專利名稱：不結(jié)球白菜抗蕪菁花葉病毒基因的分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的篩選病毒抗性基因分子標(biāo)記的方法，具 體是一種不結(jié)球白菜抗蕪菁花葉病毒基因的分子標(biāo)記方法。
背景技術(shù)：
不結(jié)球白菜(又名青菜)是我國非常重要的大眾化綠葉蔬菜，常年供應(yīng)市場， 但是，病毒病尤其是蕪菁花葉病毒病對不結(jié)球白菜危害嚴(yán)重，蕪菁花葉病毒通過 蚜蟲傳播，蔓延迅速，系統(tǒng)性侵染植物，有潛伏期。發(fā)病后產(chǎn)生花葉和病斑，造 成蔬菜品質(zhì)下降和作物減產(chǎn)，無農(nóng)藥可根治， 一經(jīng)發(fā)生將損失慘重。現(xiàn)在常用的 防治方法是防治蚜蟲的發(fā)生和蔓延，防治成本較高，且已造成農(nóng)藥殘留，不能通 過檢驗(yàn)供應(yīng)市場。所以，選育抗蕪菁花葉病毒的不結(jié)球白菜品種工作在許多年前 就已開展，傳統(tǒng)的雜交選育方法耗費(fèi)大量的人力物力，但因蕪菁花葉病毒有許多 生理小種和變種，所以成效并不顯著。現(xiàn)在，分子輔助育種技術(shù)已被廣泛應(yīng)用， 借助分子標(biāo)記可以對育種材料從DNA (脫氧核糖核酸)水平上進(jìn)行選擇，增強(qiáng)選 擇的針對性和準(zhǔn)確性，省時(shí)省力，再結(jié)合傳統(tǒng)遺傳育種方法將加快選擇進(jìn)度，從 而顯著提高育種效率。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，蕪菁花葉病毒(TuMV)是1921年美國人Gardner 等和Schultz同時(shí)在白菜上發(fā)現(xiàn)的，論文都發(fā)表在當(dāng)年第22期《Journal of Agricutral Research》上，分別是第123頁至124頁的Turnip Mosaic和第173 頁至177頁的A transmissible mosaic disease of Chinese cabbage。 在蕪菁 花葉病毒抗性基因研究方面，國際上，Walsh等人最先標(biāo)記和命名了蕪菁花葉病 毒抗性基因TuRBOl和TuRB02，發(fā)表在《Theoretical and Applied Genetics》 1999年第99期第1149頁至1154頁，題目為Characterisation of resistance to turnip mosaic virus in oilseed rapa (Brassica napus) and genetic mapping of TuRBOl;此后，在Brassica napus(甘藍(lán)類蔬菜)上陸續(xù)標(biāo)記出TuRB03、 TuRB04和TuRB05抗性基因和在白菜上標(biāo)記出TuRB01b、ConTR01和retr01基因。
在國內(nèi)，結(jié)球甘藍(lán)抗蕪菁花葉病毒相關(guān)基因TuR2基因被克隆，大白菜上的一對 抗蕪菁花葉病毒隱性基因被標(biāo)記；最新的研究是Zhang等人標(biāo)記了大白菜抗蕪菁 花葉病毒的4個(gè)數(shù)量性狀(Tul-4)，發(fā)表在《Plant Breeding)) 2008年第127 期第82頁至86頁上，題目為Quantiative trait loci analysis for resistance against Turnip mosaic virus based on a doubled-h印loid population in Chinese cabbage。國內(nèi)外關(guān)于抗蕪菁花葉病毒基因的研究雖已經(jīng)幵展了十年， 但不結(jié)球白菜抗蕪菁花葉病毒基因的研究卻沒有報(bào)道過。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種不結(jié)球白菜抗蕪菁花葉病 毒基因的分子標(biāo)記方法，在不結(jié)球白菜上開展了抗蕪菁花葉病毒基因的研究工 作，為不結(jié)球白菜抗病育種提供依據(jù)。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括步驟如下
① 抗感芫菁花葉病毒的不結(jié)白菜親本材料的篩選；
② 不結(jié)球白菜材料的栽培；
③ 抗感親本材料的雜交和F1 (子一代)自交獲得F2群體；
④ 蕪菁花葉病毒在不結(jié)球白菜上的接種和檢測；
⑤ 不結(jié)球白菜材料的DNA提??；
⑥ 不結(jié)球白菜抗蕪菁花葉病毒的抗感池建立；
⑦ 抗病基因的分子標(biāo)記篩選；
⑧ 抗病基因連鎖標(biāo)記交換率計(jì)算；
⑨ 抗病基因連鎖標(biāo)記距離計(jì)算和圖譜建立。
所述抗感蕪菁花葉病毒的不結(jié)白菜親本材料的篩選，具體為把從不結(jié)球白 菜育種單位得到的高抗和高感蕪菁花葉病毒的多份材料，利用分子標(biāo)記(如
AFLP、 SRAP)的方法進(jìn)行親緣關(guān)系遠(yuǎn)近比較，篩選出親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的抗病和感病
材料用于研究。
所述不結(jié)球白菜材料的栽培，具體為不結(jié)球白菜種子，要先在25'C培養(yǎng) 箱中催芽，然后播種到塑料穴盤中，長出幼苗后，要進(jìn)行低溫春化，再放置到具 有防蟲網(wǎng)的玻璃溫室中培養(yǎng)，白天溫度為25-3(TC，夜間溫度為15-2(TC，光照、 水分和氧氣要充足。
所述抗感親本材料的雜交和Fl自交，具體為開花后的抗感病材料，以抗
