氣泡，蓋上海綿，扣好轉(zhuǎn)印夾，放入轉(zhuǎn)印槽。將轉(zhuǎn)印槽置于冰上，接上轉(zhuǎn)印儀，選擇穩(wěn)流模式，電流大小為膜的長(zhǎng)(cm)X寬(cm)X2，轉(zhuǎn)印2h后關(guān)閉電源。4.5免疫顯色(1)轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出轉(zhuǎn)印夾，用平頭小鑷子夾出NC膜，蛋白面朝上，剪去左上角作為標(biāo)記，浸泡于含有適量新配置的封閉液的平皿中，蓋上錫紙，室溫輕搖封閉2h。(2)加入用封閉液稀釋的I抗(VASP1:800稀釋?zhuān)琑acl1:300稀釋)，4'C孵育，靜置過(guò)夜。(3)用漂洗液洗膜3次，每次10min。(4)漂洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的II抗(1:2000稀釋)，置于搖床上室溫振蕩孵育1h。(5)用漂洗液洗膜3次，每次IOmin。(6)取1ml雙蒸水，加入DAB試劑盒中A試劑1滴，混勻后再分別加入B試劑1滴和C試劑1滴，充分混勻后倒在NC膜上，避光顯色23min，自來(lái)水終止反應(yīng)，凝膠成像系統(tǒng)拍照。5.RT-PCR鑒定VASPmRNA表達(dá)的改變5.1細(xì)胞總RNA的提取于鑒定(1)取各處理組細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，用DEPC水配置并4。C預(yù)冷的PBS清洗1次，倒置。(2)每孔細(xì)胞加入Trizol試劑1ml，直接裂解細(xì)胞，5min后，將充分混勻的細(xì)胞裂解液移至EP管中。(3)每mlTrizol加入0.2ml氯仿，vortex混勻15s，室溫放至2-3min。(4)12000g4。C離心15min，然后吸取含總RNA的上層水相至一新的離心管中，每mlTrizol約可吸取0.5-0.55ml。(5)按每ml最初的Trizol加入0.5ml異丙醇，顛倒數(shù)次混勻，室溫沉淀10min。(6)12000g4。C離心10min，在管底可見(jiàn)膠狀RNA沉淀，棄上清。(7)每ml最初的Trizol加入1ml75%乙醇，vortex混勻。(8)7500g4。C離心5min，棄上清，再用離心機(jī)甩一下，小心吸盡液體。(9)待認(rèn)A略干后，加入20ulDEPC水溶解，-7(TC保存。5.2逆轉(zhuǎn)錄試劑盒樣品RNA6n1，下游引物1u1,加入DEPC處理雙蒸水至總體積為12Ul，混勻并上下顛倒3-5s，于70。C，孵育5min。立即冰上冷卻，加入5Xbuffer4pl，RNA酶抑制劑1y1，10mMdNTPmix2y1，混勻后稍離心，37°C,5min孵育，加入逆轉(zhuǎn)錄酶1P1，42°C60min孵育，70°C，10min終止反應(yīng)，冰上冷卻，-20。C保存。5.3PCRIOXPCR緩沖液5ulMg2+3u1dNTPmix(10mM)1y110mM上下游引物各11TaqDNA聚合酶1.5li1逆轉(zhuǎn)錄cDNA5u1DEPC處理水32.5"I反應(yīng)體系50ul輕柔混合反應(yīng)體系，短暫離心。反應(yīng)條件VASP:94°C，40s;60。C，30s;72°C，30s;30個(gè)循環(huán)Racl:94°C，40s;54°C，30s;72°C，30s;30個(gè)循環(huán)。5.4凝膠的制備(1)將瓊脂糖加入50mm/LTris-Cl(pH8.0)中配制成1%瓊脂糖凝膠溶液20"1，微波加熱至瓊脂糖完全溶解。(2)待冷卻至60'C左右時(shí)，加入EB替代品1"1，將混勻的瓊脂糖凝膠溶液倒入插有梳子的水平電泳槽中，約20min后溶液凝固。(3)待溶液凝固后將梳子從凝膠中快速拔出。5.5上樣、電泳(1)上樣之前加lWLoadingbuffer于各反應(yīng)體系中。(2)向電泳槽中倒入50隱/LTris-Cl(pH8.0)，緩沖液要將凝膠上樣孔完全覆蓋。(3)快速將各反應(yīng)樣本上樣到凝膠上樣孔中。(4)將電泳裝置與電源相通，選擇穩(wěn)壓模式，145V，電泳40min。5.6拍照在紫外波長(zhǎng)下用凝膠成像系統(tǒng)拍照。6.二維遷移速度測(cè)定(損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn))(1)于六孔板中每孔加細(xì)胞約4X105，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。