專利名稱：：一種Ⅰ型鴨肝炎病毒的分子生物學(xué)鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種I型鴨肝炎病毒(DHV-1)分子鑒別診斷方法。
背景技術(shù)：
：鴨病毒性肝炎是雛鴨的一種傳播迅速和高度致死的傳染病。肝臟的病變特征是體積增大和有出血斑點(diǎn)，開(kāi)始發(fā)病時(shí)的死亡率高達(dá)90%以上，造成很大損失。鴨肝炎由3種不同病毒引起，分別是鴨肝炎病毒(DHV)I、II、III型，最常見(jiàn)的為DHVI型，屬腸道病毒；DHVII型呈星狀病毒；DHvIII型呈小核糖核酸病毒。DHVI、II、III型有明顯差異，各型之間上交叉免疫性。I病毒的大小2040納米，能夠在發(fā)育雞胚的尿囊內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，病毒對(duì)外界環(huán)境的抵抗力很強(qiáng)，在污染的育雛室內(nèi)的病毒至少能夠生存10周，陰濕處糞便中的病毒能夠存活37天。含有病毒的胚液保存在24'C冰箱內(nèi)，700天后仍保持存活。病毒在2%來(lái)蘇兒溶液中37"C能夠存活1小時(shí)，在O.1%福爾馬林中能夠存活8小時(shí)。目前尚未見(jiàn)到I型鴨肝炎病毒的分子生物學(xué)鑒別方法的相關(guān)技術(shù)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種I型鴨肝炎病毒的分子生物學(xué)鑒別方法。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)予以實(shí)現(xiàn)提供一種I型鴨肝炎病毒的分子生物學(xué)鑒別方法，包括以下步驟:a)處理待檢樣品；(2)制取樣品的RNA;(3)反轉(zhuǎn)錄得到樣品的cDNA;(4)熒光定量RT-PCR或巢式PCR法鑒定I型鴨肝炎病毒。步驟(1)所述待檢樣品為組織樣品、棉拭子、鴨/雞胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)物。步驟(4)所述熒光定量RT-PCR法的鑒定方法為進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，在每次循環(huán)的延伸時(shí)收集熒光信號(hào)，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判斷結(jié)果。陰性-無(wú)Ct值或無(wú)擴(kuò)增曲線，表示樣品中無(wú)DHV-1;陽(yáng)性-Ct值小于等于30，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品中有DHV-1;有效原則-Ct值大于30的樣品重做，重做無(wú)數(shù)值者為陰性，否則為陽(yáng)性；以陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品為參照。所述熒光定量RT-PCR法的引物序列為F:5-CTGTCAGTGCCAGAGGTGCG-3;R:5-CCAATAATTTTGCGGGTCCC-3;預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段約為175bp。所述熒光定量RT-PCR法的擴(kuò)增條件為95。Clmin,95°C10s，58°C10s，72°C40s，共40個(gè)循環(huán)。步驟(4)所述巢式PCR法的鑒定方法為進(jìn)行兩次PCR反應(yīng)，第二次PCR反應(yīng)結(jié)束后，取PCR樣品電泳，取凝膠置于紫外燈下觀察特異的DNA條帶或成像。在外套PCR中陽(yáng)性對(duì)照在約400bp處有一條特異的DNA條帶，陰性對(duì)照則無(wú)相應(yīng)的特異條帶出現(xiàn)，則外套PCR實(shí)驗(yàn)成立；在內(nèi)套PCR中陽(yáng)性對(duì)照在約250bp處有一條特異的DNA條帶，陰性對(duì)照則無(wú)相應(yīng)的特異條帶出現(xiàn)，則內(nèi)套PCR實(shí)驗(yàn)成立；待檢檢品在相應(yīng)位置如出現(xiàn)特異性條帶，或者在約400bp出現(xiàn)條帶或者僅在約250處出現(xiàn)特異條帶，則可判為陽(yáng)性。所述巢式PCR法的引物序列為PP1:5-AGATATGGCAGGTAGAAGG-3;PP2:5-TTGCTGTTTGAATGCTTCTGGTCCC-3;PP3:5-ATgTACCACTgTggTCAATT-3;PP4:5-TCTTCAgAAATTCTATCTC-3;其中PP1和PP2為外套引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段約為400bP;PP3和PP4為內(nèi)套引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段約為250bp。所述巢式PCR法的擴(kuò)增包括兩次，分別為第一次PCR:94°C，3min;94°C，40s;55°C，30s;72°C，30s，30個(gè)循環(huán)；72°C，7min;第二次PCR:以第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，運(yùn)行94"C，3min;94°C，40s;49°C，30s;72°C，30s，30個(gè)循環(huán)；72°C,7min。本發(fā)明的有益效果是公開(kāi)了一種I型鴨肝炎病毒的分子生物學(xué)鑒別診斷方法，該方法具有診斷快速、靈敏性高、且適用范圍廣的特點(diǎn)，可用于從組織樣品、棉拭子、鴨/雞胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)物中均可鑒定DHV-1。