性親本為母本(Pl)，感病親本為父本(P2)，母本都去掉雄蕊，用父本的花粉人 工授到母本的雌蕊柱頭上，所結(jié)種子為F1。 Fl開花后，人工用雄蕊花粉授到同 一朵花的雌蕊柱頭上，所結(jié)種子為F2 (子二代)。
所述蕪菁花葉病毒在不結(jié)球白菜上的接種和檢測，具體為索取到蕪菁花葉 病毒毒源后，先進(jìn)行增殖，然后用緩沖液稀釋病菌液，把金剛砂放入病菌液中， 用紗布蘸取摩擦葉片表面，再用高壓水沖壓葉片表面，完成接種。檢測采用酶聯(lián) 免疫吸附測定法，剪取少量葉片研碎，放入檢測試劑中，凡是呈現(xiàn)陰性為無病毒， 呈現(xiàn)陽性的為有病毒。
所述不結(jié)球白菜材料的DNA提取，具體為選取不結(jié)球白菜2-3葉期的一片 真葉，利用CTAB (溴代十六烷基三甲胺法)法提取DNA， 4。C保存?zhèn)溆谩?br> 所述不結(jié)球白菜抗蕪菁花葉病毒的抗感池建立，具體為根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附
測定法檢測結(jié)果和肉眼觀察到的病情分級情況，各選取10-15株高度抗病和高度 感病F2單株，將其預(yù)先提取的葉片DNA混合，建立抗病DNA池(RP)和感病DNA 池(SP)。
所述抗病基因的分子標(biāo)記篩選，具體為利用分子標(biāo)記技術(shù)，對Pl、 P2、 Fl、 RP和SP進(jìn)行標(biāo)記，針對抗病顯性基因，篩選出P1、 Fl、 RP有條帶且P2、 SP無條帶的標(biāo)記引物，再把這些引物用于標(biāo)記P1、 P2、 Fl、 RP、 SP和抗感病池 中的F2個(gè)體，篩選出Pl、 Fl、 RP和抗病池F2個(gè)體有條帶且P2、 SP和感病池 F2個(gè)體無條帶的標(biāo)記，即為抗病顯性基因分子標(biāo)記；針對抗病隱性基因，篩選 出P2、 SP有條帶且P1、 Fl、 RP無帶的標(biāo)記引物，再把這些引物用于標(biāo)記P1、 P2、 Fl、 RP、 SP和抗感病池中的F2個(gè)體，篩選出P2、 SP和感病池F2個(gè)體有條 帶且P1、 Fl、 RP和抗病池F2個(gè)體無條帶的標(biāo)記，即為抗病隱性基因分子標(biāo)記。
所述抗病基因連鎖標(biāo)記交換率計(jì)算，具體為利用抗病基因分子標(biāo)記對P1、 P2和F2群體進(jìn)行標(biāo)記，統(tǒng)計(jì)每個(gè)F2個(gè)體的抗病基因分子標(biāo)記的情況。針對抗 病顯性基因的標(biāo)記引物，有帶的標(biāo)為與P1—致，沒有帶的標(biāo)為與P2—致；針對 抗病隱性基因的標(biāo)記引物，有帶的標(biāo)為與P2—致，沒有帶的標(biāo)為與P1—致。再 與酶聯(lián)免疫吸附測定法對F2群體的檢測結(jié)果相比較，所有不一致的個(gè)體之和與 F2個(gè)體數(shù)的百分比即為交換率。
所述抗病基因連鎖標(biāo)記距離計(jì)算和圖譜建立，具體為利用MapMarker軟件， 把F2群體中抗病基因分子標(biāo)記和酶聯(lián)免疫吸附測定法對F2群體的檢測結(jié)果都換
算成A4 (與P1—致)、B=2 (與P2—致)、0=-(未電泳出任何條帶)，用軟件 處理數(shù)據(jù)，可以得出抗病基因與連鎖標(biāo)記間的距離和相關(guān)數(shù)值，然后再用軟件根 據(jù)數(shù)據(jù)形成和輸出圖譜。
本發(fā)明中，以不結(jié)球白菜為材料，通過建立抗病池和感病池，將分子標(biāo)記技 術(shù)(如AFLP、 SSR、 SAMPL、 SRAP、 ISSR、 RAPD、 RFLP、 TRAP、 SNP、 SCAR、 CAPS 等)應(yīng)用于對不結(jié)白菜抗感蕪菁花葉病毒的親本篩選和抗病基因連鎖基因的標(biāo) 記，不同的分子標(biāo)記有不同的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，通過試驗(yàn)篩選合適的引物或 引物組合，用于抗病基因的標(biāo)記；親本雜交、Fl自交和病毒接種都要在特定的 時(shí)間內(nèi)人工完成；不結(jié)球白菜F2個(gè)體感病與否要通過酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測， 根據(jù)檢測結(jié)果和目測的病情級別，挑選高度抗病和感病單株建立抗感池，利用 CTAB法提取葉片DNA，混合DNA建立抗病DNA池和感病DNA池；抗病基因與連鎖 標(biāo)記間的交換率和距離的計(jì)算以及連鎖圖譜的建立都要通過MapMarker軟件完 成。本發(fā)明篩選不結(jié)球白菜抗蕪菁花葉病毒的抗性基因，為后續(xù)開展抗病基因在 染色體上的定位、抗病基因克隆和抗病基因?qū)敫胁〔牧嫌N研究奠定基礎(chǔ)，從 而為不結(jié)球白菜抗病的分子輔助育種提供依據(jù)。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例不結(jié)球白菜抗蕪菁花葉病毒分子標(biāo)記圖
圖2為本發(fā)明實(shí)施例不結(jié)球白菜抗蕪菁花葉病毒基因與連鎖標(biāo)記圖譜圖
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案 為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不 限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1