(2)待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用含無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液使細(xì)胞饑餓12(3)用1ml槍頭的尖端在孔中央作一垂直的劃痕，用PBS將刮掉的細(xì)胞沖洗干凈。沿劃痕邊緣等距離間隔作56個(gè)標(biāo)記作為數(shù)據(jù)測(cè)定點(diǎn)，測(cè)量時(shí)取平均值。(4)加入含或不含siRNA的無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。(5)分別于培養(yǎng)Oh，48h拍照。(6)測(cè)量每個(gè)時(shí)間點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的劃痕兩側(cè)的細(xì)胞間距(！im)，即以O(shè)h劃痕邊沿距離減去48h劃痕邊沿距離作為細(xì)胞遷移距離。遷移速度=遷移距離/遷移時(shí)間7.三維遷移/侵襲能力測(cè)定(Transwell)于6孔培養(yǎng)板中放入細(xì)胞侵襲小室Transwell(裝有聚碳酸酯微孔膜孔徑8pm，美國(guó)Costar公司)，用10嗎/mLI型膠原(購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司)包被Tmnswell小室底部(沒(méi)有包被步驟的為遷移實(shí)驗(yàn)，有包被則為侵襲實(shí)驗(yàn))，無(wú)菌風(fēng)干。將細(xì)胞懸液加入上室，培養(yǎng)于37'C、5%(302培養(yǎng)箱至設(shè)定時(shí)間點(diǎn)，取出細(xì)胞侵襲小室，PBS淋洗，用棉簽擦去微孔膜上層的細(xì)胞，將已經(jīng)侵入并貼附于微孔膜下層的細(xì)胞固定于4%多聚甲醛中10min，結(jié)晶紫染色。隨機(jī)計(jì)數(shù)8個(gè)視野，以確定遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)量，對(duì)比分析評(píng)價(jià)。侵襲能力，移動(dòng)能力表示方法為各組侵入下層的細(xì)胞數(shù)。8.免疫組化檢測(cè)胃癌組織中VASP表達(dá)及其與病理分期關(guān)系分析收集武漢大學(xué)中南醫(yī)院腫瘤科臨床胃癌手術(shù)切除標(biāo)本，胃癌組織標(biāo)本均行常規(guī)HE染色供病理診斷。VASP免疫組化檢測(cè)采用SP法，其操作步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。所用VASP單克隆抗體為鼠抗人VASP抗體(IE273)購(gòu)于AlexisBiochemicals公司。VASP及PCNA染色判斷標(biāo)準(zhǔn)按鏡下細(xì)胞內(nèi)染色顆粒的有無(wú)和細(xì)胞染色的深淺分為①陰性(-):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<25%;染色淡；陽(yáng)性(+++):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)25%50%;染色為棕色；③強(qiáng)陽(yáng)性(+++++++):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%;染色為深棕色。免疫組化結(jié)果見(jiàn)圖9，胃癌組織中VASP表達(dá)量與臨床病理學(xué)分級(jí)的關(guān)系分析如表l:表1.胃癌組織中VASP表達(dá)量與臨床病理學(xué)分級(jí)的關(guān)系分析<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實(shí)施例1結(jié)果見(jiàn)附圖1-3，表l.實(shí)施例2:siRNA沉默VASP抑制人直腸癌Colo320細(xì)胞遷移及直腸癌組織中VASP表達(dá)1.siRNA沉默VASP抑制人直腸癌Colo320細(xì)胞遷移能力培養(yǎng)人直腸癌Colo320細(xì)胞，細(xì)胞遷移能力的檢測(cè)操作步驟同具體實(shí)施例1歩驟6，遷移速度測(cè)定(損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn))結(jié)果見(jiàn)圖4。