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例11、處理待檢樣品；(1)被檢樣品選用肝或腎等組織樣品、棉拭子、尿囊液和細(xì)胞培養(yǎng)物，被檢樣品必須新鮮，或者置于低溫冰箱(-70°C)保存。A組織樣品的處理往13g肝或腎等組織樣品中加適量滅菌的0.85%生理鹽水研磨成510倍懸浮液，反復(fù)凍融23次后，4000g離心10min，取上清液作核酸抽提用。B棉拭子的處理將棉拭子充分捻動(dòng)擰干后除去拭子，0.5mL樣品液經(jīng)4000g離心10min，取上清液作核酸抽提用。C細(xì)胞培養(yǎng)物取lmL細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融23次后，4000g離心10min，取上清液作核酸抽提用。D陰性尿囊液10d鴨/雞胚尿囊液。E陽(yáng)性病毒液DHV-1R株接種10d鴨/雞胚，孵育4872h后收獲的尿囊液。(2)RNA分離試劑盒，華美生物工程公司的RNA分離試劑盒(III)(目錄號(hào)MK0043)，或Invitrogen公司的TrizolLSReagent(目錄號(hào)10296010);滅菌1.5mL離心管；無(wú)RNase水；純氯仿(分析純以上級(jí))；無(wú)RNase水配制的75y。乙醇。2、制取樣品的RNA;以華美生物工程公司的RNA分離試劑盒(III)為例(1)取lOOnL1.1.1中的上清液或尿囊液置于一滅菌的1.5mL離心管中同時(shí)設(shè)立陰性尿囊液或陰性細(xì)胞培養(yǎng)液和A/Goose/Guangdong/FSh54/1996(H5N1)陽(yáng)性病毒液為對(duì)照，再分別加入900nL冰冷的裂解液，劇烈混合樣品15s，室溫放置5min;(2)加入200uL純氯仿，顛倒離心管混合2次，劇烈混合10s，4。C10000g離心15min;(3)吸取500uL上層水相于新1.5mL滅菌離心管中，加入500iiL異丙醇，4。C放置10min，4。C10000g離心15min;(4)小心棄去全部上清液，加入lmL無(wú)RNase水配制的75呢乙醇，上下輕緩顛倒兩次，4°C7500g離心5min;(5)棄去全部上清，風(fēng)干510min，即制得RNA。3、反轉(zhuǎn)錄得到樣品的cDNA;(1)材料準(zhǔn)備反轉(zhuǎn)錄酶ReversetranscriptaseXL(AMV)(目錄號(hào)D2620)、核糖核酸酶抑制劑(RNasin)(目錄號(hào)D2310A)、dNTPMixture(目錄號(hào)D4030A)均來(lái)自寶生物(大連)有限公司；反轉(zhuǎn)錄引物為隨機(jī)引物和oligo(T)按3:1比例的混合物；1.5mL滅菌PCR管。(2)操作方法(A)在一個(gè)潔凈的1.5mL滅菌PCR管中依次加入無(wú)RNase水6.25PL，5X層buffer2^L，dNTPMixture2叱，反轉(zhuǎn)錄引物(CU)l叱(20pmol)，核糖核酸酶抑制劑RNasin0.25叱(10U)，反轉(zhuǎn)錄酶AMV0.5HL(2.5U)，輕緩混勻；(B)用3.2.1中的反轉(zhuǎn)錄混合液重懸2.2.5中制備的RNA;(C)置于室溫10min;(D)放入42。C水浴lh，取出冰浴2min，所得的反應(yīng)液即為反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，將cDNA置于-2(TC保存或直接做PCR擴(kuò)增。4、熒光定量RT-PCR或巢式PCR法鑒定I型鴨肝炎病毒。(1)材料準(zhǔn)備熒光定量PCR儀，普通PCR儀，SYBRGreenIRealtimePCRMasterMix、EX-Taq酶(目錄號(hào)DRR001A)來(lái)自寶生物(大連)有限公司；dNTPMixture(目錄號(hào)D4030A)，100bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(目錄號(hào)D505A)來(lái)自寶生物(大連)有限公司；0.5mL滅菌離心管；2.0%瓊脂糖凝膠(含0.5Pg/mLEB)。PCR擴(kuò)增引物熒光定量RT-PCR引物濃度分別為20pmol/叱F:5-CTGTCAGTGCCAGAGGTGCG-3;R:5-CCAATAAnTTGCGGGTCCC-3;預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段約為175bp。巢式PCR引物濃度分別為25pmol>LPP1:5-AGATATGGCAGGTAGAAGG-3;PP2:5-TTGCTGTTTGAATGCTTCTGGTCCC-3;PP3:5-ATgTACCACTgTggTCAATT-3;PP4:5-TCTTCAgAAATTCTATCTC畫(huà)3。其中PP1和PP2為外套引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段約為400bP;PP3和PP4為內(nèi)套引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段約為250bp。(2)操作方法(一)、巢式PCR(A)在一個(gè)潔凈的O.5mL滅菌PCR管中依次加入無(wú)RNase水19.3叱，10XEX-%《buffer2.5ML,dNTPMixture1PL，PP1、PP2各為O.5JC，EX-%《酶0.2ML(2.5U)，輕緩混勻；(B)加入l叱3.2.4步驟中制備的cDNA，輕緩混勻；(C)第一次PCR:置于PCR儀中運(yùn)行94。