材料的篩選以來自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所的不結(jié)球白菜為試驗(yàn)材 料，抗病材料5份，感病材料3份，利用AFLP (Amplified fragment length polymorphism,擴(kuò)增片段長度多態(tài)性)進(jìn)行標(biāo)記，利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，根據(jù) UPGMA構(gòu)建聚類樹狀圖，選擇遺傳相似性最低即親緣關(guān)系最遠(yuǎn)抗病材料Q048和 感病材料A168-5D作為本實(shí)施例的材料。采用的材料和樣品可以通過購買等公 開途徑從上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所獲得。
材料的培養(yǎng)挑選飽滿的種子催芽后，播到由草炭、蛭石及有機(jī)肥(體積比
4:4:1)混合的基質(zhì)中，澆透水后打0. 5厘米深的孔，將種子放入，然后覆0. 5 厘米厚的草炭。將穴盤放入帶有防蟲網(wǎng)的溫室里進(jìn)行培養(yǎng)，白天溫度為25-30°C， 夜間溫度為15-20°C。開花后，以Q048為母本(Pl)， A168-5D為父本(P2)，母 本都去掉雄蕊，用父本的花粉人工授到母本的雌蕊柱頭上，所結(jié)種子為Fl。 Fl 開花后，人工用雄蕊花粉授到同一朵花的雌蕊柱頭上，所結(jié)種子為F2。挑選200 粒飽滿的F2種子和Pl、 P2、 Fl各10粒種子播種到穴盤里，長到2-3片真葉后， 剪取1片用于提取DNA，待新葉長出后準(zhǔn)備接種蕪菁花葉病毒。
病毒的接種和檢測從保存蕪菁花葉病毒滬1株系毒源的寄主植物上剪取幼 嫩的重病葉，每lg (克)病葉加入pH=7的0. 05 mol L—1 (摩爾每升)的磷酸緩 沖液4ml (毫升)，在消毒的研缽內(nèi)充分研碎，放入適量600目的金剛砂，用紗 布蘸取摩擦葉片表面，再用高壓水沖壓葉片表面，完成接種。接種1周后，采用 酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)進(jìn)行病毒檢測，剪取半個(gè)葉片研碎，放入檢測試 劑中，凡是呈現(xiàn)陰性為無病毒，呈現(xiàn)陽性的為有病毒。本實(shí)施例的檢測結(jié)果顯示 呈陽性的個(gè)體數(shù)與呈陰性的個(gè)體數(shù)之比接近3: 1，根據(jù)孟德爾定律可判斷為不 結(jié)球白菜抗蕪菁花葉病毒基因?yàn)轱@性基因。2周后，用肉眼觀察進(jìn)行病情分級， O級為抗病單株，且ELISA檢測為陰性；l-3級為感病單株，ELISA檢測都為陽 性，1級為幼嫩葉片花葉，2級為系統(tǒng)性花葉，3級為花葉中有壞死斑或植株枯 死。
DNA的提取采用CTAB方法提取DNA，具體操作步驟如下
1、 葉片清洗用純凈水把剪取的葉片洗干凈；
2、 葉片研磨冷凍，加入液氮，研磨，轉(zhuǎn)入1.5或2ml離心管；
3、 預(yù)先配備CTAB提取液稱取CTAB 20g和氯化鈉81. 9g溶解于100ml蒸 餾水中，加入0. 5mo1 「'的EDTA 40ml和lmol L—1的Tris-HCl 100ml，最后 用蒸餾水定容至1000ml， 4'C保存?zhèn)溆?。使用前按體積100: l加入巰基乙醇；
4、 CTAB液提取加入60。C預(yù)熱的CTAB提取液500叱(微升)，6CTC水浴30-60 分鐘，每10分鐘混勻一次；
5、 去蛋白力口-2(TC冰浴的酚:氯仿:異戊醇(體積比25:24:1) 500叱混勻， 4。C條件下12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液；
6、 沉淀力口-20。C冰浴的異丙醇500iil，混勻沉淀30分鐘以上，4'C條件 下8000轉(zhuǎn)離心IO分鐘，去上清液，晾干； 7、 預(yù)先配制謂A酶液吸取0. 5mol 1的EDTA 0. 2ml和lmol <L—1的Tris-HC1 lml，用蒸餾水定容至lOOml，制備TE緩沖液，再按體積比為993: 7加入10g *L—1 的RNA酶；
8、 去RNA (核糖核酸)加RNA酶液300A， 37。C消化30分鐘；
9、 二次去蛋白力卩-20。C冰浴的氯仿異戊醇(體積比24:1) 300叱混勻，4 。C條件下12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液；
10、 去離子力[]-20。C冰浴的7. 5mo1 L—'醋酸銨IOO叱混勻，(TC冰浴20分 鐘，4。C條件下10000轉(zhuǎn)離心20分鐘，取上清液；
11、 DNA沉淀力B-2(TC冰浴的無水乙醇90(mL， (TC冰浴20分鐘，4"條件 下8000轉(zhuǎn)離心20分鐘，去上清液，獲得DNA沉淀；
12、 麗A洗滌對DNA沉淀用-2(TC冰浴的70%乙醇洗兩遍，晾干；
13、 溶解加TE溶解和稀釋，DNA濃度稀釋至50-250ng 、放4'C冰箱 保存。
抗感池建立:根據(jù)ELISA檢測結(jié)果和肉眼觀察到的病情分級情況，各選取10 株0級和2級的F2單株(本實(shí)施例中無3級單株)，將其預(yù)先提取的葉片DNA 混合，建立抗病DNA池(RP)和感病DNA池(SP)。
AFLP分子標(biāo)記篩選用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，對P1、 P2、F1、 RP和SP進(jìn)行 標(biāo)記，篩選出P1、 Fl、 RP有條帶且P2、 SP無條帶的標(biāo)記引物組合，再把這些引 物用于標(biāo)記F1、 RP、 SP和抗感病池中的F2個(gè)體，篩選出P1、 Fl、 RP和抗病池 F2個(gè)體有條帶且P2、 SP和感病池F2個(gè)體無條帶的標(biāo)記，即為抗病基因的分子