2.免疫組化SP法檢測(cè)直腸癌組織中VASP表達(dá)收集武漢大學(xué)中南醫(yī)院腫瘤科臨床直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本，應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)癌組織中的VASP表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)圖5:VASP在直腸癌細(xì)胞胞膜完全著色，著色深，或異質(zhì)性著色，極性喪失。操作步驟同具體實(shí)施例1歩驟8。實(shí)施例3:siRNA沉默VASP抑制人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞遷移及結(jié)腸癌組織中VASP表達(dá)1.siRNA沉默VASP抑制人結(jié)腸癌S怖20細(xì)胞遷移能力培養(yǎng)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞，細(xì)胞遷移能力的檢測(cè)操作步驟同具體實(shí)施例1步驟6，遷移速度測(cè)定(損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn))結(jié)果見(jiàn)圖6。2.免疫組化SP法檢測(cè)結(jié)腸癌中的VASP表達(dá)收集武漢大學(xué)中南醫(yī)院腫瘤科臨床結(jié)腸癌手術(shù)切除標(biāo)本，應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)癌組織中的VASP表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)圖7，操作步驟同具體實(shí)施例1步驟8。權(quán)利要求1、一種血管擴(kuò)張刺激磷蛋白在制備治療或預(yù)防胃癌藥物中的蛋白靶標(biāo)的應(yīng)用。2、一種血管擴(kuò)張刺激磷蛋白在制備治療或預(yù)防直腸癌藥物中的蛋白耙標(biāo)的應(yīng)用。3、一種血管擴(kuò)張刺激磷蛋白在制備治療或預(yù)防結(jié)腸癌藥物中的蛋白靶標(biāo)的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種VASP在防治消化系統(tǒng)惡性腫瘤藥物中的應(yīng)用，VASP作為早期預(yù)測(cè)胃癌、直腸癌、結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移能力、侵襲性的診斷標(biāo)志物及治療胃癌、直腸癌、結(jié)腸癌藥物中的新蛋白靶標(biāo)的應(yīng)用。涉及采取siRNA技術(shù)特異性沉默消化系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞株中VASP、Rac1的表達(dá)水平，并進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移能力，這表明抑制Rac1活化、下調(diào)VASP基因可以顯著抑制消化系統(tǒng)惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移；免疫組化檢測(cè)臨床胃癌組織中VASP的表達(dá)水平，結(jié)合病理分期、分級(jí)，結(jié)果顯示，VASP在腫瘤組織中高表達(dá)，并且與高轉(zhuǎn)移有正相關(guān)。以上結(jié)果表明VASP可以作為早期預(yù)測(cè)胃癌、直腸癌、結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移能力、侵襲性的診斷標(biāo)志物，并且成為治療胃癌、直腸癌、結(jié)腸癌藥物中的新蛋白靶標(biāo)。文檔編號(hào)G01N33/68GK101361965SQ200810197010公開(kāi)日2009年2月11日申請(qǐng)日期2008年9月18日優(yōu)先權(quán)日2008年9月18日發(fā)明者璇周,張京偉,彭小春,王永平,可蘇,董慧敏,蕾魏申請(qǐng)人:武漢大學(xué)