C，3min;94°C，40s;55°C，30s,;72°C，30s，30個(gè)循環(huán)；72°C，7min。同時(shí)設(shè)立以DHV-1R株的陰性細(xì)胞培養(yǎng)液cDNA為模板的陽(yáng)性DHV-l病毒對(duì)照和陰性尿囊液或陰性細(xì)胞培養(yǎng)液陰性細(xì)胞培養(yǎng)液cDNA為模板的陰性AIV病毒對(duì)照。第二次PCR:以第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，置于PCR儀中運(yùn)行94'C，3min;94°C，40s;49。C，30s;72°C，30s;30個(gè)循環(huán)；72°C，7min。(D)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)待步驟(C)第二次PCR反應(yīng)結(jié)束后，每個(gè)PCR樣品取5叱于2.0%瓊脂糖凝膠(含0.5Pg/mLEB)孔中電泳，同時(shí)加入5叱標(biāo)準(zhǔn)100bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)電泳作為參照。在75V恒壓電泳30min，取凝膠置于紫外燈下觀察或成像。(E)若(D)中結(jié)果為陽(yáng)性則將產(chǎn)物做相應(yīng)倍數(shù)的稀釋；若結(jié)果為陰性，則直接將產(chǎn)物直接作為模板進(jìn)行內(nèi)套PCR擴(kuò)增(引物為PP3/PP4)，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。(F)判定在外套PCR中陽(yáng)性對(duì)照在約400bp處有一條特異的DNA條帶，陰性對(duì)照無(wú)相應(yīng)的特異條帶出現(xiàn)，則外套PCR實(shí)驗(yàn)成立。在內(nèi)套PCR中陽(yáng)性對(duì)照在約250bp處有一條特異的DNA條帶，陰性對(duì)照無(wú)相應(yīng)的特異條帶出現(xiàn)，則內(nèi)套PCR實(shí)驗(yàn)成立。待檢檢品在相應(yīng)位置如出現(xiàn)特異性條帶，或者在約400bp出現(xiàn)條帶或者僅在約250處出現(xiàn)特異條帶，則均可判為陽(yáng)性。(G)進(jìn)一步驗(yàn)證可將獲得的大小約為400bp或250bp的PCR產(chǎn)物回收按照常規(guī)方法純化后測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提交NCBI進(jìn)行BLAST分析。BLAST結(jié)果顯示大小約為400bp或者大小約為250bp的測(cè)定序列與GenBank中注冊(cè)的DHV-1序列同源性最高，可進(jìn)一步確證檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性。(二)、熒光定量RT-PCR(1)擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備從試劑盒中取出相應(yīng)的熒光PCR反應(yīng)液、Taq酶，在室溫下融化后，2000r/min離心5s。設(shè)所需要熒光PCR檢測(cè)總數(shù)為n，其中n為被檢樣品、陽(yáng)性樣品與陰性樣品的和，每個(gè)樣品測(cè)試反應(yīng)體系配制見(jiàn)表1所示表1實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>根據(jù)實(shí)驗(yàn)常規(guī)，按照測(cè)試樣品的數(shù)量計(jì)算好各試劑的使用量，加到適當(dāng)體積熒光PCR管中，充分混勻，向每管中分裝23ixL反應(yīng)混合物液體(cDNA模板此步驟暫時(shí)不裝入)。(2)加樣在各設(shè)定的熒光PCR管放入步驟3(D)所述cDNA溶液各2uL，蓋緊管蓋，500r/m離心30s。(3)熒光PCR檢測(cè)將上一步(2)離心后的PCR管放入到熒光PCR檢測(cè)儀中，記錄樣品擺放順序。循環(huán)條件設(shè)置95°Clmin，95°C10s，58°C10s，72°C40s;共40個(gè)循環(huán)。在每次循環(huán)的延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判斷結(jié)果。熒光PCR擴(kuò)增曲線可以分三個(gè)階段熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在明顯線性關(guān)系，選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念熒光閾值和CT值。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上任意設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，在本實(shí)驗(yàn)中熒光閾值是通過(guò)ABI7500systemSDSsoftware(SequenceDetectionSoftware--VersionL2.2)軟件自動(dòng)優(yōu)化選擇的。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值。CT值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個(gè)模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。禾'J用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表CT值，縱坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)。