標(biāo)記。AFLP技術(shù)的具體步驟如下
1、 麗A的酶切-連接采用反應(yīng)體系，分成兩步，13.5ML酶切反應(yīng)體
系包括0. 24U的EcoRI酶、1. 35叱緩沖液和100ng的DNA，在37。C水浴6小時(shí)； 連接反應(yīng)體系包括13. 5叱酶切液、2. 5pmo1的EcoRI接頭、25prao1的Msel接頭、 0. 5U的T4-DNA連接酶、2陶o1的ATP和2. 6^L的緩沖液，在室溫下(20。C左右) 過夜。產(chǎn)物稀釋1倍，-20!^保存。
2、 預(yù)擴(kuò)增采用10叱反應(yīng)體系進(jìn)行AFLP預(yù)擴(kuò)增2. 5 mmol L—1 MgCl2， 0. 2翻1 L—1 d野s， 60ng的預(yù)擴(kuò)引物，0. 3 U Taq聚合酶，l叱lOxPCRBuffer
(緩沖液)，2.0A酶切連接產(chǎn)物。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍，-20°(:保存。 預(yù)擴(kuò)引物為兩個(gè)，序列是EOO 5'-GACTGCGTACCAATTC-3'
MOO 5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3' PCR擴(kuò)增程序采用94'C預(yù)變性2分鐘；94。C變性30秒，56'C復(fù)性30秒，72 。C延伸60秒，共24個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸30分鐘。
3、 選擇性擴(kuò)增采用20叱反應(yīng)體系，2. 5,1 'L—'MgCl" 0. 2函1 'L—MNTPs， 100ng引物，1.5U Taq聚合酶，2叱10xPCRBuffer (緩沖液)，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物。 擴(kuò)增產(chǎn)物與上樣緩沖液(甲酰胺98ml、 0. 5M的乙二胺四乙酸2ml、溴酚藍(lán)0. 25g、 二甲苯腈0.25g) l:0.5體積混合變性，-4°。保存待電泳。
引物為600個(gè)組合，25個(gè)含2個(gè)選擇性堿基的EcoRI引物和24個(gè)含3個(gè)選
擇性堿基的MseI引物。
PCR擴(kuò)增程序采用94。C預(yù)變性2分鐘；94。C變性30秒，65-56。C復(fù)性30秒
(每個(gè)循環(huán)降低O. 7°C)， 72。C延伸60秒，共12個(gè)循環(huán)；94。C變性30秒，56°C
復(fù)性30秒，72。C延伸60秒，共24個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸30分鐘。
4、 電泳通過6%的變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進(jìn)行分離，擴(kuò)增產(chǎn)物吸取 5叱點(diǎn)樣后，在50W的恒功率下電泳。
5、 銀染顯色
① 固定將帶膠的玻璃板放入盛有2 L新配制的0. 5%的冰醋酸和10%無水 乙醇混合液的固定盒中，在搖床上輕搖20分鐘，直至膠面上二甲苯腈顏色全部 褪掉。
② 水洗放到盛有蒸餾水的水洗盒中，輕搖3分鐘。
③ 銀染放入盛有2L 0.2%的硝酸銀染色液的染色盒中，輕搖30分鐘。
④ 再水洗從染色盒中取出膠板，放到水洗盒中清洗5-10秒。
⑤ 顯影迅速將膠板放入2 L 1.5%氫氧化鈉和0.5%甲醛的顯影液中顯影， 直至出現(xiàn)清晰的條帶。
⑥ 定影2 L 0.75%無水碳酸鈉定影液定影。
⑦ 取出膠板，清水沖洗，銀染結(jié)束。
結(jié)果
利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，從600個(gè)引物組合中篩選出Pl、 F1有條帶且P2 無條帶的標(biāo)記引物232個(gè)組合，從中又篩選出了 Pl、 Fl、 RP有條帶且P2、 SP 無條帶的標(biāo)記引物56個(gè)組合，最終篩選出了2個(gè)引物組合在P1、 Fl、 RP和抗病
池F2個(gè)體有條帶且P2、 SP和感病池F2個(gè)體無條帶的標(biāo)記，即為抗病基因的分 子標(biāo)記。引物E1M1序列為El: 5'-GACTGCGTACCAATTCACC-3' (E+CC)，
Ml: 5'- GATGAGTCCTGAGTAACTT-3'(M+CTT); E2M2序列為E2: 5'— GACTGCGTACCAATTCACA-3' (E+CA)，
M2: 5'- GATGAGTCCTGAGTAACAA-3'(M+CAA)。 引物E1M1的結(jié)果如圖1，圖1中M代表標(biāo)準(zhǔn)DNA標(biāo)記，不同條帶代表不同DNA 片段的分子量，R1-10為F2抗病個(gè)體，S1-10為F2感病個(gè)體，200bp (堿基對) 代表此處DNA片段的分子量為200bp。由圖1可直觀看出在約190bp處，紅色箭 頭所指的抗病親本Pl和子一代Fl以及抗病池RP和F2抗病個(gè)體R1-10都有明顯 的條帶，而感病親本P2和感病池SP及F2感病個(gè)體S1-IO都無條帶，這條差異 帶非常清晰，直觀地說明此標(biāo)記與不結(jié)球白菜抗蕪菁花葉病毒基因緊密連鎖，為 后續(xù)的研究提供了依據(jù)。
實(shí)施例2
材料的篩選以來自上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所的不結(jié)球白菜為試驗(yàn)材料， 抗病材料5份，感病材料3份，利用AFLP (Amplified fragment length polymorphism,擴(kuò)增片段長度多態(tài)性)進(jìn)行標(biāo)記，利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，根據(jù) UPGMA構(gòu)建聚類樹狀圖，選擇遺傳相似性最低即親緣關(guān)系最遠(yuǎn)抗病材料Q048和 感病材料A168-5D作為本實(shí)施例的材料。
材料的培養(yǎng)挑選飽滿的種子催芽后，播到由草炭、蛭石及有機(jī)肥(體積比 4:4:1)混合的基質(zhì)中，澆透水后打0. 5厘米深的孔，將種子放入，然后覆0. 5 厘米厚的草炭。將穴盤放入帶有防蟲網(wǎng)的溫室里進(jìn)行培養(yǎng)，白天溫度為25-30°C， 夜間溫度為15-20°C。開花后，以Q048為母本(Pl)， A168-5D為父本(P2)，母 本都去掉雄蕊，用父本的花粉人工授到母本的雌蕊柱頭上，所結(jié)種子為Fl。 Fl 開花后，人工用花粉授到同一朵花的雌蕊柱頭上，所結(jié)種子為F2。挑選200粒 飽滿的F2種子和P1、 P2、 Fl各10粒種子播種到穴盤里，長到2-3片真葉后， 剪取1片用于提取DNA，待新葉長出后準(zhǔn)備接種蕪菁花葉病毒。
病毒的接種從保存蕪菁花葉病毒滬1株系毒源的寄主植物上剪取幼嫩的重 病葉，每lg病葉加入pH=7的0. 05 mol L—1的磷酸緩沖液4 ml，在消毒的研缽 內(nèi)充分研碎，放入適量600目的金剛砂，用紗布蘸取摩擦葉片表面，再用高壓水
沖壓葉片表面，完成接種。接種1周后，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)進(jìn) 行病毒檢測，剪取半個(gè)葉片研碎，放入檢測試劑中，凡是呈現(xiàn)陰性為無病毒，呈 現(xiàn)陽性的為有病毒。2周后，用肉眼觀察進(jìn)行病情分級，0級為抗病單株，且ELISA 檢測為陰性；l-3級為感病單株，ELISA檢測都為陽性，1級為幼嫩葉片花葉，2 級為系統(tǒng)性花葉，3級為花葉中有壞死斑或植株枯死。
DNA的提取采用CTAB方法提取DNA，具體操作步驟如下
1、 葉片清洗用純凈水把剪取的葉片洗干凈；
2、 葉片研磨冷凍，加入液氮，研磨，轉(zhuǎn)入1.5或2ml離心管；
3、 預(yù)先配備CTAB提取液稱取CTAB20g和氯化鈉81.9g溶解于100ml蒸 餾水中，加入O. 5mo1 L/'的EDTA 40ml和lmol L—1的Tris-HCl 100ml，最后 用蒸餾水定容至1000ml， 4'C保存?zhèn)溆?。使用前按體積100: l加入巰基乙醇；
4、 CTAB液提取加入60。C預(yù)熱的CTAB提取液500叱，6(TC水浴30-60分 鐘，每10分鐘混勻一次；
5、 去蛋白力n-2(TC冰浴的酚氯仿異戊醇(體積比25:24:1) 500叱混勻， 4'C條件下12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液；
6、 沉淀力B-20。C冰浴的異丙醇500wl，混勻沉淀30分鐘以上，4"C條件 下8000轉(zhuǎn)離心IO分鐘，去上清液，晾干；
7、 預(yù)先配制RNA酶液吸取0. 5mol L—1的EDTA 0. 2ml和lmol L—1的Tris-HCl lml，用蒸餾水定容至lOOml，制備TE緩沖液，再按體積比為993: 7加入10g 'L-1 的RNA酶；
8、 去RNA (核糖核酸)加RNA酶液300叱，37。C消化30分鐘；
9、 二次去蛋白力n-2(TC冰浴的氯仿異戊醇(體積比24:1) 300A混勻，4 。C條件下12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液；
10、 去離子力卩-2(TC冰浴的7. 5mo1 'L-'醋酸銨100叱混勻，(TC冰浴20分 鐘，4。C條件下10000轉(zhuǎn)離心20分鐘，取上清液；
11、 DNA沉淀力B-20。C冰浴的無水乙醇900叱，(TC冰浴20分鐘，4'C條件 下8000轉(zhuǎn)離心20分鐘，去上清液，獲得DNA沉淀；
12、 DNA洗滌對DNA沉淀用-20。C冰浴的70%乙醇洗兩遍，晾干；
13、 溶解加TE溶解和稀釋，DNA濃度稀釋至50-250ng 叱—'，放4'C冰箱 保存。
抗感池建立:根據(jù)ELISA檢測結(jié)果和肉眼觀察到的病情分級情況，各選取10 株0級和2級的F2單株(本實(shí)施例中無3級別單株)，將其預(yù)先提取的葉片DNA 混合，建立抗病DNA池(RP)和感病DNA池(SP)。
AFLP分子標(biāo)記篩選用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，對P1、 P2、 Fl、 RP和SP進(jìn)行 標(biāo)記，篩選出P1、 Fl、 RP有條帶且P2、 SP無條帶的標(biāo)記引物組合，再把這些引 物用于標(biāo)記F1、 RP、 SP和抗感病池中的F2個(gè)體，篩選出P1、 Fl、 RP和抗病池 F2個(gè)體有條帶且P2、 SP和感病池F2個(gè)體無條帶的標(biāo)記，即為抗病基因的分子
標(biāo)記。AFLP技術(shù)的具體步驟如下
1、 DNA的酶切-連接采用26A反應(yīng)體系，分成兩步，13.5叱酶切反應(yīng)體
系包括0. 24U的EcoRI酶、1. 35PL緩沖液和100ng的DNA，在37。C水浴6小時(shí)； 連接反應(yīng)體系包括13. 酶切液、2. 5pmo1的EcoRI接頭、25pmo1的Msel接頭、 0. 5U的T4-DNA連接酶、2Pmo1的ATP和2. 6pL的緩沖液，在室溫下(20。C左右) 過夜。產(chǎn)物稀釋1倍，-2(TC保存。