因此只要獲得未知樣品的CT值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。(4)結(jié)果判定直接讀取檢測(cè)結(jié)果。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器躁聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過(guò)正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陰性樣品無(wú)Ct值或無(wú)擴(kuò)增曲線。陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)小于30，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。否則，此次實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。結(jié)果描述及判斷陰性無(wú)Ct值或無(wú)擴(kuò)增曲線，表示樣品中無(wú)DHV-1。陽(yáng)性Ct值應(yīng)小于等于30，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品中有DHV-1。有效原則Ct值大于30的樣品建議重做，重做無(wú)數(shù)值者為陰性，否則為陽(yáng)性。權(quán)利要求1、一種I型鴨肝炎病毒的分子生物學(xué)鑒別方法，其特征在于包括以下步驟(1)處理待檢樣品；(2)制取樣品的RNA；(3)反轉(zhuǎn)錄得到樣品的cDNA；(4)熒光定量RT-PCR或巢式PCR法鑒定I型鴨肝炎病毒。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述I型鴨肝炎病毒的分子生物學(xué)鑒別方法，其特征在于步驟(1)所述待檢樣品為組織樣品、棉拭子、鴨或雞胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)物。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述I型鴨肝炎病毒的分子生物學(xué)鑒別方法，具特征在于步驟(4)所述熒光定量RT-PCR法的鑒定方法為進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，在每次循環(huán)的延伸時(shí)收集熒光信號(hào)，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判斷結(jié)果。4、根據(jù)權(quán)利要求1或3所述I型鴨肝炎病毒的分子生物學(xué)鑒別方法，其特征在于所述熒光定量RT-PCR法引物序列為F:5-CTGTCAGTGCCAGAGGTGCG-3;R:5-CCAATAATTTTGCGGGTCCC-3。5、根據(jù)權(quán)利要求1或3所述I型鴨肝炎病毒的分子生物學(xué)鑒別方法，其特征在于所述熒光定量RT-PCR法的擴(kuò)增條件為95°Clmin，95°C10s，58°C10s，72°C40s，共40個(gè)循環(huán)。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述I型鴨肝炎病毒的分子生物學(xué)鑒別方法，其特征在于步驟(4)所述巢式PCR法的鑒定方法為進(jìn)行兩次PCR反應(yīng)，第二次PCR反應(yīng)結(jié)束后，取PCR樣品電泳，取凝膠置于紫外燈下觀察特異的DNA條帶或成像。7、根據(jù)權(quán)利要求1或6所述I型鴨肝炎病毒的分子生物學(xué)鑒別方法，其特征在于所述巢式PCR法引物序列為PP1:5-AGATATGGCAGGTAGAAGG-3;PP2:5-TTGCTGTTTGAATGCTTCTGGTCCC-3;PP3:5-ATgTACCACTgTggTCAATT-3;PP4:5-TCTTCAgAAATTCTATCTC-3。8、根據(jù)權(quán)利要求1或6所述I型鴨肝炎病毒的分子生物學(xué)鑒別方法，其特征在于所述巢式PCR法的擴(kuò)增分別為第一次PCR:94°C，3min;94。C，40s;55°C，30s;72°C，30s，30個(gè)循環(huán)；72°C，7min;第二次PCR:以第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，運(yùn)行94°C，3min;94°C，40s;49°C，30s;72°C，30s，30個(gè)循環(huán)；72°C，7min。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種I型鴨肝炎病毒的分子生物學(xué)鑒別方法，包括處理待檢樣品、制取樣品的RNA、反轉(zhuǎn)錄得到樣品的cDNA、熒光定量RT-PCR或巢式PCR法鑒定I型鴨肝炎病毒等步驟。本發(fā)明具有診斷快速、靈敏性高、且適用范圍廣的有益效果，可用于從組織樣品、棉拭子、鴨或雞胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)物中均可鑒定DHV-1。文檔編號(hào)G01N21/64GK101358247SQ200810198528公開(kāi)日2009年2月4日申請(qǐng)日期2008年9月16日優(yōu)先權(quán)日2008年9月16日發(fā)明者孔留五,明廖,張桂紅,徐小芹,羅玉均,陳建紅申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)