2、 預(yù)擴(kuò)增采用10叱反應(yīng)體系進(jìn)行AFLP預(yù)擴(kuò)增2. 5 mmol L—1 MgCl" 0. 2畫1 *L_1dNTPs， 60ng的預(yù)擴(kuò)引物，0. 3 U Taq聚合酶，l叱lOxPCRBuffer
(緩沖液)，2.0A酶切連接產(chǎn)物。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍，-2(TC保存。 預(yù)擴(kuò)引物為兩個(gè)，序列是EOO 5'-GACTGCGTACCAATTC-3'
M00 5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3' PCR擴(kuò)增程序采用94。C預(yù)變性2分鐘；94。C變性30秒，56。C復(fù)性30秒，72 。C延伸60秒，共24個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸30分鐘。
3、 選擇性擴(kuò)增采用20叱反應(yīng)體系，2. 5腦1 'L—1 MgCl2， 0. 2腦1 'L—M,s， 100ng引物，1.5UTaq聚合酶，lOXPCRBuffer (緩沖液)，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物。 擴(kuò)增產(chǎn)物與上樣緩沖液(甲酰胺98ml、 0. 5M的乙二胺四乙酸2ml、溴酚藍(lán)0. 25g、 二甲苯腈0.25g) l:0.5體積混合變性，_4°。保存待電泳。
PCR擴(kuò)增程序采用94。C預(yù)變性2分鐘；94。C變性30秒，65-56。C復(fù)性30秒 (每個(gè)循環(huán)降低0.7。C)， 72。C延伸60秒，共12個(gè)循環(huán)；94。C變性30秒，56°C 復(fù)性30秒，72。C延伸60秒，共24個(gè)循環(huán)；最后72"延伸30分鐘。
4、 電泳通過6%的變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進(jìn)行分離，擴(kuò)增產(chǎn)物吸取 5叱點(diǎn)樣后，在50W的恒功率下電泳。
5、 銀染顯色
① 固定將帶膠的玻璃板放入盛有2 L新配制的0. 5%的冰醋酸和10%無水 乙醇混合液的固定盒中，在搖床上輕搖20分鐘，直至膠面上二甲苯腈顏色全部 褪掉。
② 水洗放到盛有蒸餾水的水洗盒中，輕搖3分鐘。
③ 銀染放入盛有2L 0.2%的硝酸銀染色液的染色盒中，輕搖30分鐘。
④ 再水洗從染色盒中取出膠板，放到水洗盒中清洗5-IO秒。
⑤ 顯影迅速將膠板放入2 L 1.5%氫氧化鈉和0.5%甲醛的顯影液中顯影，
直至出現(xiàn)清晰的條帶。
⑥ 定影2 L 0.75%無水碳酸鈉定影液定影。
⑦ 取出膠板，清水沖洗，銀染結(jié)束。
抗病基因連鎖標(biāo)記交換率計(jì)算利用抗病基因分子標(biāo)記的引物El (E+CC) M1(M+CTT)和E2(E+CA)M2(M+CAA)對Pl、 P2和F2群體進(jìn)行標(biāo)記，統(tǒng)計(jì)每個(gè)F2 個(gè)體的抗病基因分子標(biāo)記的情況，有帶的標(biāo)為與Pl —致，沒有帶的標(biāo)為與P2 一致。再與酶聯(lián)免疫吸附測定法對F2群體的檢測結(jié)果相比較，所有不一致的個(gè) 體之和與F2個(gè)體數(shù)的百分比即為交換率。
抗病基因連鎖標(biāo)記距離計(jì)算和圖譜建立利用M即Marker軟件，把F2群體 中抗病基因分子標(biāo)記和酶聯(lián)免疫吸附測定法對F2群體的檢測結(jié)果都換算成A=l (與P1—致)、B=2 (與P2—致)、0=-(模糊不清的條帶)，用軟件處理數(shù)據(jù)， 得出抗病基因與連鎖標(biāo)記間的距離，根據(jù)數(shù)據(jù)形成的圖譜如圖2。
結(jié)果
利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，篩選出的抗病基因的分子標(biāo)記引物E1M1 (E+CC) M1(M+CTT)和E2(E+CA)M2(M+CAA)對Pl、 P2和F2群體進(jìn)行標(biāo)記，引物E1M1的 抗病基因連鎖標(biāo)記交換率為18.33% ，引物E2M2的抗病基因連鎖標(biāo)記交換率為 22. 78%。利用M即Marker軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，由圖2可直觀地看出，抗蕪菁花葉 病毒滬l株系的基因TuR與引物EccMctt連鎖標(biāo)記間的距離為23. 7 cM(厘摩爾)， 抗病基因TuR與引物EcaMcaa連鎖標(biāo)記間的距離為29. 3cM。
權(quán)利要求
1、一種不結(jié)球白菜抗蕪菁花葉病毒基因的分子標(biāo)記方法，其特征在于，包括步驟如下①抗感蕪菁花葉病毒的不結(jié)白菜親本材料的篩選；②不結(jié)球白菜材料的栽培；③抗感親本材料的雜交和子一代F1自交獲得子二代F2群體，其中對抗性親本為母本P1，感病親本為父本P2；④蕪菁花葉病毒在不結(jié)球白菜上的接種和檢測；⑤不結(jié)球白菜材料的DNA提??；⑥不結(jié)球白菜抗蕪菁花葉病毒的抗感池建立，即建立抗病DNA池RP和感病DNA池SP；⑦抗病基因的分子標(biāo)記篩選；⑧抗病基因連鎖標(biāo)記交換率計(jì)算；⑨抗病基因連鎖標(biāo)記距離計(jì)算和圖譜建立；其中所述抗病基因的分子標(biāo)記篩選，具體為利用分子標(biāo)記技術(shù)，對P1、P2、F1、RP和SP進(jìn)行標(biāo)記，針對抗病顯性基因，篩選出P1、F1、RP有條帶且P2、SP無條帶的標(biāo)記引物，再把這些引物用于標(biāo)記P1、P2、F1、RP、SP和抗感病池中的F2個(gè)體，篩選出P1、F1、RP和抗病池F2個(gè)體有條帶且P2、SP和感病池F2個(gè)體無條帶的標(biāo)記，即為抗病顯性基因分子標(biāo)記；針對抗病隱性基因，篩選出P2、SP有條帶且P1、F1、RP無帶的標(biāo)記引物，再把這些引物用于標(biāo)記P1、P2、F1、RP、SP和抗感病池中的F2個(gè)體，篩選出P2、SP和感病池F2個(gè)體有條帶且P1、F1、RP和抗病池F2個(gè)體無條帶的標(biāo)記，即為抗病隱性基因分子標(biāo)記；所述抗病基因連鎖標(biāo)記交換率計(jì)算，具體為利用抗病基因分子標(biāo)記的對P1、P2和F2群體進(jìn)行標(biāo)記，統(tǒng)計(jì)每個(gè)F2個(gè)體的抗病基因分子標(biāo)記的情況，再與酶聯(lián)免疫吸附測定法對F2群體的檢測結(jié)果相比較，所有不一致的個(gè)體之和與F2個(gè)體數(shù)的百分比即為交換率；所述抗病基因連鎖標(biāo)記距離計(jì)算和圖譜建立，具體為把F2群體中抗病基因分子標(biāo)記和酶聯(lián)免疫吸附測定法對F2群體的檢測結(jié)果進(jìn)行處理，得出抗病基因與連鎖標(biāo)記間的距離，形成和輸出圖譜。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的不結(jié)球白菜抗芫菁花葉病毒基因的分子標(biāo)記方法， 其特征是，所述抗感蕪菁花葉病毒的不結(jié)白菜親本材料的篩選，具體為把從不 結(jié)白菜育種單位得到的高度抗和高度感蕪菁花葉病毒的多份材料，通過比較，篩選出親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的抗病和感病材料用于研究。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的不結(jié)球白菜抗蕪菁花葉病毒基因的分子標(biāo)記方法， 其特征是，所述蕪菁花葉病毒在不結(jié)球白菜上的接種和檢測，具體為索取到蕪 菁花葉病毒毒源后，先進(jìn)行增殖，然后用緩沖液稀釋病菌液，把金剛砂放入病菌 液中，用紗布蘸取摩擦葉片表面，再用高壓水沖壓葉片表面，完成接種；檢測采 用酶聯(lián)免疫吸附測定法，剪取少量葉片研碎，放入檢測試劑中，凡是呈現(xiàn)陰性為 無病毒，呈現(xiàn)陽性的為有病毒。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的不結(jié)球白菜抗蕪菁花葉病毒基因的分子標(biāo)記方法， 其特征是，所述不結(jié)球白菜材料的DNA提取，是指選取不結(jié)球白菜2-3葉期的 一片真葉，利用CTAB法提取DNA， 4'C保存?zhèn)溆谩?br> 5、 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的不結(jié)球白菜抗蕪菁花葉病毒基因的分子標(biāo)記 方法，其特征是，所述不結(jié)球白菜材料的DNA提取，具體步驟為① 葉片清洗用純凈水把剪取的葉片洗干凈；② 葉片研磨冷凍，加入液氮，研磨，轉(zhuǎn)入1.5或2ml離心管；③ CTAB液提取加入6(TC預(yù)熱的CTAB提取液500叱，6(TC水浴30-60分鐘， 每10分鐘混勻一次；其中CTAB提取液，其配備為稱取CTAB 20g和氯化鈉81. 9g 溶解于100 ml蒸餾水中，加入0. 5mol *L—1的EDTA 40ml和lmol 'L—1的Tris-HC1 lOOml，最后用蒸餾水定容至lOOOml，使用前按體積100: 1加入巰基乙醇；④ 去蛋白力B-2(TC冰浴的酚、氯仿和異戊醇混合液500叱混勻，4'C條件下 12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液；其中酚、氯仿和異戊醇混合液，其配備為 先吸取體積比為24份的氯仿和1份的異戊醇，制成氯仿異戊醇混合液，再與25 份的酚混合待用； 沉淀力i]-2CTC冰浴的異丙醇500ul，混勻沉淀30分鐘以上，4。C條件下 8000轉(zhuǎn)離心10分鐘，去上清液，晾干；⑥去RNA:加RNA酶300叱，37。C消化30分鐘；其中RNA酶的制備為先配制TE緩沖液，吸取0. 5mo1 L-1的EDTA 0. 2ml和lmol L—1的Tris-HCl lml， 用蒸餾水定容至100ml，再按體積比為993: 7加入10g L-1的■酶;⑦ 二次去蛋白力n-2(TC冰浴的氯仿異戊醇混合液300A混勻，4'C條件下 12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液；⑧ 去離子力卩-2(TC冰浴的7. 5mo1 !/'醋酸銨100叱混勻，(TC冰浴20分鐘， 4'C條件下10000轉(zhuǎn)離心20分鐘，取上清液；⑨ DNA沉淀力卩-20。C冰浴的無水乙醇900叱，(TC冰浴20分鐘，4'C條件下 8000轉(zhuǎn)離心20分鐘，去上清液，獲得DNA沉淀；⑩ DNA洗滌對DNA沉淀用-20 °C冰浴的70%乙醇洗兩遍，晾干； 溶解加TE溶解和稀釋，DNA濃度稀釋至50-250ng W/1，放4。C冰箱保存。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的不結(jié)球白菜抗蕪菁花葉病毒基因的分子標(biāo)記方法， 其特征是，所述抗病基因的分子標(biāo)記篩選，其中的分子標(biāo)記技術(shù)包括AFLP、 SSR、 SAMPL、 SRAP、 ISSR、 RAPD、 RFLP、 TRAP、 SNP、 SCAR、 CAPS中一種。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的不結(jié)球白菜抗蕪菁花葉病毒基因的分子標(biāo)記方法， 其特征是，所述AFLP分子標(biāo)記，具體為① DNA的酶切-連接采用26PL反應(yīng)體系，分成兩步，13. 5叱酶切反應(yīng)體系 包括0. 24U的EcoRI酶、1. 35叱緩沖液和100ng的DNA，在37'C水浴6小時(shí)； 連接反應(yīng)體系包括13. 5叱酶切液、2. 5pmo1的EcoRI接頭、25pmo1的Msel接頭、 0. 5U的T4-DNA連接酶、2Mmo1的ATP和2. 6叱的緩沖液，在室溫下過夜，產(chǎn)物 稀釋1倍，-2(TC保存；② 預(yù)擴(kuò)增采用10叱反應(yīng)體系進(jìn)行AFLP預(yù)擴(kuò)增2.5醒ol L_1 MgCl2， 0. 2隱o1 L_1dNTPs， 60ng的預(yù)擴(kuò)引物，0. 3 U Taq聚合酶，l叱10XPCRBuffer， 2.0叱酶切連接產(chǎn)物，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍，-20^保存。預(yù)擴(kuò)引物為兩個(gè)，序列是EOO 5'-GACTGCGTACCAATTC-3'M00 5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3' PCR擴(kuò)增程序采用94。C預(yù)變性2分鐘；94。C變性30秒，56。C復(fù)性30秒，72 'C延伸60秒，共24個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸30分鐘；③ 選擇性擴(kuò)增采用20PL反應(yīng)體系，2. 5畫1 'L—1 MgCl" 0. 2mmo1 'L—MNTPs， 100ng引物，1.5UTaq聚合酶，2^L 10XPCRBuffer (緩沖液)，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物， 擴(kuò)增產(chǎn)物與上樣緩沖液1:0.5體積混合變性，_4°0保存待電泳，其中上樣緩沖液 組成為甲酰胺98ml、 0. 5M的乙二胺四乙酸2ml、溴酚藍(lán)0. 25g、 二甲苯腈0. 25g; 選擴(kuò)引物為EcoRI和Msel引物組合，序列是E+2個(gè)選擇性堿基M+3個(gè)選擇性堿基PCR擴(kuò)增程序采用94。C預(yù)變性2分鐘；94。C變性30秒，65-56。C復(fù)性30秒， 每個(gè)循環(huán)降低O. 7'C， 72。C延伸60秒，共12個(gè)循環(huán)；94'C變性30秒，56'C復(fù) 性30秒，72。C延伸60秒，共24個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸30分鐘； 電泳通過6%的變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進(jìn)行分離，擴(kuò)增產(chǎn)物吸取 5A點(diǎn)樣后，在50W的恒功率下電泳；⑤銀染顯色。
8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的不結(jié)球白菜抗蕪菁花葉病毒基因的分子標(biāo)記方法，其特征是，所述銀染顯色，具體為① 固定將帶膠的玻璃板放入盛有2 L新配制的0. 5%的冰醋酸和10%無水 乙醇混合液的固定盒中，在搖床上輕搖20分鐘，直至膠面上變性劑顏色褪掉；② 水洗放到盛有蒸餾水的水洗盒中，輕搖3分鐘；③ 銀染放入盛有2L 0.2%的硝酸銀染色液的染色盒中，輕搖30分鐘； 再水洗從染色盒中取出膠板，放到水洗盒中清洗5-10秒；⑤ 顯影迅速將膠板放入2 L 1.5%氫氧化鈉和0.5%甲醛的顯影液中顯影， 直至出現(xiàn)清晰的條帶；⑥ 定影2 L 0.75%無水碳酸鈉定影液定影；⑦ 取出膠板，清水沖洗，銀染結(jié)束。
全文摘要
一種不結(jié)球白菜抗蕪菁花葉病毒基因的分子標(biāo)記方法，包括抗感蕪菁花葉病毒的不結(jié)白菜親本材料的篩選和栽培、親本雜交和F1自交、蕪菁花葉病毒的接種和檢測、不結(jié)球白菜材料的DNA提取和抗感池建立、抗病基因的分子標(biāo)記篩選、抗病基因連鎖標(biāo)記交換率和距離的計(jì)算以及抗病基因連鎖標(biāo)記圖譜的建立等。其中分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于對不結(jié)白菜抗感蕪菁花葉病毒的親本篩選和抗病基因連鎖基因的標(biāo)記，不同的分子標(biāo)記有不同的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序。本發(fā)明構(gòu)建了以不結(jié)球白菜為材料的抗蕪菁花葉病毒基因的分子標(biāo)記程序和體系，為不結(jié)球白菜抗病基因在染色體上的定位、抗病基因克隆和抗病分子輔助育種研究提供了依據(jù)。
文檔編號(hào)G01N21/77GK101392293SQ20081020042
公開日2009年3月25日 申請日期2008年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月25日
發(fā)明者楊 劉, 莊天明, 王新華, 陳火英 申請人:上海交通大學(xué)